重組豬抑制素的高密度發(fā)酵生產(chǎn)條件優(yōu)化

李輝　翟穎超　施振旦

摘要： 抑制素（INH）是性腺組織分泌的一種糖蛋白，可通過抑制促卵泡素分泌和性腺組織發(fā)育，在動物繁殖活動中起著重要的調(diào)控作用。通過對INH α亞基免疫，中和動物體內(nèi)的INH，可解除INH對動物繁殖活動的抑制作用，從而提高動物的繁殖力。為獲得大量重組的INH α亞基蛋白，滿足生產(chǎn)的需要，本研究對發(fā)酵罐高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行探索，并分別對發(fā)酵培養(yǎng)基的類型、乳糖誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，采用TB培養(yǎng)基發(fā)酵至20 h，菌體D600 nm值達(dá)到最大，為22 84，菌體總濕質(zhì)量為25 48 g/L，顯著高于其他2種培養(yǎng)基，綜合比較細(xì)菌生長趨勢、菌體總濕質(zhì)量以及培養(yǎng)基成本等因素，TB培養(yǎng)基較適用于重組INH的發(fā)酵罐生產(chǎn)；終濃度為10 g/L的乳糖誘導(dǎo)5 h可達(dá)到最高蛋白表達(dá)量，占菌體總蛋白的50%以上，發(fā)酵結(jié)束時D600 nm值達(dá)到36，細(xì)菌總濕質(zhì)量達(dá)到28 66 g/L。

關(guān)鍵詞： 抑制素；高密度發(fā)酵；乳糖誘導(dǎo)；發(fā)酵罐

中圖分類號： TQ920 6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0207-04

抑制素（inhibin，INH）是由性腺組織（卵巢、睪丸）分泌的糖蛋白激素，由α、β亞基通過二硫鍵連接形成異源二聚體 [1-2]。其中α亞基為INH獨(dú)有，β亞基則與激活素（activin）共用，2個β亞基通過二硫鍵組成同源二聚體，即為activin [2- 3]。INH具有抑制促卵泡素（FSH）分泌的功能 [4]，還具有直接抑制性腺發(fā)育及其功能的作用 [5]。因此，主動或被動免疫INH α亞基，中和動物體內(nèi)INH的生物活性，可促進(jìn)垂體分泌FSH，解除INH對性腺功能的抑制，最終緩解INH對動物生殖活動的抑制作用，促進(jìn)動物繁殖活動。前期研究證實(shí)，主動或被動免疫INH α亞基可以顯著提高羊、豬、牛、水牛等動物的發(fā)情表現(xiàn)、排卵數(shù)、卵子質(zhì)量、受胎率、產(chǎn)仔數(shù) [6-10]。對蛋雞免疫也起到類似作用，主要表現(xiàn)在顯著提高其產(chǎn)蛋率 [11]。對公畜進(jìn)行INH α亞基免疫同樣會產(chǎn)生積極作用，主要表現(xiàn)在性成熟提前、睪丸質(zhì)量和體積增加、精子產(chǎn)生量增加和質(zhì)量提高等 [12- 13]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫INH α亞基對夏季高溫應(yīng)激導(dǎo)致的母畜乏情和公畜精子質(zhì)量下降、母畜產(chǎn)后乏情以及提高種畜的使用年限等具有顯著效果 [12]。綜上，筆者認(rèn)為重組INH在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有較廣泛的應(yīng)用前景，并蘊(yùn)藏著可觀的商業(yè)價值。

目前所用的INH已經(jīng)由搖瓶培養(yǎng)原核表達(dá)的重組INH全面代替成本較高的人工化學(xué)合成的INH。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，搖瓶培養(yǎng)效率太低，不能滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)中的巨大需求。為提高生產(chǎn)效率，筆者首次引入發(fā)酵工業(yè)中的高密度發(fā)酵（high cell-density fermentation，HCDF）工藝。高密度發(fā)酵是應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備來提高菌體生物量和目標(biāo)產(chǎn)物時空產(chǎn)率的發(fā)酵技術(shù)。通過優(yōu)化發(fā)酵過程中的多個相關(guān)因素，可以提高菌體數(shù)量和單細(xì)菌內(nèi)蛋白表達(dá)量，最終達(dá)到提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的目的 [14- 15]。目前，大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)中 [16-21]，并取得了較好效果。然而，當(dāng)前對于重組豬INH α亞基的大腸桿菌高密度發(fā)酵研究較少，無可以直接借鑒的經(jīng)驗。本研究對發(fā)酵培養(yǎng)基類型、乳糖誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間進(jìn)行探索，旨在為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 菌株、試劑及主要儀器

表達(dá)豬INH α亞基的工程菌BL21（DE3）/pRSET-INH菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗室構(gòu)建并保存。胰蛋白胨、酵母粉購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素購自美國Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。種子培養(yǎng)基為LB，發(fā)酵培養(yǎng)基共3種，分別為TB培養(yǎng)基（胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO4 231 g/L，K2HPO4 12 54 g/L，甘油 4 mL/L）、組合培養(yǎng)基[葡萄糖2 g/L，胰蛋白胨 8 g/L，酵母粉 12 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO4 4 g/L，檸檬酸鈉0 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 18 g/L，CaCl2·2H2O 0 1 g/L，H3BO3 0 06 g/L，MnSO4 0 12 g/L，CuCl2·2H2O 0 01 g/L， Na2MoO4·2H2O 0 1 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0 2 g/L，ZnCl2· 7H2O 0 02 g/L]、M9培養(yǎng)基（葡萄糖 4 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 0 4 g/L，NH4Cl 1 g/L，CaCl2 002 g/L，NaCl 0 5 g/L，Na2HPO4 12 8 g/L）。 補(bǔ)料培養(yǎng)基含大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏15 g/L，MnSO4 25 mg/L，MgSO4 5 g/L，NH4Cl 15 g/L。種子培養(yǎng)基在使用前加入氨芐青霉素至終濃度為60 g/L。水平恒溫?fù)u床（德國Therma公司）；20 L 全自動發(fā)酵罐系統(tǒng)（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司）；蛋白質(zhì)垂直電泳系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；分光光度計（德國Eppendorf公司）。

1 2 方法

1 2 1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng) 將凍存于-80 ℃的表達(dá)菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)1 d，挑取單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 230 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后，按1 ∶ 100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)10 h作為發(fā)酵種子液。

1 2 2 發(fā)酵基本條件 發(fā)酵罐在使用前按照標(biāo)準(zhǔn)流程（過濾器消毒-部分管路消毒-空罐消毒）進(jìn)行消毒滅菌處理。向滅菌后的發(fā)酵罐加入發(fā)酵罐總體積4/5的培養(yǎng)基（即15 L左右，但考慮到實(shí)消時會有23 L蒸餾水進(jìn)入培養(yǎng)基造成培養(yǎng)基稀釋，所以在配制時取15 L的培養(yǎng)基，加入12 L水，使發(fā)酵培養(yǎng)基初始濃度略高），并進(jìn)行實(shí)效。實(shí)效結(jié)束，將培養(yǎng)基溫度降至37 ℃、罐壓降至0 MPa，打開加料口，在火焰下灌入無菌氨芐青霉素至終濃度為600 mg/L，同時按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并添加2%的有機(jī)硅消泡劑。關(guān)閉加料口開始發(fā)酵。發(fā)酵時，溫度設(shè)定為37 ℃，攪拌速度設(shè)定為 200 r/min，罐壓為0 05 MPa，通風(fēng)控制在11 7 L/min。通過加氨水和稀鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，加入的氨水可以作為氮源供細(xì)菌利用。