濃香型“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的分析研究

王國明，尹婉嬙，喬陽，李研科，李秋志，杜麗平*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.承德避暑山莊企業(yè)集團有限責任公司，河北平泉067500）

濃香型“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的分析研究

王國明1，尹婉嬙2，喬陽2，李研科1，李秋志1，杜麗平2*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.承德避暑山莊企業(yè)集團有限責任公司，河北平泉067500）

應(yīng)用液-液萃?。↙LE）法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）對濃香型山莊老酒中吡嗪類物質(zhì)進行分析，共定性了8種吡嗪類物質(zhì)，分別是2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪，并對其中6種吡嗪類物質(zhì)進行了定量分析。結(jié)果表明，2,6-二甲基吡嗪含量最高，為504.64 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量在100 μg/L以上，2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分別為33.14 μg/L、22.48 μg/L。

液-液萃??；氣相色譜-質(zhì)譜法；濃香型白酒；吡嗪類物質(zhì)

吡嗪類物質(zhì)是1、4位含兩個雜氮原子的雜環(huán)類化合物，一般具有烤香、堅果香、爆米花香、咖啡香等香味特征。白酒中的吡嗪類物質(zhì)含量甚微，大多在10-9～10-7，但是其對白酒風味起著重要的作用。特別是四甲基吡嗪，據(jù)報道是白酒中的健康成分，有抗氧化活性，具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板凝聚等作用，被廣泛用于治療心腦血管疾病[1-3]。因此，近年來對酒類中吡嗪類化合物的研究越來越多。樣品前處理方法主要有液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[4-5]和頂空固相微萃?。╤ead-space solidphase microextraction，HS-SPME）法[7-11]，樣品分析方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）法[6，12]，氣相色譜（gas chromatography，GC）法[10，13]，液相色譜（liquid chromatography，LC）法[14-15]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法[6]。

白酒中的吡嗪類物質(zhì)含量較少，對其的成分測定易受其他揮發(fā)性物質(zhì)干擾。余曉等[4]采用液液萃取法結(jié)合GC-MS，將酒樣調(diào)酸，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分水、乙醇和易揮發(fā)性成分，乙醚萃取吡嗪類成分，在兼香型白酒中定性出29種吡嗪類成分。王柏文等[5]沿用液液萃取法，結(jié)合GC-MS與氣相色譜分析-氮磷檢測器（gas chromatography-nitrogen and phosphorus detector，GC-NPD），從國井芝麻香型白酒中準確定性了14種吡嗪類化合物。王莉等[6]采用液液萃取法，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜-離子掃描聯(lián)用技術(shù)（GC/MS-SIM），直接進樣定量分析了7種白酒中4種吡嗪類物質(zhì)。

液液萃取法可以很好的去除水、乙醇和干擾測定的易揮發(fā)性成分，對吡嗪類物質(zhì)的測定更有針對性，是一種很好的方法。本實驗的目的在于研究“山莊老酒”中的吡嗪類成分，為白酒的健康成分研究補充基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究采用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-MS對濃香型山莊老酒中吡嗪類物質(zhì)進行了分析，用美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08標準譜庫定性法，保留指數(shù)定性法和標準品定性法定性了8種吡嗪類物質(zhì)，并用外標法對其中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪這6種物質(zhì)進行了定量分析。本研究補充了濃香型白酒中吡嗪類物質(zhì)的數(shù)據(jù)資料，對研究白酒的健康性具有良好意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“山莊老酒”濃香型白酒（55°）：承德避暑山莊企業(yè)集團有限責任公司；2-甲基吡嗪標準品、2,5-二甲基吡嗪標準品、2,6-二甲基吡嗪標準品、2,3-二甲基吡嗪標準品、三甲基吡嗪標準品、四甲基吡嗪標準品：美國Alfa Aesar公司；乙醚（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890A/5975CGC-MS聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：環(huán)球（香港）科技有限公司。1.3方法

1.3.1 標樣的配制

將2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪用無水乙醇按一定比例進行稀釋。配制為4個濃度梯度制定標準曲線，作為定量依據(jù)。

標樣1：2-甲基吡嗪0.28mg/L、2,5-二甲基吡嗪0.71mg/L、2,6-二甲基吡嗪13.99 mg/L、2,3-二甲基吡嗪0.17 mg/L、三甲基吡嗪1.32 mg/L、四甲基吡嗪0.75 mg/L。

標樣2：2-甲基吡嗪0.94mg/L、2,5-二甲基吡嗪2.37mg/L、2,6-二甲基吡嗪46.60 mg/L、2,3-二甲基吡嗪0.57 mg/L、三甲基吡嗪4.41 mg/L、四甲基吡嗪2.49 mg/L。

標樣3：2-甲基吡嗪2.83mg/L、2,5-二甲基吡嗪7.11mg/L、2,6-二甲基吡嗪139.90 mg/L、2,3-二甲基吡嗪1.72 mg/L、三甲基吡嗪13.22 mg/L、四甲基吡嗪7.46 mg/L。

標樣4：2-甲基吡嗪28.3mg/L、2,5-二甲基吡嗪71.1mg/L、2,6-二甲基吡嗪1 399 mg/L、2,3-二甲基吡嗪17.2 mg/L、三甲基吡嗪13.22 mg/L、四甲基吡嗪74.6 mg/L。

1.3.2 液液萃取方法

100 mL酒樣加入10 mL 11 mol/L HCl溶液，將氫離子濃度調(diào)成1 mol/L，50℃水浴條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙醇，用40 mL新重蒸的乙醚萃取3次，合并水相，用12 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至7，再用1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至10，用40 mL新重蒸的乙醚萃取3次，合并有機相，加入8 g無水硫酸鈉，干燥過夜，過濾，氮吹濃縮至0.5 mL，待GC-MS分析濃縮后酒樣中吡嗪類物質(zhì)含量。

1.3.3 色譜條件

進樣口溫度250℃，不分流模式，進樣量1 μL，色譜柱Agilent CP-Wax CB（50 m×250 μm×0.2 μm）石英毛細管柱，載氣為高純氦氣（純度＞99.999 9%），流速0.8 mL/min。升溫程序：起始溫度50℃，保持3 min，以1.5℃/min升至85℃，保持5 min，然后以5℃/min升至150℃，然后以10℃/min升至220℃，后運行溫度240℃，保持15 min，流速2 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230℃；電子轟擊能量70 eV；連接口溫度280℃；質(zhì)量掃描范圍30～500 amu。

1.3.5 定性定量方法

定性：NIST08標準譜庫定性；保留指數(shù)（retention index，RI）定性；標準品（standard，S）定性。

定量：用標準品制作標準曲線，用外標法定量。

1.3.6 計算公式

取0.1μL正構(gòu)烷烴混標進樣，運用線性升溫公式算出每種香氣化合物的保留指數(shù)（RI）值，保留指數(shù)計算公式如下：

式中：tx為分析組分出峰的保留時間，min；tn和tn+1是碳原子數(shù)為n和n+1正構(gòu)烷烴出峰的保留時間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 “山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的GC-MS分析

吡嗪混合標準品總離子流色譜圖見圖1，各吡嗪標準品標準曲線見圖2，“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖見圖3。

通過NIST08標準譜庫定性、保留指數(shù)定性和標準品定性這三種定性方法共同對濃香型“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)進行定性分析，共定性出8種吡嗪類物質(zhì)，分別為2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪。用外標法對2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪進行定量，各組分鑒定結(jié)果見表1。

由表1可知，含量最高的是2,6-二甲基吡嗪，為504.64μg/L；100 μg/L以上的有三甲基吡嗪和四甲基吡嗪，2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分別為33.14 μg/L、22.48 μg/L。2.2白酒中的吡嗪類化合物分析

余曉等[4]報道白酒中的吡嗪類化合物總量大致分為4個層次。醬香酒中吡嗪類物質(zhì)含量較高，其中茅臺酒呈特高量，總量在3200μg/L以上；郎酒等總量在2300～3700μg/L范圍；五糧液、古井貢酒等某些濃香型白酒中吡嗪類化合物總量在1 000～2 000 μg/L之間；洋河酒等濃香型白酒及清香型白酒汾酒含量較低，僅為200～540 μg/L。本研究中已經(jīng)定量出的6種吡嗪類物質(zhì)總含量為937.11 μg/L，總含量接近于余曉等[4]報道的第三層次，接近于五糧液、古井貢酒等其他濃香型白酒的水平。張艷紅等[10]測定了醬香型白酒茅臺酒和郎酒中吡嗪類物質(zhì)的含量，由測定結(jié)果也可看出，醬香型白酒中吡嗪類物質(zhì)含量較高，高于濃香型白酒，其中茅臺酒中2,6-二甲基吡嗪達790.5 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪分別達到951.1 μg/L和809.2 μg/L。喬慧等[15]測定了清香型酒和老白干香型酒中吡嗪類物質(zhì)的含量，清香型汾酒和老白干香型酒中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量均低于濃香型山莊老酒，但四甲基吡嗪的含量高于山莊老酒。據(jù)余曉等[4]報道，在濃香型白酒五糧液中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪含量都較少，2,6-二甲基吡嗪含量最高，達到376 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量也較高，均達到100 μg/L以上，且三甲基吡嗪含量高于四甲基吡嗪，該結(jié)果與“山莊老酒”中這六種吡嗪類物質(zhì)的含量規(guī)律相近。余曉等[4]的報道中還涉及到一種濃香型白酒——洋河大曲。洋河大曲中也含有山莊老酒中檢測到的8種吡嗪類物質(zhì)，不過含量均≤100 μg/L，其中2,6-二甲基吡嗪含量最高，為75 μg/L。WU J F等[9]檢測了今世緣白酒中的吡嗪類物質(zhì)，“山莊老酒”中檢測的8種吡嗪類物質(zhì)在今世緣濃香型白酒中均被檢出，在今世緣濃香型白酒中，三甲基吡嗪含量最高，超過900 μg/L，其次是吡嗪，含量超過200 μg/L。

本研究中使用了液液萃取法對酒樣進行前處理。根據(jù)吡嗪類物質(zhì)一般呈堿性的特征，根據(jù)文獻報道將酒樣調(diào)至氫離子濃度為1 mol/L，使得吡嗪類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成鹽進入水相，用濃縮加溶劑萃取的方法去除水分、乙醇和部分揮發(fā)性物質(zhì)，以防干擾測定。之后，將水相調(diào)至堿性，使已經(jīng)成鹽的吡嗪類物質(zhì)重新析出，再用乙醚萃取出來。這種方法能有效去除干擾組分，使吡嗪類物質(zhì)的分析更有針對性，能定性分析出更多的吡嗪類物質(zhì)。王柏文等[5]優(yōu)化了液液萃取的條件，研究發(fā)現(xiàn)，酒樣調(diào)酸時將氫離子濃度調(diào)至1 mol/L能得到較為穩(wěn)定和理想的實驗結(jié)果。將水相溶液回調(diào)至堿性時，堿性條件對目標化合物的影響不大。王柏文等[5]在國井芝麻香型白酒中定性出14種吡嗪類化合物，山莊老酒中檢測到的8種吡嗪類物質(zhì)在國井芝麻香型白酒中均有檢出，芝麻香型白酒中吡嗪類物質(zhì)種類比濃香型白酒更為豐富。王莉等[6]使用液液萃取法處理酒樣，定量了7種白酒中2-乙基-6-甲基吡嗪，三甲基吡嗪，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和四甲基吡嗪的含量。

3 結(jié)論

應(yīng)用液液萃取法結(jié)合GC-MS對濃香型山莊老酒中吡嗪類物質(zhì)進行分析，共定性了8種吡嗪類物質(zhì)，分別是2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪，2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪。并對其中6種吡嗪類物質(zhì)進行定量，結(jié)果表明，2,6-二甲基吡嗪含量最高，為504.64 μg/L；三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量在100 μg/L以上；2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分別為33.14 μg/L、22.48 μg/L。本研究為“山莊老酒”中健康成分的研究提供了依據(jù)，補充了濃香型白酒中吡嗪類物質(zhì)的數(shù)據(jù)資料，具有較好的參考價值。

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WANG Guoming1,YIN Wanqiang2,QIAO Yang2,LI Yanke1,LI Qiuzhi1,DU Liping2*
(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China; 2.Chengde Mountain Resort Corporation Group Co.,Ltd.,Pingquan 067500,China)

Pyrazines of Luzhou-flavor“Shan-Zhuang Lao-Jiu”were analyzed by liquid-liquid extraction coupled with GC-MS.Eight pyrazines were qualitative identified,which were 2-methylpyrazine,2,5-dimethylpyrazine,2,6-dimethylpyrazine,2,3-dimethylpyrazine,2-ethyl-6-methylpyrazine, trimethylpyrazine,2-ethyl-3,5-dimethylpyrazine and tetramethylpyrazine.Among them,six common pyrazines were quantitative analyzed.Results showed that the content of 2,6-dimethylpyrazine was the highest,which was 504.64 μg/L.The contents of trimethylpyrazine and tetramethylpyrazine were higher than 100 μg/L,and the content of 2-methylpyrazine and 2,3-dimethylpyrazine was 33.14 μg/L and 22.48 μg/L,respectively.

liquid-liquid extraction;GC-MS;Luzhou-flavor liquor;pyrazines

TS262.3

A

0254-5071（2015）04-0146-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.033

2015-03-27

天津科技大學青年教師創(chuàng)新基金（2014CXLG09）

王國明（1965-），男，高級工程師，本科，研究方向為白酒生產(chǎn)。

*通訊作者：杜麗平（1967-），女，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與分離工程。