黃芪注射液對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

梅莎莎，宋恩峰，項　瓊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科，武漢430060）

黃芪注射液對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

梅莎莎，宋恩峰，項瓊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科，武漢430060）

［目的］研究黃芪注射液對高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）凋亡的影響。［方法］傳代培養(yǎng)人近曲腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，將細(xì)胞分為5組：低糖對照組、高糖組、高糖+不同濃度黃芪注射液組（2、20、200 μg/mL），每組設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24、48、72 h，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。［結(jié)果］24、48、72 h，低糖對照組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組（P＜0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，黃芪干預(yù)組200和20 μg/mL細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組（P＜0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)48和72 h，黃芪注射液干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組（P＜0.05）。黃芪注射液干預(yù)組各組之間凋亡率比較差異也都有顯著性（P＜0.05），其干預(yù)作用呈劑量依賴性。［結(jié)論］黃芪注射液能抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，有助于糖尿病腎病的治療。

糖尿病腎??；腎小管上皮細(xì)胞；黃芪注射液；細(xì)胞凋亡

近年來糖尿病腎?。―N）發(fā)病呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康，其發(fā)病機制仍不十分清楚。有研究表明腎小管損傷在糖尿病腎病發(fā)病早期就已經(jīng)存在，腎小管損傷的其中一種表現(xiàn)形式為腎小管上皮細(xì)胞凋亡。高血糖在糖尿病腎病的發(fā)病機制中可作為獨立危險因子，對腎間質(zhì)及腎小管都有損傷作用，可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的增加。腎小管上皮細(xì)胞的凋亡在糖尿病腎病早期就已經(jīng)發(fā)生，過度的凋亡可導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)和功能損害，最終導(dǎo)致腎功能衰竭，因此腎小管上皮細(xì)胞凋亡與糖尿病腎病發(fā)病關(guān)系密切。黃芪注射液是黃芪植物中提煉出來的有效成分，對腎臟組織有保護作用，但是否對腎小管上皮細(xì)胞凋亡有影響仍不清楚。本實驗通過高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，探討黃芪注射液對細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料人近曲腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2），武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科實驗室惠贈；黃芪注射液，哈爾濱圣泰制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z23020820；DMEM高糖、低糖培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；0.25%胰酶溶液、青-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS），吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；DMSO，Sigma公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒，Clontech公司；流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于濃度為10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM低糖完全培養(yǎng)基。放入37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察HK-2細(xì)胞成鵝卵石或鋪路石樣排列，并鋪滿瓶底面積約80%～90%時可進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代比例為1∶2～1∶4，每2～3 d傳代1次，取第7代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2實驗分組與處理待細(xì)胞融合至80%，將培養(yǎng)基換成無血清DMEM低糖培養(yǎng)基同步化24 h后，棄去無血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為5組：1）低糖對照組（A組）：低糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖5.5 mmol/L。2）高糖組（B組）：高糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖25 mmol/L。3）高糖+黃芪注射液小劑量組（C組）：高糖培養(yǎng)基+2 μg/mL黃芪注射液。4）高糖+黃芪注射液中劑量組（D組）：高糖培養(yǎng)基+20 μg/mL黃芪注射液。5）高糖+黃芪注射液大劑量組（E組）：高糖培養(yǎng)基+ 200 μg/mL黃芪注射液，每組設(shè)3個復(fù)孔。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液用于后續(xù)實驗。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測定HK-2細(xì)胞凋亡率將對數(shù)期生長細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至70%～80%時，將培養(yǎng)基換成無血清DMEM低糖培養(yǎng)基同步化24 h后，將細(xì)胞按上述分組，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行細(xì)胞收集。吸取細(xì)胞上清液至15 mL離心管中。用PBS溶液清洗貼壁細(xì)胞，并將PBS吸取至離心管中。用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。1 000 rpm離心10 min，棄上清液，用4℃預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105～1×106/mL，在重懸液中依次加入5 μL Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL Propidium Iodide（PI），混勻后避光在冰上孵育15min。在反應(yīng)管中加入400μL 1×Binding Buffer后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件處理。所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

黃芪注射液對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響。Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測顯示，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后，B組凋亡率明顯高于A組（P＜0.05），提示高糖有誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的作用；細(xì)胞培養(yǎng)24 h，E組和D組凋亡率明顯低于B組（P＜0.05），E組凋亡率明顯低于D和C組（P＜0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)48和72 h，C、D、E組凋亡率明顯低于B組（P＜0.05），且C、D、E 3組之間凋亡率比較差異也都有顯著性（P＜0.05），其凋亡率隨著黃芪注射液濃度的升高逐漸下降，提示黃芪注射液有抑制細(xì)胞凋亡的作用，并與濃度呈正比，呈劑量依賴性。見表1，圖1。

表1　不同濃度黃芪注射液對HK-2細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1Influence of cell apoptotic rates by different concentration of Astragalus injection in HK-2 cells

表1　不同濃度黃芪注射液對HK-2細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1Influence of cell apoptotic rates by different concentration of Astragalus injection in HK-2 cells

注：與B組比較，*P＜0.05；與E組比較，#P＜0.05；與D組比較，△P＜0.05。

分組A組B組C組D組E組HK-2細(xì)胞凋亡率（%）24 h48 h72 h 2.636 7±0.341 5*4.266 7±0.568 9*5.540 0±0.875 0* 12.703 3±0.847 218.543 3±0.728 921.360 0±0.547 4 11.923 3±0.850 5#14.976 7±0.613 3*#△18.080 0±0.278 4*#△11.030 0±0.696 3*#13.380 0±0.468 1*△14.553 3±0.611 7*#5.140 0±0.796 1*8.183 3±0.811 3*9.276 7±0.475 0*

3　討論

隨著現(xiàn)代生活水平的提高以及人口老齡化的趨勢，糖尿病發(fā)病率明顯升高，糖尿病腎病作為糖尿病的常見并發(fā)癥也逐漸引起人們的關(guān)注［1］。既往研究表明腎小球損傷是DN的主要發(fā)病機制，近年發(fā)現(xiàn)腎小管損傷可能早于腎小球損傷，在DN患者蛋白尿排泄率正常時可能就已經(jīng)發(fā)生了腎小管的損傷［2］。在糖尿病腎病發(fā)病過程中腎小管損傷的重要表現(xiàn)之一就是腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。有研究表明對DN患者取腎臟組織進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)腎小管及腎小球細(xì)胞都有明顯凋亡，腎小管的凋亡程度與糖尿病病程及低密度脂蛋白膽固醇有相關(guān)性［3］。

在糖尿病腎病發(fā)病過程中高血糖是一個重要的獨立危險因子，有研究證明長期高血糖誘發(fā)糖尿病腎病，從80年代開始的兩個研究—糖尿病前瞻性研究和糖尿病控制與并發(fā)癥實驗都得出結(jié)論：控制高血糖可以減少DN的發(fā)生［4-5］。高血糖也可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的增加。在糖尿病腎病的早期階段就發(fā)生了細(xì)胞凋亡，過度的凋亡可導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)和功能的損害，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。近年的研究表明細(xì)胞凋亡與糖尿病腎病的發(fā)病機制密切相關(guān)。有研究表明在高糖狀態(tài)下培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞及大鼠糖尿病體內(nèi)實驗中，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯增加，認(rèn)為細(xì)胞凋亡參與了DN的發(fā)病過程，這與本實驗高糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于低糖對照組相一致，但高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機制仍不明確，目前人們較為認(rèn)可的觀點有Toll樣受體途徑［6］，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑［7］，c-Jun氨基末端激酶途徑［8］，p38絲裂原活化蛋白激酶途徑［9］等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腎小管凋亡與糖尿病腎病發(fā)病關(guān)系密切外，還可引起腎臟缺血再灌注損傷，導(dǎo)致腎功能障礙［10-13］。其機制可能與腎缺血再灌注期間，叉頭框蛋白FOXO3a能激活Fas配體，協(xié)同JNK激活促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，加劇腎缺血再灌注損傷有關(guān)［14］。

研究表明中醫(yī)藥能降低糖尿病腎病患者血糖，減輕蛋白尿，保護腎功能及減輕并發(fā)癥等作用［15-17］。黃芪是補氣的傳統(tǒng)中藥，有益氣固表，托毒生肌，利水消腫等作用。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要治療糖尿病、慢性腎炎、冠心病、心力衰竭、腦梗死等。藥理研究表明黃芪有效成分能增加機體免疫力，清除體內(nèi)自由基，保護肝臟，抑制細(xì)胞凋亡［18-20］等作用，對人體多個系統(tǒng)都有影響。

黃芪注射液的有效成分有皂苷類、黃芪多糖及大量微量元素。黃芪注射液可用于治療病毒性心肌炎、心力衰竭、慢性肝炎、白細(xì)胞減少癥、血小板減少性紫癜、慢性腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病等。研究發(fā)現(xiàn)黃芪水煎劑能抑制腎缺血再灌注損傷大鼠腎小管細(xì)胞的凋亡，并呈劑量依賴性，其機制是通過促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)及抑制促凋亡基因的表達(dá)實現(xiàn)的［21］。黃芪甲苷孵育脂肪源性干細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡也有抑制作用，作用機制可能與增加胰島素樣生長因子1分泌，抑制caspase-3表達(dá)，上調(diào)Bcl-2水平有關(guān)［22］。

圖1　 24、48、72 h各組HK-2細(xì)胞凋亡情況Fig.1Apoptotic rates in different groups of HK-2 in 24，48 and 72 h

本實驗流式細(xì)胞檢測表明24、48、72 h，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于低糖對照組（P＜0.05），黃芪注射液干預(yù)組細(xì)胞凋亡率低于高糖組，但仍高于低糖對照組，且細(xì)胞凋亡率隨黃芪注射液的濃度升高而降低，提示黃芪注射液濃度和細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，有劑量依賴性。但黃芪注射液作為中藥提取物，其成分復(fù)雜，對HK-2細(xì)胞抗凋亡具體成分及作用機制并不十分清楚，還有待進(jìn)一步研究，為臨床治療糖尿病腎病提供依據(jù)。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Influence of Astragalus on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells

MEI Sha-sha，SONG En-feng，XIANG Qiong
（Department of Traditional Chinese Medicine，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China）

［Objective］To investigate the influence of Astragalus on cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells（HK-2）.［Methods］Human renal proximal tubular cells were cultured and divided into five groups：low glucose as control group，high glucose group，Astragalus pretreatment group with concentration of 2，20 and 200 μg/mL.Each group has three samples，cultured in 37℃incubator for 24，48 and 72 hours，and collected cells and cell supernatant fluid.Apoptosis rate was measured by flow cytometry.［Results］When cells were cultured 24，48 and 72 h，and the apoptosis rate of control group were significantly lower than high glucose group（P＜0.05）.When cells were cultured 24 h，the apoptosis rate of 200 and 20 μg/mL group significantly lower than high glucose group（P＜0.05）.When cells were cultured 48 and 72 h，the apoptosis rate of 200，20 and 2 μg/mL group significantly lower than high glucose group（P＜0.05）.The apoptosis were significant different between Astragalus injection groups（P＜0.05），and the effect of Astragalus were showed in dose-dependent manner.［Conclusion］Astragalus can suppress cell apoptosis induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells，which could be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy；renal tubular epithelial cell；Astragalus injection；cell apoptosis

R587.2

A

1672-1519（2015）10-0610-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.08

梅莎莎（1986-），女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事糖尿病腎病的中西醫(yī)結(jié)合治療研究。

宋恩峰，E-mail：songef@126.com。

（2015-05-20）