白酒細(xì)菌酒曲固態(tài)培養(yǎng)條件下B.subtilis S12產(chǎn)四甲基吡嗪的合成機(jī)制

吳建峰 ， 徐 巖

（1.江南大學(xué)，生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 漣水 223411）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪（1igustiazine），是中藥川芎治療心腦血管疾病的有效成分之一，臨床上已廣泛應(yīng)用于治療缺血性心腦血管疾病及慢性心衰、腎衰等并且取得了良好的療效。從1962年第一次報道通過微生物法生產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)開始[1]，科研工作者就開始了吡嗪類物質(zhì)合成機(jī)制的探索。到目前為止，關(guān)于吡嗪類物質(zhì)的合成機(jī)制主要有兩種：（1）對于烘焙食品，吡嗪類物作為風(fēng)味物質(zhì)，主要由糖和氨基酸類物質(zhì)通過美拉德反應(yīng)形成[2-5]。在烘焙過程中，所用基質(zhì)中的pH環(huán)境和不同的氨基酸源對吡嗪類物質(zhì)的合成與積累有重要的影響[6]；（2）對通過微生物法來合成吡嗪類物質(zhì)過程，由于發(fā)酵狀態(tài)的不同，其生產(chǎn)功能機(jī)制有比較大的差異：對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)來講，微生物通過代謝調(diào)控積累3-羥基丁酮和外加銨鹽來提高四甲基吡嗪的含量，并提出了四甲基吡嗪的代謝途徑[7-9]；而對通過微生物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪機(jī)制的研究卻進(jìn)展緩慢，雖然有很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品利用固態(tài)發(fā)酵法提高產(chǎn)品中吡嗪類物質(zhì)的含量[10]，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后加熱溫度對吡嗪類物質(zhì)的含量影響很大[11]，但是對通過發(fā)酵法生產(chǎn)包含四甲基吡嗪在內(nèi)的吡嗪類物質(zhì)的研究主要集中在通過優(yōu)化發(fā)酵條件來提高產(chǎn)量[8]，對吡嗪類物質(zhì)的形成機(jī)制研究較少，目前研究較清楚的是我國的釀醋工藝，其研究表明加熱、煎煮條件下和陳化過程所發(fā)生的美拉德反應(yīng)是香醋中川芎嗪主要來源[12]。

白酒釀造不僅是一個典型的固態(tài)發(fā)酵過程，而且是一個開放式的高溫過程：從制曲、堆積到入池發(fā)酵，各個環(huán)節(jié)都有大量微生物的參與，在工藝上，無論是醬香型酒還是芝麻香型酒，都存在高溫制曲和堆積過程，如果此過程溫度偏低，酒體中吡嗪類物質(zhì)含量下降，說明提高溫度有利于吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生。但是，在制曲過程中，自然狀態(tài)下最高溫度也只有60℃左右，而Maillard反應(yīng)產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)的的最佳溫度在120～180℃[13]。因此，關(guān)于白酒中吡嗪類化合物是否通過美拉德反應(yīng)來產(chǎn)生仍是一個頗有爭議的話題[14]。前期研究結(jié)果表明：在釀造的不同階段，細(xì)菌曲中TTMP含量最高。由于細(xì)菌曲是多菌種混合發(fā)酵過程，為簡化研究模型，作者以細(xì)菌曲中分離到的高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株B.subtilis S12為研究對象，通過用單一的B.subtilis S12模擬細(xì)菌曲培養(yǎng)過程，來實(shí)現(xiàn)探索TTMP合成機(jī)制的目的。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

2，3，5，6-四甲基吡嗪（2，3，5，6-tetramethylpyrazine），3-羥基丁酮 （3-hydroxy-2-butanone），2-乙酰基吡啶（2-acetylpyridine），庚酮（heptanone）均為色譜純，美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品；谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、乙醇和氯化鈉：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）產(chǎn)品。

1.2 菌種

B.subtilis S12：作者所在本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，加水至 1 000 mL，pH 調(diào)至 7.2，于 121℃濕熱滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉 5 g，加水至 1 000 mL，pH 調(diào)至 7.2，于121℃濕熱滅菌20 min。

麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮 700 g，花生米粉 300 g，加水1 000 mL，混勻分裝后121℃濕熱滅菌20 min。

1.4 培養(yǎng)條件

種子液培養(yǎng)條件：從新鮮斜面上挑取一環(huán)菌落至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中 （每100 mL搖瓶裝 20 mL培養(yǎng)基），于 37℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：將培養(yǎng)好的種子液，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入麩皮固體培養(yǎng)基（每250 mL搖瓶裝 50 g培養(yǎng)基）中，37℃下培養(yǎng)48 h。

1.5 3-羥基丁酮及TTMP的提取

稱取5 g樣品，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇，浸泡10 min，再超聲波處理30 min，離心，收集上清。吸取5 mL提取液到15 mL頂空瓶中，加入1.5 g NaCl和 1 μL 的庚酮（內(nèi)標(biāo)），混勻，50 ℃下萃取40 min，通過氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行3-羥基丁酮和四甲基吡嗪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，每個樣品重復(fù)3次。

1.6 粗酶液的制備

將枯草芽孢桿菌S12接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)。取培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液，8 000 r/min冷凍離心15 min，上清液作為胞外粗酶液。收集上述發(fā)酵液離心所得的菌體，生理鹽水洗滌兩次后，將其懸浮于0.2 mol/L PBS緩沖（pH 7.2）中，超聲波破碎。破碎條件為：功率300 W，破碎時間8 min，冰水浴環(huán)境，工作2 s停4 s。將破碎液12 000 r/min離心15 min，取上清液作為胞內(nèi)粗酶液。

1.7 分析方法

1.7.1 3-羥基丁酮和TTMP含量測定 3-羥基丁酮和四甲基吡嗪含量采用GC-MS進(jìn)行測定，參照優(yōu)化后的文獻(xiàn)方法[15]，進(jìn)樣口溫度為250℃，He為載氣，流量為1 mL/min。程序升溫：50℃恒溫2 min，以10℃/min的速度升溫至230℃，保持15 min。EI電離源，溫度為220℃，電子能量70 eV，掃描范圍50～500。通過建立3-羥基丁酮和四甲基吡嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。

1.7.2 蛋白酶活力測定 蛋白酶活力測定參照文獻(xiàn)方法[16]。稱取2.5 g樣品，加入50 mL緩沖液（乳酸緩沖液pH 3.0；磷酸緩沖液pH 7.5；硼砂緩沖液pH 10.5），在40℃水浴中浸出30 min，離心，收集上清液。準(zhǔn)確吸取酶浸出液1 mL，注入10 mL離心管中（一式3份），在（40℃）水浴中預(yù)熱5 min，準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)2%酪蛋白溶液1 mL，計(jì)時，保溫10 min，立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯醋酸，以沉淀多余的蛋白質(zhì)，中止反應(yīng)。15 min后離心分離（或過濾）。準(zhǔn)確吸取上層清夜1 mL，注入試管中加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液和1 mL Folin試劑，搖勻，在40℃水浴加熱20 min顯色。以空白試液為對照，在680 nm波長下測定試樣的光密度，取3次平均值。

酶活力定義為：1 g絕干樣品，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位。

1.7.3 氨基酸脫氫酶活力測定 L-谷氨酸脫氫酶活力測定[17]：以NAD+為輔酶測定GDH酶活性測定反應(yīng)體系為：6 mmol/L NAD+，100 mmol/L谷氨酸，160 mmol/L 甘 氨 酸 ，1.8 mol/L NaCl，4.2 mmol/L EDTA，pH 9.0。測定GDH催化輔酶NAD+還原所引起的光吸收值在340 nm波長處的變化。每分鐘催化1 μmol NAD+還原所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。單位酶活=酶活/蛋白濃度。

苯丙氨酸脫氫酶[18]：反應(yīng)體系為：200 μL 粗酶液加入到2 mL 20 mmol磷酸緩沖液（含0.1 mol苯丙氨酸，pH 7.0），反應(yīng)5 min后，取1.5 mL混合液，加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%FeCl3，614 nm處測定吸光值變化。每分鐘催化1 μmol苯丙氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.7.4 氨（銨）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 樣品中銨（氨）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照弓曉峰等[19]的方法。稱取1 g固體樣品于三角瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaCl溶液10 mL，振蕩30 min后，離心。吸取50 μL上清液液于25 mL比色管中，加水稀釋至20 mL左右后，加入1 mL酒石酸鉀鈉溶液，1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH溶液，充分搖動，靜置15 min后加入0.5 mL納氏試劑，邊加邊搖動，然后定容至刻度。一段時間后用分光光度計(jì)于390 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)條件下Maillard反應(yīng)對TTMP合成貢獻(xiàn)率分析

關(guān)于TTMP的合成目前有兩種機(jī)制：（1）葡萄糖和氨基酸通過Maillard反應(yīng)可以產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)[20]；（2）3-羥基丁酮和銨鹽通過化學(xué)反應(yīng)能夠產(chǎn)生TTMP，且提高溫度利于反應(yīng)的正向進(jìn)行[21]。

在細(xì)菌曲培養(yǎng)過程中，微生物生長代謝產(chǎn)生大量的熱量，如果不進(jìn)行控溫，溫度能達(dá)到近60℃，而美拉德反應(yīng)在60℃即可以進(jìn)行。作者以細(xì)菌曲培養(yǎng)模式作為研究對象，以產(chǎn)TTMP含量最高的菌株B.subtilis S12為對照，對固態(tài)制曲階段TTMP合成是否主要以Maillard反應(yīng)生成進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)分為3組，第一組在麩皮培養(yǎng)基中添加葡萄糖和氨基酸、第二組在麩皮培養(yǎng)基中添加葡萄糖和磷酸氫二銨，第三組中只接種枯草芽孢桿菌S12，作為對照。3組實(shí)驗(yàn)分別于37℃（48 h）和 37～60℃培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24 h后，60℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h），測定TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖1所示。

根據(jù)結(jié)果可知，在只加葡萄糖和氨基酸的實(shí)驗(yàn)組中TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)非常低：在37℃和37～60℃兩種培養(yǎng)模式下TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.8 mg/kg和2.1 mg/kg；葡萄和磷酸氫二銨實(shí)驗(yàn)組TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 2.4 mg/kg和 2.3 mg/kg。而在接種 B.subtilis S12后培養(yǎng)產(chǎn)生的TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)65.4 mg/kg和319.73 mg/kg，分別是葡萄糖和氨基酸組的36倍和152倍。這表明在此培養(yǎng)過程和溫度條件下，通過單純的Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，即此過程中TTMP的合成主要產(chǎn)生途徑不是Maillard反應(yīng)的結(jié)果。

圖1 不同基質(zhì)對TTMP產(chǎn)生的影響Fig.1 Effect of ground substance on TTMP synthesis

3-羥基丁酮和銨合成TTMP的時主要通過添加外加銨鹽的方式來強(qiáng)化四甲基吡嗪的合成[22-24]，這就是目前關(guān)于TTMP合成的另外一種途徑：液態(tài)發(fā)酵條件下細(xì)菌在發(fā)酵過程中首先要代謝產(chǎn)生TTMP的前體物質(zhì)3-羥基丁酮[25]，然后3-羥基丁酮和銨鹽反應(yīng)生成TTMP[26-27]。測定了B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)條件下，隨溫度和培養(yǎng)時間3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐步上升，在24 h左右達(dá)到最大值，最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5 g/kg（37℃）。此外，不同溫度下，37℃時3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，隨著溫度的升高，3-羥基丁酮合成量逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時，細(xì)菌基本不生長，幾乎檢測不到3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化。值得注意的是：24 h后℃呈下降趨勢，這主要由于一部分3-羥基丁酮合成了TTMP，同時3-羥基丁酮可在2，3-丁二醇脫氫酶作用下還原成2，3-丁二醇[28]。因此，如果可以在曲中發(fā)現(xiàn)氨（銨離子），并且能證明3-羥基丁酮和氨基酸不能反應(yīng)生成TTMP，就可以證明細(xì)菌曲中TTMP的形成應(yīng)該主要是通過3-羥基丁酮和氨（銨鹽）縮合而形成。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.2 Content of 3-hydroxy-2-butanone at different temperature

2.2 制曲過程中TTMP合成時曲中N源的存在形式及其來源

前期我們對釀酒各階段中吡嗪類物質(zhì)的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，同一培養(yǎng)溫度下，多糧曲中四甲基吡嗪含量明顯高于純小麥曲，推測這主要是多糧曲中添加了豌豆，提高氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果。Besson和Larroche等人[29-30]通過在培養(yǎng)基中外加氨基酸和銨鹽的方式來提高發(fā)酵產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的含量。為了研究TTMP合成中N的摻入方式，以3-羥基丁酮為底物（20 mg/mL），分別與氨基酸和銨鹽（磷酸氫二銨）（30 mg/mL）作用，在37℃和60℃下反應(yīng)1 h，檢測TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖3顯示，在37℃和60℃條件下，3-羥基丁酮和氨基酸反應(yīng)后幾乎檢測不到TTMP，3-羥基丁酮和銨鹽反應(yīng)后TTMP吡嗪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.8 μg/mL和516.7 μg/mL，這說明在此溫度條件下，3-羥基丁酮和氨基酸反應(yīng)不能產(chǎn)生四甲基吡嗪，而是和銨鹽（磷酸氫二銨）反應(yīng)產(chǎn)生TTMP。

圖3 氮源對TTMP合成的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the synthesis of TTMP

從圖4可知，隨著曲堆積時間的增加，曲中氨的濃度逐漸增加，在37℃條件下，氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)12 g/kg，但是60℃條件下最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)在25 h左右獲得，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5 g/kg。該結(jié)果表明：曲中存在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氨物質(zhì)。在制曲過程中沒有添加外源的氨源，因此氨的來源只能由細(xì)菌代謝產(chǎn)生。

因此，作者提出一個假設(shè)：細(xì)菌應(yīng)該是以氨基酸為底物通過脫氨作同獲得氨，然后游離態(tài)氨與3-羥基丁酮反應(yīng)進(jìn)而合成TTMP。這就需要驗(yàn)證兩個過程的存在：（1）B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)過程中將蛋白分解為氨基酸殘基；（2）氨基酸殘基在 B.subtilis S12合成的脫氨酶的作用生成氨。

圖4 枯草芽孢桿菌S12培養(yǎng)過程氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Changing profile of ammonia in bacterial qu cultured with B.subtilis S12

為驗(yàn)證以上假設(shè)的正確性，作者對B.subtilis S12的蛋白酶及氨基酸脫氫酶的酶活性進(jìn)行了測定。B.subtilis S12的蛋白酶活性的分析結(jié)果結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，在37℃條件下，B.subtilis S12的堿性蛋白酶活力最高，每克樣品中活力達(dá)到464.36 U，其次是中性蛋白酶（383.04 U/g），酸性蛋白酶活力最低（114.76 U/g）。這表明B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)過程中存在著高濃度的蛋白酶，用于實(shí)現(xiàn)將蛋白和肽段水解成氨基酸殘基。此外，與37℃相比，經(jīng)60℃作用后，蛋白酶活力明顯降低，堿性蛋白酶活力僅為37℃下的21.9%，中性和酸性蛋白酶活力也相應(yīng)的降低。這說明60℃高溫下，B.subtilis S12的蛋白酶活性受到抑制。

圖5 枯草芽孢桿菌S12蛋白酶活力Fig.5 Protease activity of B.subtilis S12

由于在對培養(yǎng)基中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定時發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸和谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，因此，作者主要測定了苯丙氨酸和谷氨酸脫氫酶活性，結(jié)果如圖6所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，37℃下谷氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶活性分別為209 U/mg和161 U/mg，而60℃下脫氫酶活性很低，說明高溫下酶的活性受到抑制。此外，通過測定B.subtilis S12培養(yǎng)過程中銨（氨）質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)，前期銨（氨）積累很少，18 h后開始大量合成，當(dāng)24 h后改為60℃培養(yǎng)，銨（氨）質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，這主要是酶活受到抑制所致。

圖6 不同溫度下氨基酸脫氫酶活性Fig.6 Activity of amino acid dehydrogenase at 37℃and 60℃

結(jié)果證明：B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)過程中首先將蛋白分解為氨基酸殘基，然后在B.subtilis S12分泌的脫氫酶作用下將氨基酸脫氫生成氨，進(jìn)而為TTMP的合成提供了充足的N源。

2.3 TTMP合成熱反應(yīng)研究

上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)過程中四甲基吡嗪是微生物代謝產(chǎn)物3-羥基丁酮和氨縮合反應(yīng)而成。但是可以明顯地發(fā)現(xiàn)：高溫能明顯強(qiáng)化3-羥基丁酮和氨縮合產(chǎn)生TTMP，這是否表明：3-羥基丁酮和氨的縮合反應(yīng)是化學(xué)縮合反應(yīng)，而不是微生物及酶參與的酶催化反應(yīng)呢。為此，以3-羥基丁酮和銨為底物，分別在不同溫度下反應(yīng)，研究溫度對TTMP含量的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 溫度對TTMP合成的影響Fig.7 Effect of temperature on TTMP synthesis

由圖7可知，隨著時間的延長，TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈增加趨勢。37℃時，TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加很慢，4 h后質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了245.34 μg；60℃作用下，TTMP反應(yīng)速率很快，1 h后達(dá)到1 594.28 μg，隨后反應(yīng)速率逐漸下降，反應(yīng)4 h后四甲基吡嗪質(zhì)量分?jǐn)?shù)是37℃下的12倍，說明3-羥基丁酮和銨離子通過非酶反應(yīng)就可以合成TTMP，且高溫下合成速率加快。

以上結(jié)果表明：在B.subtilis S12固態(tài)培養(yǎng)過程中，葡萄糖和氨基酸不能直接通過Maillard反應(yīng)合成TTMP，需經(jīng)微生物的代謝，在酶的作用下產(chǎn)生前體物質(zhì)3-羥基丁酮和氨，再進(jìn)一步縮合反應(yīng)生成TTMP，縮合反應(yīng)是一熱力學(xué)反應(yīng)。

因此，B.subtilis S12發(fā)酵中TTMP的合成是由酶與熱動力學(xué)反應(yīng)聯(lián)合作用的結(jié)果，即：第一階段，微生物生長代謝過程中，在一系列酶的作用下產(chǎn)生3-羥基丁酮和氨；第二階段，3-羥基丁酮和氨進(jìn)一步縮合生成四甲基吡嗪，此階段為熱力學(xué)反應(yīng)，高溫利于反應(yīng)的進(jìn)行。根據(jù)該結(jié)論，作者對TTMP的合成途徑進(jìn)行了構(gòu)建如圖8所示。

圖8 TTMP的酶/熱動力學(xué)耦合催化合成過程Fig.8 Synthesis of TTMP base on enzyme and thermo-kinetics coupling

2.4 B.subtilis S12產(chǎn)TTMP的原位反應(yīng)驗(yàn)證

上述結(jié)果顯示：3-羥基丁酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在24 h達(dá)到最大值，同時氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在18～24 h也有明顯的增加。因此在B.subtilis S12培養(yǎng)過程中，選擇前24 h為37℃培養(yǎng)用于實(shí)現(xiàn)前體物質(zhì)的積累；24 h后提高溫度，用于加快前體物質(zhì)的縮合反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：前24 h TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化很少，24 h后TTMP開始逐步合成；且溫度越高，TTMP生成速度越快，合成量越多；60℃下TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為307.99 mg/kg，是37℃下的5倍。在前期對菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B.subtilis S12在60℃時不能生長，如果3-羥基丁酮到TTMP合成是酶促，60℃下TTMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)該較37℃低。因此，這也進(jìn)一步說明了B.subtilis S12培養(yǎng)過程中，3-羥基丁酮和氨縮合成TTMP過程為非酶反應(yīng)。

圖9 溫度對B.subtilis S12中TTMP合成的影響Fig.9 Effect of temperature on TTMP production of B.subtilis S12

3 結(jié) 語

研究表明B.subtilis S12固體培養(yǎng)溫度下，以葡萄糖和氨基酸為底物通過Maillard反應(yīng)不能產(chǎn)生四甲基吡嗪，3-羥基丁酮和氨基酸不能合成四甲基吡嗪，只有3-羥基丁酮和氨相互作用才能合成四甲基吡嗪。

在固態(tài)發(fā)酵條件下，Bacillus subtilis S12代謝產(chǎn)生3-羥基丁酮，分泌蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，并在氨基酸脫氫酶（如谷氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶）將氨基酸脫氫得到氨，實(shí)現(xiàn)氨基酸到氨的轉(zhuǎn)化，氨和3-羥基丁酮通過縮合作用合成四甲基吡嗪，因此氨基酸脫氫酶是合成TTMP的關(guān)鍵酶。

固態(tài)條件下四甲基吡嗪的合成為兩階段酶/熱力學(xué)聯(lián)合作用過程：在第一階段在全細(xì)胞催化下細(xì)菌利用底物合成四甲基吡嗪的前提物質(zhì)3-羥基丁酮，在氨基酸脫氫酶作用下生成氨；第二階段3-羥基丁酮和氨在熱動力作用下生成四甲基吡嗪。其中溫度對第二階段TTMP合成影響很大，高溫利于反應(yīng)的進(jìn)行。

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