竹柏葉部真菌性病害的病原鑒定

周穎　張艷明　江潔等

摘要： 通過對竹柏4種葉部真菌性病害進(jìn)行病原鑒定，以期為竹柏的病害防治工作提供一定的參考依據(jù)。從廣西南寧市良鳳江國家森林公園苗圃基地、南寧市林業(yè)科學(xué)研究所標(biāo)本園、博白縣林業(yè)科學(xué)研究所、博白林場分別采集竹柏病葉標(biāo)本，進(jìn)行病原菌的分離和致病性測定，觀察并描述病原菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征，并通過rDNA-ITS PCR序列測定以確定病原菌。根據(jù)形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析將病害鑒定為藻斑?。ㄖ虏【鸀镃ephaleuros virescens Kunze）、炭疽?。ㄖ虏【鸀镃olletotrichum gloeosporioides）、葉尖枯?。ㄖ虏【鸀镻estalotiopsis longisetula）及葉枯?。ㄖ虏【鸀锳lternaria tenuissima）。前2種病害為竹柏上已發(fā)生的病害，葉尖枯病、葉枯病為竹柏上發(fā)生的新病害。

關(guān)鍵詞： 竹柏；葉部病害；病原菌；真菌；鑒定

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0125-03

竹柏（Podocarpus nagi）屬羅漢松科羅漢松屬竹柏組（Podocarpus Sect. Nageia Endl.） [1]。竹柏葉面光澤，形態(tài)寧靜雅致，又是四季常青的樹種，因而常作為常綠觀賞樹種、行道樹以及庭院綠化美化的良好樹種 [2]。因其材質(zhì)細(xì)致均勻、硬度中等，也可供建筑、家具、文具、工藝等用材，其種子可榨油并可食用或工業(yè)用 [3]。因此，作為一種集觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值于一身的樹種，依托竹柏而形成的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景可觀。但是近年來，隨著竹柏的種植面積不斷擴(kuò)大，竹柏真菌性病害日趨嚴(yán)重，已成為阻礙竹柏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大重要因素，給竹柏生產(chǎn)帶來了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對造成竹柏真菌性病害的病原進(jìn)行鑒定，明確其病原菌種類，可為下一步防控竹柏真菌性病害打下基礎(chǔ)，也對更好地保護(hù)和利用竹柏這一珍貴樹種有積極意義。迄今為止，已報(bào)道的竹柏病害主要有炭疽病、葉枯病、藻斑病、斑枯病、葉尖枯、褐斑病、煤煙病等。段定仁等在廣州省龍門縣進(jìn)行林木病蟲害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)竹柏上有以下病害發(fā)生：炭疽?。ㄖ虏【鸀镃olletotrichum sp.）、藻斑病（致病菌為Cephaleuros virescens Kunze）、葉枯?。ㄖ虏【鸀镻estalotia sp.） [4]。廣西林業(yè)局森林病蟲普查辦公室組織人員普查廣西竹柏病害，報(bào)道竹柏炭疽?。ㄖ虏【鸀镚loeosporium sp.或Colletotrichum sp.）、葉尖枯?。ㄖ虏【鸀镻hyllosticta sp.）、葉尖枯?。ㄖ虏【鸀镻estalotia sp.）、葉尖枯?。ㄖ虏【鸀镸acrophoma sp.）、葉枯病（致病菌為Phyllosticta sp.）、藻斑?。ㄖ虏【鸀镃ephaleuros virescens Kunze）、葉枯?。ㄖ虏【鸀镾phaerulina sp.）、葉枯病（致病菌為Guignardia sp.）、褐斑病（致病菌為Phoma sp.）、煤煙?。ㄖ虏【鸀镃apnodium sp.） [5]。但上述報(bào)道內(nèi)容也只簡單介紹了竹柏的病害種類、病原名稱及其分布情況，對病害的癥狀、發(fā)生規(guī)律及防治方法等方面未進(jìn)行深入的研究。張中義等報(bào)道了Stagonospora luzulae（Westend.）Sacc.引起的竹柏斑枯病，簡要介紹了其發(fā)病期、分布情況等，并進(jìn)行了癥狀描述 [6]。周建良對竹柏炭疽病進(jìn)行調(diào)查并將其病原菌初步鑒定為膠孢炭疽菌 [2]，但該研究僅限于形態(tài)學(xué)鑒定，并未通過分子手段加以輔助鑒定。韋繼光等研究發(fā)現(xiàn)，竹柏葉片組織內(nèi)存在內(nèi)生擬盤多毛孢，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)生擬盤多毛孢在一定條件下也可轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡瓟M盤多毛孢，如受傷、接近衰亡且濕度很高等情況，從而導(dǎo)致竹柏出現(xiàn)葉斑病 [7]。隨著科技手段的不斷創(chuàng)新及新技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定已成為病原鑒定的一大重要手段，利用諸如rDNA-ITS 序列分析的分子鑒定手段與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法，使得病原菌的鑒定工作變得比以往更加精確而高效，也使得以往單純依靠形態(tài)學(xué)鑒定而造成的分類混亂等狀況得以改善。竹柏作為具有較高觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)效應(yīng)的珍貴樹種，近年來其病害種類逐漸增多，個別病害發(fā)生較為嚴(yán)重，已經(jīng)危害到了竹柏相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但近年來關(guān)于竹柏的病害研究相對較少，竹柏病害未引起研究者們的足夠重視。通過組織分離法分離竹柏受害葉片中的真菌，并測定其致病性，最后，結(jié)合形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析方法確定病原菌的分類地位，以期為竹柏葉部真菌性病害的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌菌株分別采用分離自廣西南寧市良鳳江國家森林公園苗圃基地、南寧市林業(yè)科學(xué)研究所標(biāo)本園、博白縣林業(yè)科學(xué)研究所、博白林場的竹柏病葉。供致病性測定的苗木取自廣西南寧市良鳳江國家森林公園苗圃基地。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，即PDA培養(yǎng)基，其制作方法參照方中達(dá)的《植病研究方法》中描述的PDA制作方法 [8]。主要試劑和儀器：新型植物基因組DNA提取試劑盒（Nuclean PlantGen DNA Kit 50）、2×ES Taq MasterMix（含染料），北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；真菌核糖體rDNA ITS的通用引物ITS 4和ITS 5；DM1000 DNA Marker；離心機(jī)、渦旋振蕩器、電泳儀、凝膠成像儀、PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定 （1）對不同癥狀的病害標(biāo)本進(jìn)行鏡檢，對于觀察不到病原菌的病葉可將其放入保濕器中保濕2～3 d后再鏡檢。（2）病原菌的分離：采用75%乙醇中浸泡10 s、0.1%的氯化汞溶液浸泡2 min、無菌水浸洗3次的消毒方法進(jìn)行病害標(biāo)本的組織分離。（3）致病性測定：采用菌餅活體接種方法，設(shè)葉片刺傷、無傷接種2種處理，空白對照組采用空白瓊脂塊接種。每個處理均接種20張健康葉片，于 25 ℃左右保濕培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察并記錄發(fā)病情況。對于發(fā)病的葉片，根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病部位進(jìn)行病原再分離。（4）病原菌形態(tài)觀察：將菌株轉(zhuǎn)接于PDA平板上，于 25 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～8 d，觀察并記錄菌落相態(tài)特征。采用插片法，待其產(chǎn)孢后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄其菌絲特征、分生孢子形態(tài)等，測量分生孢子的大小。

1.2.2 rDNA-ITS序列分析與鑒定 （1）DNA的提?。焊鶕?jù)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供的新型植物基因組DNA提取試劑盒使用方法提取病原菌的DNA。（2）rDNA-ITS PCR擴(kuò)增及程序：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×ES Taq MasterMix（5 U/μL） 25 μL，ITS 4 （4 μmol/L）2 μL，ITS 5 （4 μmol/L） 2 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，反應(yīng)總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 2 min。（3）電泳凝膠成像后，選取有條帶的PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。（4）登陸GenBank數(shù)據(jù)庫，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

通過鑒定，初步探明了4種竹柏葉部真菌性病害，分別是藻斑?。ㄖ虏【鸀镃ephaleuros virescens）、炭疽?。ㄖ虏【鸀镃olletotrichum gloeosporioides）、葉尖枯?。ㄖ虏【鸀镻estalotiopsis longisetula）及葉枯?。ㄖ虏【鸀锳lternaria tenuissima）。其中后2種病害為竹柏新病害。

2.1 藻斑病

藻斑病主要危害竹柏葉片。病斑圓形或橢圓形，中心部分呈灰白或黃褐色。葉病部粗糙，稍隆起，有時著生氈狀物。在顯微鏡下觀察該病病原菌，其孢子囊梗呈簇狀生長，基部緊挨在一起，上部分散開，不分枝。其頂端膨大成支持細(xì)胞，上生1至數(shù)個小梗，每個小梗頂端著生1個孢子囊，孢子囊呈圓形或橢圓形，直徑12.50～31.25 μm（圖1）。

2.2 炭疽病

2.2.1 田間危害癥狀 3個采集地點(diǎn)均有炭疽病發(fā)生，該病主要危害竹柏的葉片，一般從葉尖部、葉緣或葉子的中部發(fā)病。病斑呈褐色、灰褐色、灰色，其上密生有一些黑褐色或黑色的顆粒狀物，病健交界處明顯。根據(jù)病斑顏色，大致分為2類：（1）病斑褐色，受害葉片從病健交界處起，往病菌最初侵染部位的方向，往往會有長1 cm、顏色呈土褐色的條帶，該部位在濕度大的培養(yǎng)條件下會產(chǎn)生菊黃色的孢子堆，個別病斑上會有輪紋；（2）病斑灰色，病健交界處呈紫黑色或褐色，該類病斑一般出現(xiàn)在老葉或是成年竹柏葉片上。該病為害植株嚴(yán)重時，會導(dǎo)致整株葉片變枯，最終整棵植株死亡（圖2）。

2.2.2 致病性測定 葉片接種菌餅后，刺傷接種的葉片于第3天開始發(fā)病，第4天發(fā)病率達(dá)到100%。無傷接種的葉片于第5天也未見發(fā)病。空白對照組接種瓊脂塊葉片無任何癥狀。試驗(yàn)組葉片發(fā)病部位呈褐色，與田間發(fā)病部位癥狀一致。根據(jù)科赫氏法則，再次從致病性試驗(yàn)中的發(fā)病葉片分離該菌，回接到新鮮健康葉片后葉片發(fā)病，確定該菌為病原菌（圖3）。

2.2.3 病原鑒定 在PDA培養(yǎng)基平板上于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)該菌，其菌落為圓形，顏色為白色或灰白色，邊緣整齊，氣生菌絲絨毛狀。分生孢子長橢圓或橢圓形，無色，單胞，兩端鈍圓或1鈍1略尖，內(nèi)含1～2個油球，大小為（13.75～1875） μm×（3.75～6.25） μm。該病原菌分離率為66.7% 。經(jīng)測序，竹柏炭疽病病原菌 rDNA-ITS 片段長度為566 bp。將菌株的rDNA-ITS序列與NCBI中已有的相關(guān)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明竹柏炭疽病的病原菌與Colletotrichum gloeosporioides（GenBank No.KF938897.1）的同源性最高，為99%，此結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。根據(jù)其形態(tài)特征及rDNA-ITS序列分析，鑒定該病原菌為Colletotrichum gloeosporioides（圖4）。

2.3 葉尖枯病

2.3.1 田間癥狀 在良鳳江國家森林公園苗圃基地、博白林科所2個采集地點(diǎn)均有葉尖枯病發(fā)生，擬盤多毛孢引起的竹柏葉尖枯病的癥狀和炭疽菌引起的竹柏炭疽病的第1類癥狀相似，常常從葉尖開始發(fā)病，沿著葉柄方向不斷延伸擴(kuò)展。病斑為黃褐色，其正反面均生有一些黑褐色的顆粒狀物，沒有輪紋。從發(fā)病較早的部位到剛發(fā)病的部位，顏色逐級加深，即黃褐色、褐色、深褐色；病健交界處明顯，呈褐色（圖5）。

2.3.2 致病性測定 葉片接種菌餅后，刺傷接種的葉片24 h內(nèi)就開始發(fā)病，第3天發(fā)病率達(dá)到100%。無傷接種的葉片未見發(fā)病?？瞻讓φ战M接種瓊脂塊葉片無任何癥狀。試驗(yàn)組葉片發(fā)病部位呈褐色，與田間發(fā)病部位癥狀一致。根據(jù)科赫氏法則，再次從致病性試驗(yàn)中的發(fā)病葉片分離該菌，回接到新鮮健康葉片后葉片發(fā)病，確定該菌為病原菌（圖6）。

2.3.3 病原鑒定 在PDA培養(yǎng)基平板上于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)該菌，其菌落呈較為明顯的輪紋狀，菌絲為白色或無色，分生孢子紡錘形，具4個隔膜，兩端細(xì)，中間3個細(xì)胞黑褐色至黑 色，兩端細(xì)胞無色，分生孢子大小為（18.75～25.00） μm× （5.00～7.50） μm，頂端細(xì)胞上生有2～3根附屬絲。該病原菌的分離率為73.3%。經(jīng)測序，竹柏葉尖枯病病原菌 rDNA-ITS 片段長度為546 bp。將菌株的rDNA-ITS序列與NCBI中已有的相關(guān)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明其與Pestalotiopsis longisetula（GenBank 登錄號AF409971.1）的同源性最高，為99%，此結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。根據(jù)rDNA-ITS序列分析，鑒定該病病原菌為Pestalotiopsis longisetula（圖7）。

2.4 葉枯病

2.4.1 田間癥狀 在良鳳江國家森林公園苗圃基地采集點(diǎn)有葉枯病發(fā)生，該病菌可從葉尖、葉的中部侵染發(fā)病。病斑紅褐色或黃褐色， 病健交界處較為明顯；病斑上干凈光滑；發(fā)病部位略有皺縮，導(dǎo)致葉片略扭曲（圖8）。

開始發(fā)病，第4天發(fā)病率達(dá)到100%。無傷接種的葉片未見發(fā)病?？瞻讓φ战M接種瓊脂塊葉片無任何癥狀。試驗(yàn)組葉片發(fā)病部位呈褐色，與田間發(fā)病部位癥狀一致。根據(jù)科赫氏法則，再次從致病性試驗(yàn)中的發(fā)病葉片分離該菌，回接到新鮮健康葉片后葉片發(fā)病。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，確定該菌為病原菌（圖9）。

[FK（W11][TPZY99.TIF]

2.4.3 病原鑒定 在PDA培養(yǎng)基平板上于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)該菌，其菌落青灰色至灰褐色，背面褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，分生孢子倒梨形或倒棒狀，黃褐色，具橫隔2～7個，縱隔0～2個，分隔處略有縊縮，尤其是孢身中部的橫隔明顯較粗厚。分生孢子大小為（25～40） μm×（6.25～12.50） μm，該病原菌的分離率為65%。經(jīng)測序，竹柏葉枯病病原菌 rDNA-ITS 片段長度為550 bp。將菌株的rDNA-ITS序列與NCBI中已有的相關(guān)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明其與Alternaria tenuissima（GenBank 登錄號EF031053.1）的同源性最高，為99%，此結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。根據(jù)形態(tài)鑒定結(jié)果與rDNA-ITS序列分析，鑒定該病病原菌為Alternaria tenuissima（圖10）。

[FK（W7][TPZY110.TIF]

3 討論

本研究鑒定了竹柏上發(fā)生的4種葉部真菌性病害，初步探明了引起竹柏藻斑病、炭疽病、葉尖枯病、葉枯病的病原分別為Cephaleuros virescens Kunze、Colletotrichum gloeosporioides、Pestalotiopsis longisetula、Alternaria tenuissima。其中，竹柏藻斑病、炭疽病的病原鑒定結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。此外，由于

試驗(yàn)條件、技術(shù)等限制因素，竹柏病害的早期研究多停留在病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定，所以，大多研究只能將病原鑒定到屬。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子技術(shù)已成為病原鑒定的重要手段之一。目前，采用形態(tài)學(xué)加分子生物學(xué)的方法鑒定病原菌的模式已被廣大研究者所采用，較之傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法，以分子生物學(xué)方法作為輔助鑒定的手段，避免了在研究過程中因病原菌的形態(tài)特征易受環(huán)境條件或其他人為干擾而發(fā)生改變而使鑒定準(zhǔn)確度降低的問題，使所得結(jié)果更為可靠。本研究在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，以rDNA-ITS序列分析作為輔助鑒定手段，將竹柏葉尖枯病和葉枯病的病原菌初步鑒定到種，這提高了鑒定結(jié)果的可信度。

Alternaria sp.、Pestalotiopsis sp.是自然界中較為常見的病原菌，進(jìn)一步深入研究病原菌的生物學(xué)特性、病害流行規(guī)律、防控技術(shù)等很有必要，這對竹柏病害的防控具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，引起竹柏藻斑病、炭疽病、葉尖枯病、葉枯病的病原菌分別為Cephaleuros virescens、Colletotrichum gloeosporioides、Pestalotiopsis longisetula、Alternaria tenuissima。其中，葉尖枯病、葉枯病為竹柏上新發(fā)現(xiàn)的病害，有關(guān)這2種病害的發(fā)生流行規(guī)律、侵染循環(huán)及其相關(guān)防治方法等方面的情況有待進(jìn)一步研究。

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