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    鹽芥CAS基因的生物信息學(xué)分析及在鹽脅迫下的表達(dá)

    2015-08-20 21:01:15余璐璐曹中權(quán)劉龍山黃格格
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)鹽脅迫生物信息學(xué)

    余璐璐 +曹中權(quán) 劉龍山 范 崎 黃格格 徐飛

    摘要:鹽芥(Thellungiella salsuginea)是一種新型的模式植物,具耐鹽特性,但鹽芥的抗鹽機(jī)理仍不清楚。本研究對(duì)鹽芥氰丙氨酸合酶(cyanoalanine synthase,CAS)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并檢測(cè)了鹽脅迫條件下CAS基因的表達(dá)變化。生物信息學(xué)分析表明,編碼鹽芥CAS合酶的基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,CAS合酶偏酸性,主要定位于細(xì)胞質(zhì)中起作用。啟動(dòng)子分析表明,鹽芥CAS基因啟動(dòng)子上有多個(gè)鹽脅迫響應(yīng)元件。進(jìn)一步的鹽脅迫試驗(yàn)表明,鹽芥植株在200 mmol/L NaCl脅迫條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性,CAS基因受脅迫誘導(dǎo)上升。鹽脅迫處理后9 h,CAS基因表達(dá)高出對(duì)照組材料2倍,氰化氫(HCN)含量被降低到較低水平。這些結(jié)果表明,CAS基因在鹽芥脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。

    關(guān)鍵詞:鹽芥;氰丙氨酸合酶;鹽脅迫;基因分析;基因表達(dá);生物信息學(xué)

    中圖分類號(hào):Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-1302(2015)07-0025-05

    鹽芥(Thellungiella salsuginea)是一種有花的鹽生植物,與雙子葉植物研究中所常用的模式植物擬南芥親緣關(guān)系較近[1-2]。鹽芥具有對(duì)高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫極高的耐受能力,使得鹽芥成為研究植物非生物逆境脅迫機(jī)理的理想材料[3-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球擁有大面積鹽漬地,這些土地未能被完全開發(fā)和利用[6]。我國鹽漬土面積約1億hm2,高鹽環(huán)境嚴(yán)重地影響了植物的生長和發(fā)育,是造成作物減產(chǎn)的主要原因之一[6]。隨著世界范圍內(nèi)可耕地日趨減少以及鹽堿、干旱等極端氣候狀況的日趨嚴(yán)重,研究植物耐鹽脅迫的分子機(jī)制,尋找有效改良植物耐鹽性的方法,已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注,并已成為植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[7-8]。諸多研究表明,鹽脅迫等逆境因子會(huì)誘導(dǎo)乙烯反應(yīng)[9-10],乙烯反應(yīng)的增強(qiáng)有助于植物減輕脅迫造成的傷害;所以,長期以來乙烯也被賦予“脅迫乙烯”之稱。眾所周知,乙烯的生物合成經(jīng)蛋氨酸,在三磷酸腺苷(ATP)參與下,轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine,SAM),SAM 在ACC合成酶(ACC synthase,ACS)的作用下轉(zhuǎn)化為1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylic acid,ACC)和甲硫腺苷(5′-deoxy-5′ methylthioadenosine,MTA),ACC在ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)催化下產(chǎn)生乙烯[9]。值得注意的是,植物在產(chǎn)生乙烯的同時(shí),會(huì)產(chǎn)生等量的氰化氫(hydrogen cyanide,HCN)[11]。HCN可抑制線粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素C氧化酶的活性,因而HCN對(duì)于生物體來說有很強(qiáng)毒性[11]。但是,植物具有產(chǎn)HCN并耐HCN的特性。一方面是因?yàn)橹参矬w內(nèi)存在一條由交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)介導(dǎo)的抗氰呼吸途徑(cyanide-resistance respiration pathway),可減輕HCN對(duì)呼吸鏈的抑制作用[12]。另一方面,HCN會(huì)誘導(dǎo)芥氰丙氨酸合酶(cyanoalanine synthase,CAS)的活性,從而將HCN降低到安全濃度范圍內(nèi)[13]。鑒于乙烯在鹽脅迫響應(yīng)中的重要作用,及CAS合酶與乙烯的密切關(guān)系,本研究以鹽芥植株為材料,對(duì)CAS基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并檢測(cè)鹽脅迫條件下鹽芥CAS基因的表達(dá)量,以期為進(jìn)一步闡明鹽芥的耐鹽機(jī)理提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 鹽芥CAS基因生物信息學(xué)分析

    鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)利用在線分析工具Gene Structure Display Server(GSDS,http://gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php)進(jìn)行分析。氨基酸序列分析及同源進(jìn)化樹構(gòu)建分別利用Vector NTI 11.5和MEGA 5.2軟件進(jìn)行。CAS基因亞細(xì)胞定位和蛋白成員理化性質(zhì)分別使用WolfPSORT (http://psort.hgc.jp/)和ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析?;騿?dòng)子響應(yīng)元件進(jìn)行在線分析(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)。

    1.2 鹽脅迫條件下鹽芥CAS基因的表達(dá)分析

    1.2.1 材料 鹽芥種子來源于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林宏輝教授實(shí)驗(yàn)室。鹽芥種子春化后播種在含營養(yǎng)土和蛭石(1 ∶1)的培養(yǎng)基質(zhì)上,同時(shí)施以1/2Hoagland營養(yǎng)液,培養(yǎng) 40 d 后幼苗用于試驗(yàn)。

    1.2.2 鹽脅迫處理 取6株長勢(shì)一樣的鹽芥植株放置在平皿中,分為A、B 2組,然后用1/2Hoagland營養(yǎng)液適應(yīng)培養(yǎng) 48 h。A組用200 mmol/L NaCl脅迫處理,B組為對(duì)照組。實(shí)時(shí)記錄2組幼苗的生長情況。

    1.2.3 鹽芥總RNA的提取及基因表達(dá)分析 鹽芥總RNA的提取采用Trizol(Invitrogen公司)試劑??俁NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa公司試劑盒)后,熒光定量檢測(cè)CAS基因表達(dá)量(引物設(shè)計(jì)如表1所示)。熒光定量PCR擴(kuò)增使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒,每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的目的基因片段通過SYBR-green Ⅰ熒光來檢測(cè),CT值用于檢測(cè)目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù),目標(biāo)基因的相對(duì)含量通過相對(duì)CT值來表示,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。Actin基因作為內(nèi)參基因[14]。

    1.2.4 氧化損傷檢測(cè)分析 鹽脅迫處理后,檢測(cè)H2O2、丙二醛、電導(dǎo)率及失水率的變化情況。H2O2含量的測(cè)定參照 Velikova 等的方法[15]。丙二醛(MDA)含量、電解質(zhì)滲漏和葉片失水率參照Xu等的方法[16]測(cè)定。

    1.2.5 葉綠素含量檢測(cè) 葉綠素含量的測(cè)定參照Kichtenchaler等的方法[17]:稱取0.5 g葉片,用80%丙酮和少許 CaCO3 快速研磨成勻漿,然后用80%丙酮定容至20 mL;3 000 r/min 離心10 min,取上清液測(cè)定在470、646、663 nm處的吸光度(D)。

    1.2.6 氰化氫含量檢測(cè) 氰化氫(HCN)含量檢測(cè)采用便攜式氣體檢測(cè)器(GT901-HCN):植物材料在2 000 mL透明容器中密閉處理2 h后,用氣體檢測(cè)器檢測(cè)濃度。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 鹽芥CAS基因的生物信息學(xué)分析

    2.1.1 鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)分析 利用在線分析工具Gene Structure Display Server(GSDS,http://gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php)對(duì)鹽芥CAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明CAS基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子(圖1)。

    2.1.2 鹽芥CAS蛋白同源比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建 從NCBI找到20個(gè)已知CAS蛋白序列的物種,并與鹽芥CAS蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析,利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖2可以看出,鹽芥CAS蛋白序列與蕪菁、亞麻薺、擬南芥和煙草的CAS蛋白序列同源性較高,親緣關(guān)系較近,進(jìn)化處于同一分支。

    2.1.3 鹽芥CAS蛋白的亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)分析 鹽芥CAS蛋白亞細(xì)胞定位使用WolfPSORT(http://psort.hgc.jp/)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如圖3所示:鹽芥CAS蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(預(yù)測(cè)比例達(dá)60.9%),其次是定位于線粒體和細(xì)胞核(預(yù)測(cè)比例均為13.0%),定位于過氧化物酶體和質(zhì)膜的可能性較低,預(yù)測(cè)比例分別為8.7%和4.3%。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)鹽芥CAS蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果如表2所示,鹽芥CAS蛋白氨基酸長度為323個(gè),分子量為34 364.8 u。從理論等電點(diǎn)數(shù)據(jù)來看,CAS蛋白偏酸性(pI=5.47)。此外,蛋白不穩(wěn)定性分析顯示,鹽芥CAS蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為26.54,未超過臨界值(大于40被認(rèn)為不穩(wěn)定),表明CAS蛋白穩(wěn)定性較好。另外,從表2所顯示的平均親水性來看,CAS的親水性值為0.066,表明其是疏水性蛋白,不過數(shù)值并不太高,推測(cè)其應(yīng)是微溶于水。

    2.1.4 鹽芥CAS基因的啟動(dòng)子分析 利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫找到CAS基因的基因編碼區(qū)上游序列,共計(jì)2 032 bp;利用日本PLACE在線分析系統(tǒng)對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明,鹽芥CAS基因啟動(dòng)子具有大量的逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件,包括W box、AGMOTIFNTMYB2、MYB1AT、TC rich元件等(圖4)。

    2.2 鹽芥CAS基因在鹽脅迫響應(yīng)過程中的變化

    2.2.1 鹽脅迫對(duì)鹽芥生長的影響 在200 mmol/L NaCl脅迫處理12 h后,鹽芥植株葉片開始卷曲,表現(xiàn)出明顯的失水現(xiàn)象和一定的氧化損傷;但是,鹽脅迫處理對(duì)鹽芥葉綠素的合成影響較小,鹽芥在脅迫處理?xiàng)l件下生長3 d,仍呈綠色狀態(tài),失水情況未進(jìn)一步發(fā)生(圖5),表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性。

    2.2.2 鹽脅迫對(duì)鹽芥CAS基因表達(dá)的影響 研究表明,鹽脅迫處理能明顯誘導(dǎo)CAS基因的表達(dá)(圖6)。與對(duì)照組相比,200 mmol/L NaCl鹽脅迫處理鹽芥幼苗后,CAS基因的表達(dá)明顯上升,尤其是在脅迫處理9 h后,CAS基因的表達(dá)量上升近2倍。由此推測(cè),CAS基因參與了鹽芥鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

    3 討論

    與擬南芥相比,鹽芥耐貧瘠性強(qiáng),生命力旺盛,根系強(qiáng)大;但到目前為止,鹽芥的抗逆機(jī)理仍不是很清楚。本試驗(yàn)對(duì)鹽芥CAS基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并研究了鹽芥CAS基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化,以期為進(jìn)一步揭示鹽芥對(duì)逆境脅迫的耐受機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),鹽芥CAS基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明,CAS基因啟動(dòng)子上有較多與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件,包括 W-box、MYB響應(yīng)元件等。由此推測(cè),CAS基因可能參與了鹽芥鹽脅迫應(yīng)答。CAS蛋白氨基酸長度為323個(gè),分子量為34 364.8 u,蛋白偏酸性(pI=5.47),微溶于水。從蛋白作用部位來看,CAS蛋白主要作用部位為細(xì)胞質(zhì),其次為線粒體。鑒于CAS合酶是代謝植物HCN的關(guān)鍵酶,而HCN主要伴隨乙烯的合成產(chǎn)生,我們推測(cè)CAS合酶與降低鹽脅迫誘導(dǎo)乙烯合成過程中的HCN含量,及減輕HCN對(duì)線粒體呼吸

    鏈的抑制作用有關(guān)。

    試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,鹽芥在200 mmol/L NaCl脅迫條件下葉片表現(xiàn)出一定程度的損傷,H2O2、MDA和電解質(zhì)滲漏都有明顯上升,但整體生長狀況良好,葉綠素含量仍維持在一個(gè)較高水平,表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性。據(jù)報(bào)道,鹽芥可以在500 mmol/L NaCl的高鹽生境下完成生活史,耐鹽能力遠(yuǎn)強(qiáng)于只能耐受100 mmol/L NaCl的擬南芥[18]。另有研究表明,鹽芥對(duì)高鹽的耐受性可能與鹽芥具有苗期生長較旺、根系發(fā)達(dá)、葉肉致密等優(yōu)點(diǎn)有關(guān)[14,19]。本研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫處理后,CAS基因的轉(zhuǎn)錄明顯上升。鹽脅迫處理9 h后,CAS基因的轉(zhuǎn)錄水平最高,高出對(duì)照組近2倍。García等研究表明,CAS合酶表達(dá)的上升有助于減少逆境脅迫引起的活性氧(ROS)累積,從而減輕氧化損傷,維持植物的正常代謝生長[20]。因此,本研究中CAS基因的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)該也是鹽芥對(duì)鹽脅迫高度適應(yīng)的原因之一。

    從HCN含量變化檢測(cè)結(jié)果可以看出,在鹽脅迫3 h后,HCN含量開始上升,在9 h后達(dá)到峰值,隨后開始下降,并在48 h后接近處理前的水平。這些結(jié)果表明,CAS合酶受HCN的誘導(dǎo),鹽脅迫條件下CAS合酶表達(dá)量上升有助于減少細(xì)胞內(nèi)HCN的積累,減輕HCN對(duì)細(xì)胞尤其是線粒體的損傷。但同時(shí)也可看出,HCN在鹽脅迫處理3 d后,也沒有完全恢復(fù)到處理前的水平,表明低濃度的HCN在鹽芥鹽脅迫應(yīng)答過程中具有一定作用。Xu等研究表明,低濃度的HCN(20 μmol/L)有助于提高黃瓜幼苗抵御鹽漬、干旱和冷害脅迫[12]。Seo等研究發(fā)現(xiàn)氰化物處理能提高水稻抵御真菌的侵害[21]。Liao等研究報(bào)道外施KCN能增強(qiáng)番茄對(duì)TMV的抗性[22]。此外,HCN被證實(shí)在種子萌發(fā)中起正調(diào)控的作用,還能作為氮源被植物吸收利用[23-24]。因此,進(jìn)一步研究CAS合酶與HCN間的動(dòng)態(tài)關(guān)系,將有助于揭示植物的耐鹽機(jī)制。

    總之,本研究表明鹽芥具有較強(qiáng)的耐鹽性,CAS基因在鹽芥鹽脅迫適應(yīng)過程中受明顯的誘導(dǎo)表達(dá),CAS合酶通過有效降低HCN的濃度,保護(hù)線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。同時(shí),低濃度的HCN可能在鹽芥逆境脅迫應(yīng)答過程中扮演著重要角色,但具體機(jī)制還需要更多的研究來證實(shí)。

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