光甘草定羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其對(duì)透皮吸收的影響研究

葉柳青，王　艷，韓宛盈，周曉霞，馬宗武，崔廣智

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

光甘草定羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其對(duì)透皮吸收的影響研究

葉柳青，王艷，韓宛盈，周曉霞，馬宗武，崔廣智

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

［目的］優(yōu)化光甘草定（GLA）羥丙基-β-環(huán)糊精包合物（HP-β-CD）的制備工藝，并考察其對(duì)體外透皮吸收的影響。［方法］采用正交實(shí)驗(yàn)，考察物料比、包合溫度、包合時(shí)間對(duì)GLA包合率的影響。包合率為指標(biāo)篩選最佳制備工藝。用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行透皮吸收實(shí)驗(yàn)，研究HP-β-CD對(duì)GLA透皮吸收的影響。［結(jié)果］HP-β-CD包合GLA的優(yōu)化工藝是質(zhì)量倍數(shù)為15倍的HP-β-CD，40℃下包合1.5 h。光甘草定HP-β-CD包合物累積透過(guò)量高于光甘草定單體組。［結(jié)論］HP-β-CD能促進(jìn)光甘草定的經(jīng)皮滲透。

光甘草定；羥丙-β-環(huán)糊精；透皮吸收

光甘草定（GLA）為疏水性異黃酮類化合物，是光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中的特有成分［1］，具有廣泛的生物活性，如預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化［2］，抗炎［3］，抗骨質(zhì)疏松［4］，神經(jīng)保護(hù)作用［5］等。值得注意的是GLA可以抑制酪氨酸酶活性，阻礙皮膚的黑色素生成［3］，在化妝品領(lǐng)域被稱為“美白黃金”。但是GLA幾乎不溶于水，這就限制了其在外用制劑中的應(yīng)用。藥物經(jīng)環(huán)糊精包合后，再經(jīng)離體透皮吸收，藥物的累積透過(guò)量明顯增加［4］，其中羥丙基-β-環(huán)糊精包合物（HP-β-CD）能夠提高難溶物質(zhì)的溶解度，同時(shí)有利于提高包合物的穩(wěn)定性［6-7］。

本研究以HP-β-CD作為包合材料，制備GLA的HP-β-CD包合物（GLA-HP-β-CD），并考察HP-β-CD對(duì)GLA透皮吸收的影響。

1　儀器與試劑

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津），F(xiàn)A 1004型萬(wàn)分之一分析天平（上海精科天平），TBP6型改良Franz透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（上海諧凱），84-II型磁力恒溫?cái)嚢杵鳎ㄉ綎|甄城永興），KQ-300 B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器），LGJ-12型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興）。

GLA對(duì)照品（純度＞98%，中國(guó)藥品生物制品鑒定所），HP-β-CD（山東濱州智源生物），色譜純乙腈和甲醇（天津康科德），分析純乙醇、冰乙酸和氯化鈉（天津康科德），生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室自制），甘油、硬脂酸和單硬脂酸甘油酯（天津光復(fù)精細(xì)化工），昆明種實(shí)驗(yàn)小鼠［（20±3）g，北京華阜康］。

2　方法

2.1GLA含量測(cè)定方法的建立

2.1.1色譜條件色譜柱：Hypersil ODS（4.6 mm× 200 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1），流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，進(jìn)樣量固定為10 μL，柱溫：25℃［8］。

2.1.2對(duì)照品溶液制備稱取GLA對(duì)照品適量，以甲醇溶解，制得濃度為91.2 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3線性關(guān)系考察將對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋，得到一系列GLA溶液，按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，高相液相色譜法（HPLC）圖譜見(jiàn)圖1，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），在0.912～9.12 mg/L進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程=142 651.024 7X+ 25 286，r=0.999 4。

2.1.4精密度實(shí)驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，連續(xù)6次，吸取同一對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，連續(xù)6 d，記錄峰面積積分值，GLA質(zhì)量濃度的RSD分別為0.54%和0.28%，表明GLA的日內(nèi)和日間精密度均良好。

2.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一接收池中的GLA軟膏接受液6份，按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算得其質(zhì)量濃度的RSD為0.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)吸取上述同一對(duì)照品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、12 h按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算得其質(zhì)量濃度的RSD%為0.40%，表明GLA在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2GLA-HP-β-CD及其軟膏的制備

2.2.1GLA-HP-β-CD的制備以投料量比、包合溫度、包合時(shí)間為因素，包合率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交因素水平。見(jiàn)表1。

表1　因素水平表Tab.1 Factors and levels orthogonal table

按照上述因素水平表中投料比稱取相應(yīng)質(zhì)量的HP-β-CD和GLA，HP-β-CD加入適量蒸餾水中，按設(shè)置規(guī)定溫度及轉(zhuǎn)速磁力攪拌器，攪拌至溶解。GLA用少量無(wú)水乙醇溶解，逐滴加入HP-β-CD溶液中，繼續(xù)攪拌至規(guī)定時(shí)間得到包合物。將不同條件下制得的GLA-HP-β-CD置于冰箱中冷藏1 h，抽濾，濾液放入冰箱中冷藏24 h，真空冷凍干燥得發(fā)黃蓬松塊狀物，即得GLA-HP-β-CD［9-10］。

2.2.2GLA-HP-B-CD軟膏的制備按照如下表2中處方分別制備空白軟膏，GLA軟膏和GLA-HP-β-CD軟膏。

表2　不同GLA軟膏處方表Tab.2 Different prescription of glabridin ointments table

2.3GLA-HP-β-CD軟膏對(duì)經(jīng)皮吸收的影響

2.3.1離體鼠皮的制備取質(zhì)量（20±2）g的昆明種小鼠，脫去其腹部被毛，剪下腹部皮膚，除去粘連的脂肪組織，以生理鹽水為儲(chǔ)存液置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫?1］，臨用時(shí)吸干皮膚表面水分。

圖1　GLA對(duì)照品溶液（A）、GLA-HP-β-CD（B）、空白軟膏透皮吸收液（C）、GLA-HP-β-CD軟膏透皮接受液（D）的HPLC圖Fig.1HPLC chromatograms of glabridin reference substances solution（A），glabridin HP-β-CD solution（B），blank ointment sample solution（C），transdermal solution after application of glabridin HP-β-CD（D）

2.3.2實(shí)驗(yàn)方法處理好的鼠皮角質(zhì)層向上固定于Franz擴(kuò)散池上，接收池中加入30%的乙醇-生理鹽水溶液7.5 mL，使鼠皮內(nèi)層完全與接受液接觸，打開(kāi)透皮儀并設(shè)定恒溫37℃，保持恒定轉(zhuǎn)速200 r/min［12］。平衡1 h，排盡接收池內(nèi)的氣泡后給藥。擴(kuò)散池供給鼠皮面積上均勻涂上0.1 gGLA軟膏，每組平行3次，分別在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時(shí)吸取接收液1 mL，每次取樣后均補(bǔ)入相同體積的接收液［13］，按2.1.1方法進(jìn)樣分析。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1GLA的HPLC色譜結(jié)果GLA含量測(cè)定HPLC色譜圖，見(jiàn)圖1。

3.2GLA包合物含量測(cè)定精密稱取GLA-HP-BCD置于5 mL量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，超聲30 min，按照上述色譜條件，HPLC法測(cè)定峰面積，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值，帶入公式［14］。

GLA-HP-B-CD含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3Results of orthogonal test

表4　包合率方差分析Tab.4Analysis of variance for inclusion efficiency

由表3可知，各因素影響包合率的順序?yàn)锳＞C＞B。由表4可知，投料質(zhì)量比對(duì)包合率有顯著影響［15］。綜合以上數(shù)據(jù)得出最佳包合工藝為A1B1C1，即包合條件為GLA和HP-β-CD投料質(zhì)量比為1∶15，包合溫度為40℃，包合時(shí)間為1.5 h。

3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照上述最佳工藝條件，平行3組實(shí)驗(yàn)，得到的包合率分別為73.42%、73.44%、73.41%，平均包合率為73.42%，與正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝條件基本一致。見(jiàn)表5。

表5　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5Results of verification experiments

3.4GLA及其包合物經(jīng)皮給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1數(shù)據(jù)計(jì)算方法取“2.3.2”項(xiàng)所取樣品，按2.1.1方法進(jìn)樣分析，測(cè)定GLA的含量，根據(jù)下列公式計(jì)算GLA的累積透過(guò)量（Qn，μg/cm2）［16］。

Qn=（CnV+ΣCiVi）/A

Cn：第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸取液的濃度mg/L

Ci：第n-i個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸取液的濃度mg/L

V：接收液的總體積即7.5 mL

Vi：每次吸取的液體體積即1 mL

A：接收池的體積即1 cm2

3.4.2透皮吸收結(jié)果考察了GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收效果，按2.2.2的方法制備GLA軟膏及GLA-HP-β-CD軟膏，按2.3.2方法進(jìn)行透皮吸收實(shí)驗(yàn)，按2.1.1方法測(cè)定GLA含量，并計(jì)算GLA累積透過(guò)量。GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收結(jié)果，以取樣時(shí)間t為橫坐標(biāo)，以GLA累積透過(guò)量Qn為縱坐標(biāo)作圖。見(jiàn)圖2。

圖2　GLA及GLA-HP-β-CD軟膏累積透過(guò)量曲線Fig.2Profile of accumulative permeation amount of glabridin and glabridin HP-β-CD

由圖2可以看出，GLA-HP-β-CD的累積透過(guò)量大于GLA軟膏的累積透過(guò)量，兩者經(jīng)t檢驗(yàn)，有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明HP-β-CD能夠促進(jìn)GLA的透皮吸收，有利于GLA在制劑中的應(yīng)用。

4　討論

GLA為疏水性異黃酮類化合物，應(yīng)用到化妝品中存在的一個(gè)難題是在皮膚中的滲透量很小，從而在實(shí)際應(yīng)用中影響其美白祛斑效果。本文的目的是采用HP-β-CD包合GLA，以增加GLA的水溶性，并考察包合后的GLA在體外經(jīng)皮吸收的滲透量。實(shí)驗(yàn)采用直接攪拌法制備GLA環(huán)糊精包合物，此方法制備過(guò)程簡(jiǎn)便，易操作，耗費(fèi)時(shí)間短［17］。以包合率為檢測(cè)指標(biāo)，測(cè)定GLA-HP-β-CD的含量，優(yōu)化得到最佳包合工藝即投料比為GLA∶HP-β-CD=1∶15（質(zhì)量比），包合溫度為40℃，包合時(shí)間為1.5 h。將GLA-HP-β-CD制備成軟膏后，通過(guò)經(jīng)皮給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HP-β-CD能夠促進(jìn)GLA的透皮吸收，其原因可能與增大GLA的溶解度和穩(wěn)定性有關(guān)［18］，下一步將對(duì)原因進(jìn)一步探討。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Study on preparation of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compound and its effect of transdermal absoption

YE Liu-qing，WANG Yan，HAN Wan-ying，ZHOU Xiao-xia，MA Zong-wu，GUI Guang-zhi
（School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To optimize the preparation technology of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）inclusion compound and investigate its effect of transdermal absoption.［Methods］With inclusion efficiency as the indice，the optimum preparation condition was studied by orthogonal test.Franz vertical diffusion cell was adopted to investigate transdermal performance of glabridin HP-β-CD.［Results］The optimal inclusion conditions were as follows：the ratio of glabridin to HP-β-CD was 1∶15（m/m），inclusion temperature was 40℃，inclusion time was 1.5 h.The cumulative permeation of glabridin HP-β-CD was higher than glabridin group.［Conclusion］HP-β-CD have significant effect on transdermal of glabridin.

glabridin；HP-β-CD；transdermal absoption

R285

A

1672-1519（2015）10-0622-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.11

西青區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XQKH2013-011）；天津中醫(yī)藥大學(xué)第四屆大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CXJJ2013ALL）。

葉柳青（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?/p>

王艷，E-mail：paozhijiaoxue@126.com。

（2015-05-14）