• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    軟棗獼猴桃性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記

    2017-02-15 19:08:25李旭吳松權(quán)姜明亮樸一龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:分子標(biāo)記

    李旭+吳松權(quán)+姜明亮+樸一龍

    摘要:以軟棗獼猴桃成齡雌株、雄株葉片為試驗(yàn)材料,利用SRAP分子標(biāo)記手段及SPSS軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果表明,從初篩的80對(duì)引物中篩選出15對(duì)可穩(wěn)定擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物組合,19個(gè)雌、雄植株共得到77個(gè)條帶,多態(tài)性條帶為72個(gè),多態(tài)率達(dá)到93.50%;雌株多態(tài)性比率為68.8%,雄株多態(tài)性比率為87.0%;me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率具有明顯差異;供試的19個(gè)植株經(jīng)聚類分析分成2組,2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別?;谛詣e相關(guān)的SRAP可以有效分辨出軟棗獼猴桃雌株、雄株。

    關(guān)鍵詞:軟棗獼猴桃;雌雄異株;性別鑒定;SRAP;分子標(biāo)記

    中圖分類號(hào): Q943文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

    文章編號(hào):1002-1302(2016)08-0069-03

    軟棗獼猴桃[Actinidia arguta (Seib.et Zucc.)Plangch.ex Miq.]是獼猴桃科獼猴桃屬中水平和垂直分布最廣泛的多年生落葉藤本果樹之一[1],我國南北各地、朝鮮、日本、俄羅斯均有分布,以我國東三省資源最為豐富,其中,小興安嶺和長白山山區(qū)較為多見,是珍貴的抗寒果樹資源。軟棗獼猴桃果實(shí)富含維生素C、酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素及多種礦質(zhì)元素,具有一定的藥用價(jià)值。目前,軟棗獼猴桃作為第3代獼猴桃,受到世界各國的廣泛關(guān)注,其產(chǎn)業(yè)開發(fā)正蓬勃發(fā)展。但是,軟棗獼猴桃為雌雄異株植物,以雌株產(chǎn)果實(shí),雌株的經(jīng)濟(jì)價(jià)值明顯高于雄株,而軟棗獼獼猴桃實(shí)生苗需要5~7年才能結(jié)果,童期漫長,且實(shí)生繁殖后代出現(xiàn)雌雄比約為1 ∶[KG-*3]4的性別分離[2],不利于生產(chǎn)需要。雌雄異株和幼苗期雌雄無法辨別給軟棗獼猴桃種質(zhì)資源的改良和育種帶來巨大困難,因此,軟棗獼猴桃的性別鑒定在生產(chǎn)和遺傳育種方面有著重要的意義。

    分子標(biāo)記技術(shù)具有簡單快捷等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為植物輔助育種的重要手段。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)被應(yīng)用于植物的性別鑒定,提高了植物性別鑒定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。Michelmore等提出的群體分離分析法(BSA)是一種有效的定位基因方法[3],并據(jù)此得到了一些雌雄異株的植物性別連鎖DNA標(biāo)記;Mulcahy等在Silene latifolia中用60條隨機(jī)引物篩選到4條與性別連鎖的RAPD標(biāo)記[4];Hormaza等通過700條引物的篩選,在Pistacia vera中找到1條單獨(dú)性別連鎖的RAPD標(biāo)記[5]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)是Li等發(fā)展的新型分子標(biāo)記[6],該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)可讀框(open reading frames,ORFs)進(jìn)行特異性擴(kuò)增,具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、標(biāo)記分布均勻、多態(tài)性強(qiáng)、目的片段便于克隆等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和親緣關(guān)系等研究[7-10],而在性別決定方面僅應(yīng)用于少數(shù)幾種植物中[11-14]。利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃性別的相關(guān)特異片段研究未見報(bào)道。

    本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃的雌、雄基因組DNA差異進(jìn)行研究,以期為軟棗獼猴桃幼苗期性別鑒定、軟棗獼猴桃性別相關(guān)基因的克隆提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí),SRAP體系的建立為利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)軟棗獼猴桃進(jìn)行相關(guān)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料于2014年8月取自延邊大學(xué)野生漿果資源圃(楓林),選取生長勢(shì)一致、無病蟲害的6年生野生軟棗獼猴桃雌株、雄株,分別取其成熟葉片,用冰盒保存,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,液氮速凍。雄株取10個(gè)樣品,記為X1~X10;雌株取9個(gè)樣品,記為C1~C9。所用SRAP引物(表1),均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    采用改良的CTAB法提取軟棗獼猴桃各株基因組DNA,用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定DNA 在波長為260、280 nm處的D值,檢測(cè)其純度及濃度;用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的大小和完整性;稀釋成濃度為50 ng/μL的工作液,分裝,超低溫冰箱保存,備用。

    1.2軟棗獼猴桃的SRAP擴(kuò)增

    SRAP擴(kuò)增條件在參照鄧傳良等反應(yīng)體系[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,確定軟棗獼猴桃的SRAP-PCR反應(yīng)體系(20 μL)為:400 ng基因組DNA,2 μmol/L的正向、反向引物1.0 μL,10×buffer 2.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.4 μL,1.25 U/μL Taq酶0.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,37 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸90 s,15個(gè)循環(huán);94 ℃變性1 min,52 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。將上下游引物進(jìn)行自由組合,從80對(duì)引物組合的擴(kuò)增圖譜中篩選出帶型清晰、雌雄基因組具有明顯差異、重復(fù)性好且多態(tài)性高的引物組合。08%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果,用500萬像素?cái)?shù)碼相機(jī)拍照。

    1.3數(shù)據(jù)處理及分析

    將清晰可辨的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),弱帶中穩(wěn)定的條帶予以保留,不穩(wěn)定的條帶忽略不計(jì),計(jì)算雌、雄性別特異的條帶數(shù),樣品間同一遷移位置上的電泳條帶記為1,無則記為0。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行歐氏距離平方法聚類分析,按照Ward method離差平方建立聚類分析樹狀圖。

    2結(jié)果與分析

    2.1軟棗獼猴桃基因組的SRAP擴(kuò)增

    以構(gòu)建的軟棗獼猴桃雌、雄基因池DNA為模板,從初篩的80對(duì)引物中篩選出15對(duì)可以穩(wěn)定擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物組合。由圖1、表2可見,多態(tài)性位點(diǎn)的分子量主要分布在300~1 000 bp之間,19個(gè)雌、雄植株共得到77個(gè)條帶,多態(tài)性條帶為72個(gè),多態(tài)率達(dá)到93.50%;每對(duì)引物平均擴(kuò)增出5.13個(gè)條帶,多態(tài)性條帶數(shù)為4.80個(gè);雌株多態(tài)性比率為68.8%,雄株多態(tài)性比率為87.0%;me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率差異明顯;沒有出現(xiàn)與性別相關(guān)的特異條帶,但軟棗獼猴桃雌、雄株基因組具有較為明顯的差異性。

    2.2軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類分析

    由圖2可見,供試的19個(gè)植株共分成2大組,組Ⅰ包括8個(gè)植株,其中含有2個(gè)雄株,編號(hào)為3、8,雌株占比為7143%,組Ⅱ包括11個(gè)植株,其中含有3個(gè)雌株,編號(hào)為 17~19,雄株占比為72.73%,2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。獼猴桃為功能性雌雄異株植物,自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)能結(jié)果的雄株以來,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),獼猴桃在性別表達(dá)上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)變異,至少有6種不同的性別表現(xiàn)型[1],軟棗獼猴桃性別變異可能是造成約30%分辨不清的原因。基于性別相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃的雌株、雄株。

    3結(jié)論與討論

    SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)是對(duì)開放閱讀框進(jìn)行的特異擴(kuò)增,利用該技術(shù)對(duì)基因組擴(kuò)增所獲取的特異片段直接代表了基因的表達(dá)狀況,有利于對(duì)基因的表達(dá)及功能研究[15-18]。吳文珊等將SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于薜荔(Ficus pumila Linn.)早期性別鑒定,得到1條雌性多態(tài)性片段[19]。鄭翠芳等利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)建立了愛玉子(Ficus awkeotsang Makino.)性別相關(guān)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫,并獲得愛玉子的2個(gè)雄性特異片段[11]。Zhou等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得野牛草(Buchloe dactyloides)的1個(gè)雌性特異片段[13]。鄧傳良等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得菠菜(Spinacia oleracea L.)和萚草[Humulus scandens (Lour.) Merr.]性別相關(guān)的特異條帶[12,14]。

    本研究從80對(duì)SRAP 引物中篩選出15對(duì)多態(tài)性較強(qiáng)的引物,利用瓊脂糖凝膠電泳分離條帶,從19個(gè)供試材料中共得到77個(gè)條帶,多態(tài)性條帶為72個(gè),多態(tài)率達(dá)到93.50%;每對(duì)引物平均擴(kuò)增出的條帶數(shù)為5.13個(gè),多態(tài)性條帶數(shù)為480個(gè);雌株多態(tài)性比率為68.80%,雄株多態(tài)性比率為8700%;me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出雌株、雄株間的多態(tài)性比率差異明顯。軟棗獼猴桃性染色體的發(fā)育機(jī)制與菠菜類似[20],但并沒有出現(xiàn)如菠菜那樣的特異條帶[14],這說明軟棗獼猴桃雌株、雄株的基因組具有較為明顯的差異性。軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類分析將供試的19個(gè)植株分成2大組,組Ⅰ雌株占比為7143%,組Ⅱ雄株占比為72.73%,2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。目前,在葡萄上已經(jīng)證實(shí),性別決定基因可能與易受環(huán)境影響的一些基因發(fā)生互作[21]。因此,本研究軟棗獼猴桃存在30%性別分辨不清的原因很可能是由軟棗獼猴桃性別變異造成的,基于性別相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃雌株、雄株,雖不能達(dá)到100%的分辨,但這完全可以符合現(xiàn)階段軟棗獼猴桃性別鑒定工作的需要。

    參考文獻(xiàn):

    [1]黃宏文. 獼猴桃屬分類、資源、馴化、栽培[M]. 北京:科學(xué)出版社,2013.

    [2]Khukhunaishvili R G,Dzhokhadze D I. Electrophoretic study of the proteins from Actinidia leaves and sex identification[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2006,42(1):117-120.

    [3]Michelmore R W,Paran I,Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1991,88(21):9828-9832.

    [4]Mulcahy D L,Weeden N F,Kesseli R,et al. DNA probes for the Y-chromosome of Silene latifolia,a dioecious angiosperm[J]. Sexual Plant Reproduction,1992,5(1):86-88.

    [5]Hormaza J I,Dollo L,Polito V S. Identification of a RAPD marker linked to sex determination in Pistacia vera using bulked segregant analysis[J]. Theoretical and Applied Genetics,1994,89(1):9-13.

    [6]Li G,Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics,2001,103(2/3):455-461.

    [7]陳暉,陳美霞,陶愛芬,等. 長果種黃麻SRAP標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及3個(gè)質(zhì)量性狀基因定位[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(12):2422-2430.

    [8]Li G,Gao M,Yang B,et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theoretical and Applied Genetics,2003,107(1):168-180.

    [9]劉雅輝. 23個(gè)小麥抗葉銹病近等基因系的SRAP多態(tài)性分析及Lr19的SRAP標(biāo)記[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.[ZK)]

    [10]李梅,侯喜林,郝日明. 基于SRAP分子標(biāo)記的桂花品種親緣關(guān)系研究[J]. 園藝學(xué)報(bào),2009,36(11):1667-1675.

    [11]鄭翠芳,朱曉東,方麗娜,等. 愛玉子性別與品系的SRAP分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),2009,30(12):1740-1745.

    [12]鄧傳良,任映雪,張衛(wèi)麗,等. 葎草性別相關(guān)SRAP分子標(biāo)記的鑒定[J]. 植物研究,2014,34(6):798-802.

    [13]Zhou Y J,Wang X G,Zhang X Q. Development and application of a SRAP marker for the identification of sex in Buchloe dactyloides[J]. Euphytica,2011,181(2):261-266.

    [14]鄧傳良,曹瑩,任映雪,等. 菠菜性別相關(guān)SRAP分子標(biāo)記的篩選及分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2013,32(4):516-521.

    [15]李媛媛,沈金雄,王同華,等. 利用SRAP、SSR和AFLP標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(6):1118-1126.

    [16]劉雅輝,王秀萍,魯雪林,等. 棉花耐鹽相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(3):484-488.

    [17]劉雅輝,王秀萍,魯雪林,等. 26份棉花耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,30(1):219-221.

    [18]荊贊革,裴徐梨,唐征,等. 青花菜早中熟種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP標(biāo)記分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(1):41-43.

    [19]吳文珊,朱曉東,陳友鈴. 與薜荔性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2008,14(5):688-691.

    [20]Janick J. Inheritance of sex in tetraploid spinach[J]. Am Soc Hort Sci,1955,66:361-363.

    [21]Moore J N. Cytokinin-induced sex conversion in male clones of Vitis species[J]. Am Soc Sci,1970,95:387-393.

    猜你喜歡
    分子標(biāo)記
    蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標(biāo)記篩選與分析
    蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標(biāo)記篩選與分析
    軟棗獼猴桃性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記
    大白菜種質(zhì)資源抗根腫病基因CRa和CRb的分子標(biāo)記鑒定與分析
    玉米大斑病的研究進(jìn)展
    玉米自交系的遺傳多樣性分析及雜種優(yōu)勢(shì)群劃分
    采用基于PCR的分子標(biāo)記區(qū)分胡蘿卜育性
    分子標(biāo)記技術(shù)在植物CMS中的研究與應(yīng)用
    分子標(biāo)記在植物抗病育種中的應(yīng)用
    艾葉研究進(jìn)展概述
    久久ye,这里只有精品| 下体分泌物呈黄色| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 免费高清在线观看日韩| 美女午夜性视频免费| 亚洲三区欧美一区| 男女高潮啪啪啪动态图| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产一级毛片在线| 国产在视频线精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品一二三| 熟妇人妻不卡中文字幕| www日本在线高清视频| 国产精品人妻久久久影院| 老鸭窝网址在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产日韩欧美在线精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 26uuu在线亚洲综合色| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看免费视频网站a站| 美女视频免费永久观看网站| 9191精品国产免费久久| 91久久精品国产一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 欧美激情高清一区二区三区 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 一二三四在线观看免费中文在| 精品第一国产精品| 欧美精品一区二区大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 成年人午夜在线观看视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 在线看a的网站| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲少妇的诱惑av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 丰满乱子伦码专区| 成年人免费黄色播放视频| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品欧美亚洲77777| 最新中文字幕久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产看品久久| 18禁动态无遮挡网站| 五月天丁香电影| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 最近最新中文字幕免费大全7| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费高清在线观看日韩| 国产又色又爽无遮挡免| 乱人伦中国视频| 韩国av在线不卡| 一本久久精品| 久久影院123| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国产一区二区久久| 男女下面插进去视频免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产av一区二区精品久久| 婷婷色av中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 久久精品国产自在天天线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 婷婷色av中文字幕| 久久精品夜色国产| 日本欧美国产在线视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产成人av激情在线播放| 午夜久久久在线观看| 桃花免费在线播放| 久久精品国产自在天天线| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲成人av在线免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 18禁观看日本| 激情视频va一区二区三区| 9热在线视频观看99| 国产在视频线精品| 男男h啪啪无遮挡| 久久青草综合色| 久久热在线av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲伊人久久精品综合| 90打野战视频偷拍视频| 国产在线视频一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产看品久久| 91成人精品电影| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99久国产av精品国产电影| 91精品国产国语对白视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产激情久久老熟女| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av免费观看日本| 91国产中文字幕| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av日韩在线播放| av女优亚洲男人天堂| 午夜福利视频精品| 一区二区三区四区激情视频| 91久久精品国产一区二区三区| 有码 亚洲区| 欧美精品国产亚洲| 亚洲av福利一区| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 男女边摸边吃奶| 国产成人精品久久久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 成人亚洲欧美一区二区av| 老司机影院毛片| 看免费成人av毛片| 91精品三级在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 一二三四在线观看免费中文在| 免费观看无遮挡的男女| 男人操女人黄网站| 人妻 亚洲 视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人国产麻豆网| 在线天堂中文资源库| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产av一区二区精品久久| 人妻少妇偷人精品九色| 国产成人精品婷婷| 久久精品国产亚洲av高清一级| videos熟女内射| 午夜91福利影院| 久久这里只有精品19| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 女人精品久久久久毛片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 性少妇av在线| 亚洲av.av天堂| 亚洲综合色惰| av片东京热男人的天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲av.av天堂| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩中文字幕视频在线看片| 成人国语在线视频| xxx大片免费视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 男男h啪啪无遮挡| 99久久综合免费| 亚洲国产欧美网| 亚洲欧美清纯卡通| 久久国内精品自在自线图片| 我要看黄色一级片免费的| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久久精品性色| 欧美精品亚洲一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产男女超爽视频在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99国产综合亚洲精品| 黄频高清免费视频| 大话2 男鬼变身卡| 一级片免费观看大全| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品,欧美精品| 香蕉国产在线看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲av男天堂| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 999久久久国产精品视频| 亚洲av在线观看美女高潮| videos熟女内射| 日韩电影二区| 久热这里只有精品99| kizo精华| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品亚洲成国产av| 9热在线视频观看99| av一本久久久久| 中文欧美无线码| 五月开心婷婷网| 国产深夜福利视频在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 90打野战视频偷拍视频| 国产免费又黄又爽又色| 韩国高清视频一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久毛片免费看一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久国产一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 天堂8中文在线网| 久久午夜福利片| 人妻少妇偷人精品九色| 美女视频免费永久观看网站| 91成人精品电影| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人免费观看mmmm| www.熟女人妻精品国产| 国产成人免费无遮挡视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费看av在线观看网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产伦理片在线播放av一区| 最近中文字幕2019免费版| 国产黄色免费在线视频| 日韩伦理黄色片| 国产成人精品婷婷| 免费观看性生交大片5| 亚洲欧美清纯卡通| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产极品天堂在线| 极品人妻少妇av视频| 91久久精品国产一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 丝袜脚勾引网站| 欧美成人午夜免费资源| 日韩欧美一区视频在线观看| 九草在线视频观看| 一级,二级,三级黄色视频| 26uuu在线亚洲综合色| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久网色| 自线自在国产av| 国产精品国产av在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 性少妇av在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| www日本在线高清视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 色94色欧美一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久久久免费视频了| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久久久国产电影| 午夜免费观看性视频| 90打野战视频偷拍视频| 大香蕉久久成人网| 一本色道久久久久久精品综合| xxxhd国产人妻xxx| 九色亚洲精品在线播放| 丁香六月天网| 看免费成人av毛片| 亚洲精品自拍成人| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产毛片在线视频| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇人妻久久综合中文| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 免费大片黄手机在线观看| 国产精品 国内视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品久久久av美女十八| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 日本免费在线观看一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 搡老乐熟女国产| 曰老女人黄片| 国产日韩欧美亚洲二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 大香蕉久久成人网| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产 精品1| 人妻少妇偷人精品九色| 自线自在国产av| 老女人水多毛片| 久热这里只有精品99| 亚洲欧美精品自产自拍| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 高清在线视频一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 只有这里有精品99| 高清av免费在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜福利,免费看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美人与善性xxx| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产成人a∨麻豆精品| 婷婷色av中文字幕| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人毛片a级毛片在线播放| 七月丁香在线播放| 午夜福利视频精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成年动漫av网址| 亚洲经典国产精华液单| 五月伊人婷婷丁香| 久久青草综合色| 超碰97精品在线观看| 亚洲,欧美精品.| 超色免费av| 欧美精品av麻豆av| 久久精品夜色国产| 两个人免费观看高清视频| 成人毛片60女人毛片免费| 最近最新中文字幕免费大全7| videossex国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| av有码第一页| 欧美bdsm另类| 久久精品久久精品一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 有码 亚洲区| 免费大片黄手机在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 99热网站在线观看| 亚洲国产欧美网| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品av久久久久免费| 女人精品久久久久毛片| 婷婷色综合www| 精品少妇久久久久久888优播| 中文字幕最新亚洲高清| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲视频免费观看视频| 国产黄频视频在线观看| 综合色丁香网| 久久久久久人人人人人| 久久久国产精品麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 少妇精品久久久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久精品性色| 国产成人午夜福利电影在线观看| 大香蕉久久成人网| 久久99热这里只频精品6学生| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 九草在线视频观看| 青草久久国产| 免费观看无遮挡的男女| 自线自在国产av| 大陆偷拍与自拍| 亚洲成国产人片在线观看| 老司机亚洲免费影院| 久久婷婷青草| 最新的欧美精品一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 波野结衣二区三区在线| 成人国语在线视频| 成年人午夜在线观看视频| 两个人免费观看高清视频| 一区二区三区精品91| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久人妻| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产男人的电影天堂91| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 大香蕉久久成人网| 日日爽夜夜爽网站| 丁香六月天网| 欧美精品一区二区大全| 在线观看国产h片| 久久精品久久久久久久性| 成人免费观看视频高清| 女人精品久久久久毛片| a 毛片基地| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲av男天堂| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品少妇久久久久久888优播| 国产xxxxx性猛交| 国产麻豆69| 最近的中文字幕免费完整| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产97色在线日韩免费| 18禁动态无遮挡网站| 满18在线观看网站| 国产视频首页在线观看| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久久久久久免费av| 少妇的丰满在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 日韩一本色道免费dvd| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产最新在线播放| 欧美在线黄色| av在线观看视频网站免费| 黄色毛片三级朝国网站| 一级爰片在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 十八禁高潮呻吟视频| 天天操日日干夜夜撸| 中国国产av一级| 国产乱人偷精品视频| 永久网站在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 自线自在国产av| 国产成人精品无人区| 天美传媒精品一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 只有这里有精品99| 咕卡用的链子| 久久毛片免费看一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲国产精品999| 国产成人91sexporn| 久久人人爽人人片av| 女人久久www免费人成看片| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲成人一二三区av| 99国产综合亚洲精品| 国产视频首页在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 母亲3免费完整高清在线观看 | 97精品久久久久久久久久精品| 黄色配什么色好看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99热全是精品| 国产精品.久久久| xxx大片免费视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲国产日韩一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 9热在线视频观看99| 国产在线免费精品| 国产精品免费大片| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产高清国产精品国产三级| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产黄色免费在线视频| av电影中文网址| 热99久久久久精品小说推荐| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产亚洲最大av| 男女午夜视频在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 在线 av 中文字幕| 亚洲中文av在线| 免费av中文字幕在线| 国产乱人偷精品视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产亚洲最大av| videos熟女内射| 99久国产av精品国产电影| 1024香蕉在线观看| 中文字幕色久视频| 欧美 日韩 精品 国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国精品久久久久久国模美| 午夜福利一区二区在线看| 国产97色在线日韩免费| 国产成人欧美| 亚洲精品视频女| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日本中文国产一区发布| 多毛熟女@视频| 国产日韩欧美在线精品| 最新中文字幕久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 永久网站在线| 热re99久久国产66热| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品一区蜜桃| 观看av在线不卡| 人妻系列 视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 午夜av观看不卡| 久久人人爽人人片av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产一区二区激情短视频 | av免费观看日本| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久久久久人人人人人人| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 久久久国产一区二区| av在线老鸭窝| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人二区视频| 1024视频免费在线观看| 日本色播在线视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 大片免费播放器 马上看| 九草在线视频观看| 亚洲精品久久午夜乱码| kizo精华| av一本久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本av免费视频播放| 激情视频va一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 亚洲久久久国产精品| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久a久久爽久久v久久| 免费在线观看黄色视频的| 少妇 在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 婷婷色综合www| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久av不卡| 岛国毛片在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人一区二区在线| 精品第一国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 男女午夜视频在线观看| 久久这里只有精品19| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品乱久久久久久| 精品一区二区三卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| av有码第一页| 国产1区2区3区精品| 90打野战视频偷拍视频| 大片免费播放器 马上看| 久久女婷五月综合色啪小说| 黄色毛片三级朝国网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 在线天堂中文资源库| 高清不卡的av网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产成人精品福利久久| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av电影在线进入| 亚洲精品国产av成人精品| 国产有黄有色有爽视频|