魏靜娜,劉征輝,趙琳琳,郭永澤,程 奕,溫春秀
(1.天津海世達檢測技術(shù)有限公司,天津300381;2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,天津300381;3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,石家莊050051)
·中藥研究·
知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*
魏靜娜1,劉征輝1,趙琳琳1,郭永澤2,程奕2,溫春秀3
(1.天津海世達檢測技術(shù)有限公司,天津300381;2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,天津300381;3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,石家莊050051)
[目的]建立知母藥材的高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用(HPLC/PDA/ELSD)指紋圖譜。[方法]采用Waters Symmetry ShieldTMRP C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,流動相為乙腈-0.1%冰醋酸,梯度洗脫流速1.0 mL/min,柱溫30℃,檢測波長258 nm,ELSD檢測器載氣氣壓30 Psi,漂移管溫度80℃。[結(jié)果]建立了知母的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜,在HPLC-PDA色譜圖中標定了17個共有峰,HPLC-ELSD色譜圖中標定了14個共有峰。[結(jié)論]該方法重復(fù)性好,可用于知母藥材的全面質(zhì)量控制。
知母;指紋圖譜;HPLC/PDA/ELSD
知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖,主產(chǎn)于河北、山西及山東等地。春、秋兩季采挖,除去須根及泥沙,曬干,或除去外皮,曬干。切片入藥,生用,或鹽水炙用。現(xiàn)代藥理研究表明,知母具有抗炎[1-4]、降血糖[5-8]、抗阿爾茨海默病[9-12]等作用,臨床應(yīng)用安全可靠,毒副作用小[13]。在知母藥材的全面質(zhì)量控制方面,目前文獻報道的,多為采用紫外檢測器或者蒸發(fā)光散射檢測器得到的一維圖譜[14-15],文章采用二級管陣列/蒸發(fā)光散射(PDA/ELSD)兩種檢測器串聯(lián)的方式,對河北省不同栽培區(qū)域的知母藥材指紋圖譜進行研究,得到了更加全面的知母藥材質(zhì)量控制方案。
Waters 2695高效液相色譜儀(配有Waters2996 PDA檢測器,Waters2424 ELSD檢測器,Empower2色譜工作站),分析天平(METTLERXS205,METTLER AB54),Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。
芒果苷(111607-200402,購自中國藥品生物制品檢定所),新芒果苷(X-032-140602,純度≥98%,購自成都瑞芬思科技有限公司),知母皂苷BII(111839-201102,純度90.8%,購自中國藥品生物制品檢定所),乙腈(色譜純,Merck公司),冰乙酸(色譜純,天津康科德科技有限公司),乙醇(分析純,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。
知母藥材來源見表1,經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所溫春秀研究員鑒定為百合科植物知母。
表1 知母藥材來源Tab.1Origins of Rhizoma Anemarrhenae
2.1色譜條件色譜柱:Waters Symmetry ShieldTMRP C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)。流動相:乙腈(A)-0.1%冰醋酸(B),梯度洗脫:0~10 min,5%~18%A;10~15 min,18%~25%A;15~25 min,25%A;25~50 min,25%~100%A;50~55 min,100%A;55~60 min,100%~5%A;60~75 min,5%A;流速:1.0 mL/min。PDA檢測器檢測波長:258 nm,ELSD檢測器:氮氣壓力30Psi,漂移管溫度80℃,進樣體積:20μL。
2.2對照品溶液的制備精密稱取新芒果苷,芒果苷,知母皂苷BII,加70%乙醇,制成每mL含0.10 mg的混合標準溶液。
2.3供試品溶液的制備取干燥的知母藥材粉末(過60目篩)0.5 g,精密稱定,置于50 mL的具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,稱定重量,超聲處理30 min,冷卻,用70%的乙醇補足減失的重量,搖勻,過0.45μm的微孔濾膜,濾液作為供試品溶液。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1穩(wěn)定性實驗取1號知母藥材粉末,精密稱定,按照“2.3”項下的方法,制備供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h檢測指紋圖譜。主要共有峰保留時間及峰面積比值的RSD值分別為0.05%~0.031%,0.06%~0.013%(PDA色譜圖中的主要共有峰),1.1%~1.8%(ELSD色譜圖中的主要共有峰),表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。同時發(fā)現(xiàn)50 min后,色譜圖中再沒有特征峰出現(xiàn),色譜記錄時間50 min即可。
2.4.2精密度實驗取“2.2”項下的混合標準溶液,按照“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次,各色譜峰的峰面積比值RSD均小于3%,表明精密度良好,儀器很穩(wěn)定。
2.4.3重復(fù)性實驗取1號樣品,按照“2.3”項下的供試品溶液制備方法,平行制備6份供試品溶液,按照“2.1”項下的色譜條件進樣,PDA色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為0.15%~0.39%,ELSD色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為1.1%~2.8%,表明本方法重復(fù)性良好。
2.5指紋圖譜的建立根據(jù)11批供試品溶液HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜所給出的峰數(shù)、峰值和峰位等相關(guān)參數(shù),進行比較分析,得到圖1-2所示的指紋圖譜共有模式圖。
圖1 11批知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜共有模式圖Fig.1Mutual mode of HPLC-PDA fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae
圖2 11批知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式圖Fig.2Mutual mode of HPLC-ELSD fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae
2.6指紋圖譜分析與評價
2.6.1共有峰的確定根據(jù)11批供試品溶液所得測試結(jié)果,確定HPLC-PDA指紋圖譜有17個峰為各批樣品所共有,同法確定了HPLC-ELSD指紋圖譜中的14個共有峰。見圖3-4。
圖3 知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜Fig.3HPLC-PDA fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae
圖4 知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig.4HPLC-ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae
2.6.2參比峰的選擇在各批次樣品的HPLCPDA圖譜中,芒果苷的峰面積較大,較穩(wěn)定,所以選取芒果苷的峰(9號峰)為HPLC-PDA圖譜的參照峰;同理選取知母皂苷BII的峰(5號峰)作為HPLC-ELSD圖譜的參照峰。
2.6.3指紋圖譜的相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對各批知母藥材的指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理,生成對照圖譜,計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度,只有10號樣品的PDA圖譜與對照圖譜的相似度在0.9以下,其他都在0.9以上。見表2。
表2 知母指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab.2Similarity analysis of Rhizoma Anemarrhenae fingerprint
3.1檢測器的選擇知母中的主要化學(xué)成分有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、多糖類、木脂素類等[16-17],如果單純使用PDA檢測器,由于甾體皂苷類成分沒有紫外吸收,所以,此類成分的含量將無法控制,而ELSD檢測器作為通用型檢測器,雖然理論上,只要待測物質(zhì)的沸點高于流動相,就可以使用ELSD檢測器檢出,但由于靈敏度低,所以,單純使用ELSD檢測器建立的指紋圖譜中,會缺少一些含量較低的物質(zhì)的信息。本實驗采用HPLC/PDA/ELSD聯(lián)用的方式,建立了知母藥材的多維指紋圖譜,彌補了采用單一檢測器的局限性,可以更立體的控制知母藥材的質(zhì)量[18-19]。
3.2檢測波長的選擇實驗采用3D數(shù)據(jù)采集,記錄了供試品溶液在190~400 nm的全波長色譜圖,在不同的波長下提取色譜圖,當波長低于260 nm時,基線不平,而波長大于260 nm時,各主要色譜峰的吸收又會降低,所以,選取了芒果苷的最大吸收波長258 nm為檢測波長。
3.3流動相系統(tǒng)的選擇實驗考察了乙腈-冰醋酸水溶液和乙腈-甲酸水溶液兩個流動相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)使用乙腈-冰醋酸水溶液,各峰的分離度更好,出峰時間分布更均勻,因此,最終選用了乙腈-冰醋酸水溶液作為流動相。
3.4色譜柱的選擇實驗考察了Waters SunFireTMC18、Waters Symmetry C18、Waters Symmetry ShieldTMRP C18和Dikma Diamonsil C18,結(jié)果表明,使用Waters Symmetry ShieldTMRP C18時,各峰分布更均勻,分離度更好,所以采用此色譜柱。
郭曉曄等[20]的研究揭示了栽培“西陵知母”中不同化學(xué)成分在一年中的各月份,呈現(xiàn)不同的規(guī)律性變化。實驗使用的藥材均采收于初秋8、9月份,采收于其他季節(jié)的知母藥材,可能會由于其中某些化學(xué)成分的含量處于不同時期,而與本實驗建立的對照指紋圖譜相似度較低。
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(本文編輯:高杉,于春泉)
Study on HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae
WEI Jing-na1,LIU Zheng-hui1,ZHAO Lin-lin1,GUO Yong-ze2,CHENG Yi2,WEN Chun-xiu3
(1.Tianjin High-Standard Quality Testing Lab,Tianjin 300381,China;2.Tianjin Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research Institute,Tianjin 300381,China;3.Institute of Cash Crops,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science,Shijiazhuang 050051,China)
[Objective]To establish the HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae.[Methods]This experiment had been done on Waters Symmetry ShieldTMRP C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)analytical column of 30℃,with a gradient eluted acetonitrile-0.1% acetic acid mobile phase system of 1.0 mL/min.The detection wavelength had been set at 258 nm,N2pressure was 30 Psi,and the temperature of the drift tube was 80℃.[Results]The mutual modes of the HPLC/PDA/ELSD fingerprint were set up under the established condition.The 17 mutual peaks in the HPLC-PDA fingerprint and 14 mutual peaks in the HPLC-ELSD fingerprint of 11 samples were confirmed.[Conclusion]The method that had been established in this experiment is a good method to totally control the quality of Rhizoma Anemarrhenae.
Rhizoma Anemarrhenae;fingerprint;HPLC/PDA/ELSD
R284.1
A
1672-1519(2015)10-0618-04
10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.10
“十二五”科技部國家科技支撐計劃項目(2011B A107B064)。
魏靜娜(1981-),女,碩士,工程師,研究方向為藥品質(zhì)量分析。
程奕,E-mail:cychengyi@yahoo.com。
(2015-04-27)