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    橡膠樹(shù)SSR—SRAP—AFLP標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建

    2015-08-20 21:11:32王惠君王文泉和麗崗賀軍軍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:分子標(biāo)記橡膠樹(shù)

    王惠君 王文泉 和麗崗 賀軍軍

    摘要:利用橡膠樹(shù)GT1與IAN873雜交組合183株實(shí)生苗的F1代群體作為構(gòu)圖群體,利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記對(duì)該群體進(jìn)行遺傳連鎖分析,構(gòu)建1張包括18個(gè)連鎖群、372個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的橡膠樹(shù)分子遺傳連鎖圖(LOD≥3),其中包括19個(gè)SSR標(biāo)記、73個(gè)SRAP標(biāo)記、280個(gè)AFLP標(biāo)記,連鎖圖譜的總圖距覆蓋1 735.9 cM,所有標(biāo)記間的平均圖距為5.22 cM。在此連鎖圖譜上的標(biāo)記區(qū)間為[8,46],所有連鎖群長(zhǎng)度區(qū)間為[55.3 cM,134.7 cM]。LG9連鎖群包含標(biāo)記最少為8個(gè);LG1連鎖群包含標(biāo)記最多為46個(gè);LG1的平均圖距最小為2.80 cM;LG17的平均圖距最大為7.92 cM??倛D譜中存在圖距大于20 cM的空隙為5個(gè)。

    關(guān)鍵詞:橡膠樹(shù);分子標(biāo)記;遺傳連鎖圖譜

    中圖分類(lèi)號(hào):S794.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2015)07-0041-05

    收稿日期:2015-01-04

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金 (編號(hào):31261140363、31000537、31171230);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):ITBBZX0843);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):2010CB126601)。

    作者簡(jiǎn)介:王惠君(1981—),男,山西原平人,碩士,助理研究員,從事生物多樣性研究。E-mail:382494058@qq.com。

    通信作者:王文泉,博士,研究員,博士生導(dǎo)師,從事熱帶生物資源、熱帶經(jīng)濟(jì)作物結(jié)構(gòu)基因組學(xué)與分子育種及熱帶珍稀瀕危野生植物的保護(hù)生物學(xué)研究。E-mail:wquanw@hainan.net。

    橡膠樹(shù)(Heva brasiliensis)屬大戟科橡膠樹(shù)屬植物[1],原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。具有高彈性及耐高溫等特性的天然橡膠是合成橡膠不可替代的材料,也是重要的戰(zhàn)略物資、工業(yè)原料。雖然分子標(biāo)記技術(shù)在橡膠樹(shù)研究方面已取得了一定進(jìn)展,但關(guān)于橡膠樹(shù)分子生物學(xué)研究還很欠缺。Lespinasse等以橡膠樹(shù)雜交組合(PB260×RO38 106) F1代群體為材料,構(gòu)建了第1張總圖距為2 144 cM及標(biāo)記間平均圖距為3 cM的橡膠樹(shù)遺傳圖譜,包含18個(gè)連鎖群,由301個(gè)RFLP標(biāo)記、388個(gè)AFLP標(biāo)記、18個(gè)SSR標(biāo)記、10個(gè)同工酶標(biāo)記組成[2]。和麗崗利用雜交組合(IAN873×GT1)的195個(gè) F1代群體構(gòu)建了總圖距為1 455.57 cM及標(biāo)記間平均距離為 558 cM 的AFLP連鎖遺傳圖,包含18個(gè)連鎖群,由261個(gè)AFLP標(biāo)記組成[3]。馮素萍等以雜交組合(IAN873×熱研88-13)的94個(gè)F1代群體構(gòu)建了總圖距為1 937.06 cM及標(biāo)記間平均距離21.29 cM的連鎖群,包含18個(gè)連鎖群,由91個(gè)SSR標(biāo)記組成[4]。王惠君利用雜交組合(IAN873×GT1)的F1代群體構(gòu)建了總圖距為774 cM及標(biāo)記間平均距離為11.38cM的連鎖遺傳圖,該圖包括18個(gè)連鎖群,由7個(gè)SSR標(biāo)記、61個(gè)SRAP標(biāo)記組成[5]。Triwitayakorn等用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了總圖距為842.9 cM且包含23個(gè)連鎖群的橡膠樹(shù)連鎖遺傳圖[6]。以上遺傳圖譜為進(jìn)一步分析橡膠樹(shù)重要性狀的QTL定位及分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)應(yīng)用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)橡膠樹(shù)雜交組合(IAN873×GT1)的195株實(shí)生苗的F1代群體構(gòu)建高密度的橡膠遺傳連鎖圖譜,旨在為開(kāi)發(fā)利用橡膠樹(shù)資源提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 作圖群體的構(gòu)建

    GT1:天然橡膠生產(chǎn)國(guó)主要栽培品種的魏克漢種質(zhì),具有抗寒、中產(chǎn)、抗旱特點(diǎn)。IAN873:抗南美葉疫病無(wú)性系品種的非魏克漢種質(zhì),抗寒但不抗風(fēng),生長(zhǎng)量、產(chǎn)量比GT1高。以云南省熱帶作物研究所提供的利用非近交親本橡膠樹(shù)雜交組合(IAN873×GT1)得到的183個(gè)F1代群體作為構(gòu)圖群體。

    1.2 基因組DNA的提取

    以橡膠樹(shù)嫩葉片作為材料,選用改良CTAB法[7]提取橡膠樹(shù)基因組DNA。改良提取緩沖液的組成為:Tris/HCl(pH值8.0)100 mmol/L,EDTA(pH值8.0)60 mmol/L,NaCl 1.4 mol/L,CTAB 2%。用瓊脂糖凝膠1.5%電泳分析檢測(cè)提取的DNA;用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其濃度、純度。

    1.3 SSR分析

    參照網(wǎng)站公布的信息進(jìn)行SSR引物的合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)參照馮素萍等的方法[4],采用25 μL體系并且在A(yíng)BI-PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 變性1 min,60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

    1.4 SRAP分析

    設(shè)計(jì)SRAP引物序列[8],所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司提供,其中F-primer合成32條,R-primer 合成21條。依據(jù)薛丹丹等報(bào)道[9],設(shè)定的原初20 μL反應(yīng)體系優(yōu)化后為DNA模板50 ng、10×PCR buffer (Mg2+) 2.0 μL、dNTPs(20 mmol/L) 0.4 μL、F-primer(50 ng/μL)0.6 μL、R-primer(50 ng/μL)0.6μL、Taq(5 U/μL)0.4 μL、ddH2O 15.0 μL。參照Li等的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,35 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,5個(gè)循環(huán);隨后將退火溫度升至51 ℃,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸9 min,4 ℃下保存。使用瓊脂糖凝膠1.0%電泳對(duì)此PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

    1.5 AFLP分析

    參照王惠君等的方法[10],限制性?xún)?nèi)切酶采用經(jīng)典的EcoRⅠ、MseⅠ組合。酶切程序和DNA片段與接頭的連接同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)DNA樣品酶切連接反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL:DNA 500 ng,T4連接酶緩沖液2 μL,ATP 1.25 μL,MseⅠ、EcoRⅠ接頭分別1 μL,EcoRⅠ和MseⅠ0.3 μL,T4連接酶 0.6 μL;設(shè)定的反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 380 min、16 ℃ 380 min。酶切鏈接的產(chǎn)物稀釋后才可以使用,選擇濃度稀釋到原液的 1/3 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。預(yù)擴(kuò)增體系20 μL:取酶切連接稀釋后DNA 產(chǎn)物 5 μL,緩沖液 2 μL,MSeⅠ引物 (M00) 和EcoRⅠ引物(E00)各0.6 μL(其中Primer E00:5′-GACTGCGTACCAATT CA-3′、Primer M00:5′-GATGAGTCCTGAG TAAC-3′)dNTPs 0.4 μL,Taq酶0.12 μL。參數(shù)設(shè)置為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 80 s,31個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 5 min。預(yù)擴(kuò)增引物后再增加2個(gè)堿基作為選擇性擴(kuò)增引物,進(jìn)入選擇性擴(kuò)增階段,用8對(duì)EcoRⅠ、MseⅠ引物進(jìn)行組合,即64個(gè)引物組合。參數(shù)設(shè)置為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,65 ℃ 40 s(-1 ℃/循環(huán)),72 ℃ 80 s,12個(gè)循環(huán)(梯度PCR);94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 75 s,22個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)均在BIOMITRA-T1熱循環(huán)儀上進(jìn)行。

    1.6 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及作圖軟件應(yīng)用

    記錄的分離譜帶是由作圖的F1群體親本譜帶所決定的,SRAP標(biāo)記、大多數(shù)的AFLP標(biāo)記屬于顯性標(biāo)記,母本、父本有的譜帶記錄為1,無(wú)譜帶記錄為0;SSR標(biāo)記和少數(shù)的AFLP標(biāo)記屬于共顯性標(biāo)記,記錄譜帶時(shí)只要與父本譜帶一致的記錄為A,與母本譜帶一致的記錄為B,如果是雜合的記錄為H;此外不管顯性標(biāo)記還是共顯性標(biāo)記,只要譜帶缺失或者模糊的均記為“-”;估計(jì)多態(tài)性譜帶的分子量大小是依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL2 000 標(biāo)準(zhǔn)帶型的相對(duì)位置。對(duì)于一些引物,假如1對(duì)引物同時(shí)可以檢測(cè)到幾個(gè)位點(diǎn),依據(jù)擴(kuò)增出分子量大小排序,按從大到小的原則標(biāo)記。在其所用引物后加“-1、-2、-3”和“-a、-b、-c”符號(hào)進(jìn)行區(qū)別標(biāo)記。作圖之前,按照J(rèn)oinMap3.0要求的數(shù)據(jù)格式將A、B、H或者0、1轉(zhuǎn)換成原始矩陣所要求的數(shù)據(jù)格式a、c;不同水平偏分離的標(biāo)記在其后面用“*”表示;輸入所需數(shù)據(jù)后,用LOD groupings進(jìn)行計(jì)算并獲得連鎖群,輸出遺傳連鎖圖譜[11-12]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 篩選引物及多態(tài)性標(biāo)記

    利用SSR、SRAP、AFLP等3種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)橡膠樹(shù)進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。選擇來(lái)自NCBI的30對(duì)SSR引物分別進(jìn)行多態(tài)性篩選,對(duì)2個(gè)親本進(jìn)行篩選,其中有13對(duì)引物多態(tài)性豐富且譜帶穩(wěn)定。從13對(duì)引物中擴(kuò)增出37條帶,其中35條為多態(tài)性帶,多態(tài)性比率高達(dá)94.59%。在顯著水平(5%)上共發(fā)現(xiàn)18個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離,比率達(dá)51.43%。對(duì)96對(duì)引物組合雙親進(jìn)行SRAP篩選分析,從中篩選出20個(gè)擴(kuò)增比較好且存在明顯多態(tài)性引物的組合,共獲得166條帶,經(jīng)過(guò)分析,其中有113條為多態(tài)性譜帶,多態(tài)性比率為68.07%,SRAP多態(tài)性、重復(fù)性較好。在顯著水平(5%)上發(fā)現(xiàn)共有51個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離,頻率達(dá)45.13%。用64對(duì)AFLP組合引物雙親本進(jìn)行篩選分析,從中篩選出具有明顯多態(tài)性的標(biāo)記13對(duì)??偣搏@得675個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),對(duì)這些遺傳位點(diǎn)的標(biāo)記分離比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,剔除不用于作圖的異常分離標(biāo)165個(gè),在顯著水平(5%)上發(fā)現(xiàn)198個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離。其中符合作圖要求的以3 ∶1分離模式比例的標(biāo)記共有162個(gè),符合1 ∶1分離模式比例的標(biāo)記共有150個(gè)(表1)。

    2.2 分子標(biāo)記分離分析及遺傳圖譜的構(gòu)建

    利用JoinMap3.0對(duì)823個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析作圖,在LOD≥3條件下獲得包含372個(gè)標(biāo)記(其中SSR標(biāo)記19個(gè),SRAP標(biāo)記73個(gè),AFLP標(biāo)記280個(gè))、18個(gè)連鎖群的橡膠樹(shù)遺傳圖譜(圖1),連鎖群數(shù)目與橡膠樹(shù)18對(duì)染色體數(shù)目相一致。其中SSR、SRAP及AFLP標(biāo)記的比例分別為5.1%、19.3%、75.3%。獲得最終的遺傳連鎖圖譜覆蓋總長(zhǎng)度為1 735.9 cM,標(biāo)記間的平均圖距為 5.22 cM。連鎖群上的標(biāo)記數(shù)區(qū)間范圍為[4,46],連鎖群的長(zhǎng)度區(qū)間范圍為[55.3 cM,134.7cM],群內(nèi)平均圖距區(qū)間[127 cM ,17.02 cM](表2)。用于連鎖分析的823個(gè)標(biāo)記當(dāng)中,首先剔除掉異常分離標(biāo)165個(gè)AFLP標(biāo)記,其中286個(gè)標(biāo)記未構(gòu)建入連鎖群,占34.75%,286個(gè)標(biāo)記中包括230個(gè)AFLP標(biāo)記、40個(gè)SRAP標(biāo)記、16個(gè)SSR標(biāo)記。構(gòu)建的18個(gè)連鎖群中,LG9包含標(biāo)記數(shù)最少,為8個(gè);LG1包含的標(biāo)記數(shù)最多,達(dá)46個(gè)。整個(gè)遺傳連鎖圖譜最小圖距為0.5 cM,在LG1上,最大圖距為25.2 cM,在LG11上;平均圖距最小為 280 cM,分布在LG1上;平均圖距最大為7.92 cM,分布在LG17上;遺傳圖譜包含5個(gè)空隙(≥20 cM),LG11上2個(gè),LG15、LG17、LG18各1個(gè)。

    2.3 偏分離分析

    構(gòu)建的橡膠樹(shù)遺傳連鎖圖上包含372個(gè)標(biāo)記位點(diǎn),其中5%水平上包含47個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不能滿(mǎn)足孟德?tīng)柗蛛x比,其偏分離水平表現(xiàn)顯著的標(biāo)記占總標(biāo)記的12.63%;在1%水平上包含119個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不能滿(mǎn)足孟德?tīng)柗蛛x比,其偏分離水平表現(xiàn)極顯著的標(biāo)記占總標(biāo)記的 32.00%。連鎖群上偏分離標(biāo)記占總標(biāo)記的44.62%。從偏分離位點(diǎn)的分布來(lái)看,每個(gè)連鎖群上均有分布。其中 LG1上偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)最多為23個(gè),占LG1總標(biāo)記數(shù)的50.00%;LG11、LG16上的偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)最少,都為1個(gè),分別占LG11、LG16的8.33%、11.11%,同時(shí)LG16上的偏分離標(biāo)記在所有連鎖群中所占比例也是最少的;LG9上的偏分離標(biāo)記在所有連鎖群中所占比例最多,為7500%;其中 LG7、LG10上的偏分離標(biāo)記分布與其他連鎖群相比較聚集。其他大部分偏分離位點(diǎn)在連鎖群上分布比較均勻。

    3 結(jié)論與討論

    3.1 SSR、SRAP及AFLP作圖分析

    本研究主要利用SSR、SRAP及AFLP等3種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建,結(jié)果顯示,AFLP標(biāo)記在遺傳圖譜作圖中所占比例最多,雖然此種標(biāo)記的信息量非常豐富,但是試驗(yàn)程序要求精度高并相對(duì)繁瑣,同時(shí)聚集現(xiàn)象頻繁導(dǎo)致在所繪制連鎖群上出現(xiàn)較多大的空隙。SSR 標(biāo)記雖然揭示的多態(tài)性較豐富、可信度、重復(fù)率較高,但開(kāi)發(fā)引物費(fèi)用較高,因此開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記不多。SRAP分子標(biāo)記試驗(yàn)操作容易、結(jié)果穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶清晰,較容易進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并且過(guò)程簡(jiǎn)單,重復(fù)

    性好。開(kāi)發(fā)的SRAP引物中包含CCGG、AATT的核心序列,保證擴(kuò)增反應(yīng)是針對(duì)基因組的開(kāi)放閱讀框區(qū)域。此種特殊性增強(qiáng)了擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果與表型的相關(guān)性,同時(shí)可以更多地揭示所選材料表型差異性。因此,適用于較高密度遺傳圖譜的構(gòu)建。

    3.2 作圖群體及圖譜構(gòu)建分析

    橡膠樹(shù)為大戟科橡膠樹(shù)屬植物,屬于高度雜合的高大喬木,異花授粉,世代周期較長(zhǎng),基因組龐大,遺傳背景相關(guān)材料較少,因而很難得到像其他農(nóng)作物一樣的重組近交系作為遺傳作圖,這給橡膠樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建帶來(lái)一定困難。大部分林木具有無(wú)性繁殖特性,這個(gè)特點(diǎn)對(duì)保存作圖群體較為有利,作圖群體建立后就可以永久性保存,同時(shí)還可以反復(fù)測(cè)定性狀。以大多數(shù)林木的重要經(jīng)濟(jì)性狀作為數(shù)量性狀,憑借這一特性進(jìn)行QTL(數(shù)量性狀位點(diǎn))定位分析較為容易,從而可以建立或選擇1個(gè)較為理想的分離群體作為構(gòu)建遺傳圖譜的首要條件。目前林木遺傳作圖群體較為常用的方法主要有半同胞作圖群體、全同胞交配群體、單倍體作圖群體(針葉樹(shù))、F1作圖群體、F2群體、回交1代(BC1)群體、回2代群體(BC2)。依據(jù)雙假測(cè)交理論[12-14],即一方親本的大部分雜合位點(diǎn)在另一方親本呈顯純隱性或?yàn)殡s合位點(diǎn)時(shí),這些位點(diǎn)在F1代群體中發(fā)生分離。親本材料遺傳差異越大,多態(tài)性也就越高,越有利于豐富圖譜信息量。因此,本研究以橡膠樹(shù)質(zhì)量性狀相差較大的IAN873×GT1的F1代183株實(shí)生苗群體作為構(gòu)建橡膠樹(shù)遺傳圖譜材料。

    在分子生物學(xué)領(lǐng)域,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,作為1個(gè)染色體連鎖框架圖最低要求為所用標(biāo)記間的平均距離不能大于 20 cM。用于進(jìn)行主效基因定位作為試驗(yàn)?zāi)康臉?gòu)建的連鎖框架圖譜的平均距離范圍一般區(qū)間為[10 cM,20 cM],遇到特殊情況時(shí)平均距離要求更小。如以基因克隆作為試驗(yàn)?zāi)康牡淖畹鸵鬄樗寺』虻哪繕?biāo)區(qū)域標(biāo)記間的平均圖距區(qū)間為[0 cM,1 cM]。如用于QTL定位分析作為試驗(yàn)?zāi)康牡淖畹鸵鬄槠骄嚯x范圍區(qū)間為[0 cM,10 cM]。本試驗(yàn)所構(gòu)建的橡膠樹(shù)遺傳連鎖框架圖譜除了有5個(gè)大于20 cM的空隙外,該圖的圖距和平均圖距區(qū)間范圍分別為[0.5 cM,19.6 cM]和[2.80 cM,7.92 cM],符合農(nóng)藝性狀QTL分析和主效基因定位的最低要求。因此,本試驗(yàn)可作為橡膠樹(shù)農(nóng)藝性狀QTL分析的基礎(chǔ)。

    3.3 偏分離分析

    生物學(xué)界普遍認(rèn)為,分離現(xiàn)象也是生物進(jìn)化的推動(dòng)因素之一[13],導(dǎo)致偏分離的原因很多。目前主要原因有:遺傳搭車(chē)效應(yīng)[14-15],即在母本體內(nèi)存在使雄配子體失活的相關(guān)基因,此類(lèi)基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出來(lái)的酶或RNA等影響配子體的存活力、競(jìng)爭(zhēng)力,從而調(diào)控配子體選擇。染色體丟失,即當(dāng)物種雜交時(shí)染色體片段可能發(fā)生丟失,在同一連鎖群上所用的標(biāo)記發(fā)生偏離[16]?;ǚ圻x擇的結(jié)果,即在合子形成前柱頭與花粉之間的相互作用抑制了部分基因漂流,當(dāng)合子形成后會(huì)引起敗育,很有可能是由于結(jié)構(gòu)上存在差異或同源染色體遺傳,或者是自交引起的不親和性導(dǎo)致的主要隔離機(jī)制[17-21]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)因各種原因如試驗(yàn)環(huán)境、操作程序、試劑、儀器等也會(huì)引起誤差,導(dǎo)致譜帶清晰度差異,不同個(gè)體間譜帶缺失、譜帶辨認(rèn)模糊以及操作人員的誤判等也可能會(huì)導(dǎo)致偏分離。本試驗(yàn)中,1%水平上偏分離的標(biāo)記率為 32.00%,5%水平上比率為 12.63%,未表現(xiàn)出有較為明顯偏向親本某一方趨勢(shì)的。偏分離標(biāo)記個(gè)數(shù)分布最多的在 LG1上為23個(gè),偏分離標(biāo)記所占比例大于0.6在LG9、LG10、LG 18上,說(shuō)明在以上連鎖群當(dāng)中分布影響偏分離的遺傳因子區(qū)域可能較為廣泛存在。

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