竹蓀水提物的體外抗氧化活性研究

呂瑞 金蓮 周侯全

摘要：采用回流提取法對(duì)竹蓀中的水溶性成分進(jìn)行提取，分別測(cè)定提取物的總還原能力及對(duì)·OH、DPPH·的清除作用，并與合成抗氧化劑維生素C進(jìn)行比較。結(jié)果表明：竹蓀水提物對(duì)·OH、DPPH·具有不同程度的清除能力，但均低于維生素C。研究結(jié)果為竹蓀的抗氧化、抗衰老等作用的研究提供了一定參考。

關(guān)鍵詞：竹蓀；水提物；體外抗氧化；抗衰老作用；保健價(jià)值

中圖分類號(hào)：R284.1；S646.801 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0347-02

自由基又稱游離基，其性質(zhì)非?；顫姡芘c其他任何惰性物質(zhì)在惰性條件下發(fā)生連鎖反應(yīng)。存在于人體的自由基，在生理情況下能提高機(jī)體免疫力，而在病理情況下，則會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生不可逆的損傷，直接導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生[1]。因此，從食物中尋找安全有效的清除自由基成分，成為了人們?nèi)諠u關(guān)心的問題。

竹蓀別稱竹參、面紗菌，為鬼筆科竹蓀屬真菌，是寄生在枯竹根部的一種隱花菌類，也是一種名貴的食用菌，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、益氣補(bǔ)腦、寧神健體等功效，自古就被列為"草八珍"之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證明，竹蓀中含有能抑制腫瘤的成分[2]；另有報(bào)道指出[3]，竹蓀中富含蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素，此外還含有豐富的多糖，是難得的營養(yǎng)佳品。目前，對(duì)于竹蓀的研究多集中于對(duì)其抗菌作用的評(píng)價(jià)[4-5]以及多糖抗氧化作用的評(píng)價(jià)方面[6]，而未見關(guān)于其水溶性成分總體抗氧化作用的報(bào)道。由于竹蓀多以水溶性部位供人們食用，因此本研究以竹蓀水提物作為樣品，探索其對(duì)羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）的清除能力以及其總還原能力，以期為綜合評(píng)價(jià)竹蓀的食用、保健價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹蓀購于四川省綿陽市本地市場，經(jīng)綿陽師范學(xué)院天然藥物研究所邊清泉教授鑒定，為鬼筆科竹蓀屬植物竹蓀（Dictyophora indusiata）。

主要試劑為二苯代苦味?；杂苫―PPH·）（美國Sigma公司）、維生素C（四川科龍?jiān)噭┯邢薰荆?；硫酸亞鐵、雙氧水（30%）、鄰二氮菲、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇（95%）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為四川科倫試劑公司的分析純?cè)噭?。試?yàn)用水為1次蒸餾水。

1.2 主要儀器

主要儀器為：UV-1700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；800型高速離心機(jī)（江蘇省金壇市通濟(jì)儀器廠）；AY120 型電子分析天平（日本島津公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 竹蓀水提物的制備 將竹蓀洗凈烘干后，粉碎至過80目篩；準(zhǔn)確稱取5.000 0 g竹蓀粉末于圓底燒瓶中，加入150 mL蒸餾水（料液比1 g ∶30 mL），于95 ℃下回流提取 2 h；過濾并將濾液濃縮后，用蒸餾水配制成濃度為5 g/L的溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對(duì)照品維生素C溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.500 0 g維生素C，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得濃度為5 g/L的溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn) Fenton反應(yīng)是產(chǎn)生羥自由基的經(jīng)典反應(yīng)，其機(jī)理如下：

Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-。

此體系產(chǎn)生的·OH，可使體系中橙紅色絡(luò)合物Fe2+-鄰二氮菲被氧化為Fe3+-鄰二氮菲，致使體系顏色變淺，從而在536 nm處的最大吸收峰消失。如果在加入H2O2前加入羥自由基清除劑，則Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除，此氧化過程受到抑制，使得該吸收波長下吸光度降低不明顯，因此可以通過測(cè)定536 nm處的吸光度來判斷受試物的抗氧化能力[7]。試驗(yàn)設(shè)為5組：空白組、未損傷組、損傷組、樣參組、樣品組，對(duì)照品為維生素C。

按照表1所示加入反應(yīng)試劑，并分別加入不同體積提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），將各反應(yīng)管搖勻后，置于恒溫水浴中，于37 ℃下保溫60 min，于536 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算羥自由基清除率：

·OH清除率=（D2-D1）-（D3-D4）D0-D3×100%。

式中：D0為未損傷管吸光度；D1為樣參管吸光度；D2為樣品管吸光度；D3為損傷管吸光度；D4為空白管吸光度。

1.3.4 DPPH自由基清除試驗(yàn) 按表2的方法進(jìn)行加樣，并加入不同體積提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），于室溫下避光反應(yīng)20 min，將對(duì)照組進(jìn)行光譜掃描，以出現(xiàn)最大吸收峰的波長為測(cè)定波長。經(jīng)光譜掃描可知，DPPH自由基模型反應(yīng)中顯色產(chǎn)物的最大吸收波長為517 nm，因此選擇在517 nm下測(cè)定各組受試物的吸光度，以維生素C為對(duì)照品。

通過測(cè)定各溶液的吸光度，按下式計(jì)算自由基清除率：清除率=（D1-D2）-（D3-D4）D1-D2×100%。

式中：D1為模型組吸光度；D2為模型空白組吸光度；D3為樣品組吸光度；D4為樣參組吸光度。

1.3.5 總還原能力的測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法[8]，取不同體積（0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.2 mL）的樣品溶液于離心管中，加入2.5 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min；然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻后，于3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL 蒸餾水和1 mL 0.1% 的FeCl3溶液，混勻后反應(yīng)10 min，在700 nm處測(cè)定吸光度，并以相同濃度的維生素C水溶液作對(duì)照，每個(gè)濃度梯度樣品溶液平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹蓀水提物對(duì)·OH的清除作用

按照“1.3.3”節(jié)的方法測(cè)定各溶液吸光度，以添加樣品的體積為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)作圖，比較竹蓀提取物和維生素C對(duì)·OH的清除效果，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在所選體積范圍內(nèi)，竹蓀水提物對(duì)·OH的清除率隨著加入體積的增加而增大并最終趨于平緩，說明其藥效漸趨飽和；而同濃度的維生素C在相同條件下清除率卻有明顯的量效關(guān)系。說明相較于維生素C而言，竹蓀水提物對(duì)·OH的清除能力較弱。羥自由基是生物體內(nèi)一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，會(huì)造成機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的氧化性損傷[9]，竹蓀水提物對(duì)羥自由基的清除能力較弱也在一定程度上說明了其對(duì)抗機(jī)體生物分子的氧化性損傷能力不夠強(qiáng)，而此結(jié)果還須要進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基的清除作用

按照“1.3.4”節(jié)的方法進(jìn)行試驗(yàn)，并以等濃度的維生素C作比較，通過測(cè)定各溶液吸光度，計(jì)算出相應(yīng)濃度下的清除率，分別以加入量、清除率為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)作圖，詳見圖2。

從圖2可知，在所選的體積范圍內(nèi)，竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基的清除率有明顯的量效關(guān)系，說明竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，但其清除能力不及相同條件下等濃度的維生素C對(duì)照品。有文獻(xiàn)報(bào)道，天然抗氧化劑清除DPPH·的能力在某種程度上被認(rèn)為可以反映抗氧化劑的清除自由基總能力[10]，因此說明竹蓀水提物具有一定的自由基清除能力。

2.3 竹蓀水提物的總還原能力評(píng)價(jià)

按照“1.3.5”節(jié)的方法進(jìn)行試驗(yàn)，以吸光度為指標(biāo)評(píng)價(jià)竹蓀水提物的總還原能力，并以等濃度維生素C作對(duì)照。以加入體積-吸光度建立坐標(biāo)繪圖，得樣品和維生素C總還原能力的對(duì)比圖，詳見圖3。

從圖3可知，在試驗(yàn)水提物的體積范圍內(nèi)，總還原能力隨著加入體積的增大而增強(qiáng)，但均低于相同條件下的維生素C，說明竹蓀具有一定的還原能力，雖不及還原劑維生素C，但此結(jié)果也可再次證明竹蓀水提物具有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用回流提取法對(duì)竹蓀中水溶性成分進(jìn)行了提取，并評(píng)價(jià)了提取物的總還原能力以及對(duì)·OH、DPPH·的清除能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，竹蓀水提物的總還原能力較強(qiáng)，但其對(duì)·OH清除能力較弱，而對(duì)DPPH·的清除能力較強(qiáng)，但其清除率均不及相同條件下的還原劑維生素C。結(jié)果說明，竹蓀水提物具有一定的抗氧化能力，由于竹蓀的食用部位多為其水溶性成分，因而可推斷食用竹蓀可起到抗氧化、抗衰老等作用，但其可靠的保健作用還須進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

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