魚(yú)藤酮建立帕金森病細(xì)胞模型的方法研究

陳春暖 陳祥榮 蔡若蔚 曹學(xué)兵 王濤

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是中老年人群中常見(jiàn)的一種神經(jīng)變性疾病，其最重要的病理變化是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性缺失和殘存神經(jīng)元中出現(xiàn)以α－突觸核蛋白（α－synuclein）為主要成分的路易小體和路易軸突。目前認(rèn)為其發(fā)生是遺傳變異、環(huán)境暴露以及年齡等多個(gè)因素相互作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制目前還不明確。為深入研究PD發(fā)病機(jī)制，建立一個(gè)好的模型至關(guān)重要，一方面可以模擬疾病發(fā)生的病理生理過(guò)程，另一方面還能驗(yàn)證疾病的發(fā)病原因。流行病學(xué)、生物化學(xué)及動(dòng)物模型研究均顯示，魚(yú)藤酮能更好地模擬PD發(fā)生［1－2］。魚(yú)藤酮通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ活性的作用，抑制線粒體呼吸鏈對(duì)氧的利用，使細(xì)胞缺氧而發(fā)揮毒性作用［3］。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y細(xì)胞系具有多巴胺能神經(jīng)元的許多特征，目前被廣泛用作PD研究的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞模型。因此，本研究選擇魚(yú)藤酮作為神經(jīng)毒素處理SH－SY5Y細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探討線粒體功能障礙導(dǎo)致PD發(fā)病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 SH－SY5Y細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心；DMEM／F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；魚(yú)藤酮、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基耦氮唑鹽（MTT）、多聚甲醛、硫磺素S（Thioflavin S）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA）、Triton－X－100均為 Amresco公司產(chǎn)品；兔抗α－synuclein購(gòu)自美國(guó)SAB公司，鼠抗β－actin購(gòu)自武漢三鷹公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗，羅丹明標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蘇木精、伊紅等購(gòu)自碧云天公司；SDS－PAGE制膠試劑盒購(gòu)自谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SH－SY5Y 細(xì)胞置于 DMEM／F12培養(yǎng)基〔其內(nèi)含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活胎牛血清，青霉素、鏈霉素終濃度均為100U／L〕中，于5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液，細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察和MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：細(xì)胞培養(yǎng)后傳代（2～3代），調(diào)節(jié)SH－SY5Y細(xì)胞密度，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（僅培養(yǎng)基，無(wú)藥物）和魚(yú)藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L、2.5 μmol／L、5.0μmol／L組五組。結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，濃度低于0.4%（體積分?jǐn)?shù)）的 DMSO對(duì)細(xì)胞無(wú)顯著影響［3－4］，魚(yú)藤酮用 DMSO溶解，使DMSO在細(xì)胞培養(yǎng)液終濃度小于0.4%（體積分?jǐn)?shù)）而未設(shè)溶劑對(duì)照組。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別加入魚(yú)藤酮使終濃度為 0.5μmol／L、1.0 μmol／L、2.5μmol／L、5.0μmol／L培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，24h和48h時(shí)于200倍倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和貼壁能力。觀察形態(tài)之后，每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min，使甲臜充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔570nm波長(zhǎng)處的吸光度〔D（λ）〕值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝藥物組D（λ）值／空白對(duì)照組D（λ）值×100%。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞α－synuclein表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和魚(yú)藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L、2.5μmol／L、5.0μmol／L組五組。細(xì)胞于5mL培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%后，更換為含有上述相應(yīng)終濃度魚(yú)藤酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用RIPA裂解液分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按體積1∶5比例加入5×Loading Buffer，95℃變性5min。SDS－PAGE制膠，上樣及電泳，轉(zhuǎn)膜，50g／L脫脂奶粉封閉1～2h。封膜，加入一抗工作液（兔抗αsynuclein：1∶200；鼠抗β－actin：1∶4000）4℃過(guò)夜。TBST洗膜加入二抗工作液（1∶5 000～1∶10 000），洗膜后ECL曝光、顯影。根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（Mr：α－synuclein 為 19 000，β－actin 為43 000）確定目的條帶位置，用圖像灰度分析軟件分析條帶的灰度值。以β－actin為內(nèi)參蛋白，將兩者灰度值比（α－synuclein／β－actin）作為α－synuclein的相對(duì)表達(dá)量，以空白對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為1，計(jì)算各魚(yú)藤酮組α－synuclein相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 HE染色觀察細(xì)胞內(nèi)包涵體的形成：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組及魚(yú)藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L組，每組設(shè)24h、48h兩個(gè)亞組。將玻片置入6孔板中，取培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)好的生長(zhǎng)融合至瓶底70%～80%的細(xì)胞進(jìn)行傳代3代，并調(diào)整SHSY5Y細(xì)胞密度約2×105／mL，取100μL接種于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，再加入培養(yǎng)基至總體積2 mL，待細(xì)胞長(zhǎng)滿玻片的70%左右，更換為含有相應(yīng)濃度魚(yú)藤酮的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)至24h和48h行HE染色，200倍光鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)嗜伊紅染色包涵體形成情況。

1.2.5 激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)α－synuclein分布變化：結(jié)合MTT結(jié)果和HE染色觀察結(jié)果，選取1.0μmol／L魚(yú)藤酮培養(yǎng)24h（魚(yú)藤酮組）進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，另設(shè)空白對(duì)照組。兩組均行細(xì)胞爬片，魚(yú)藤酮組待細(xì)胞長(zhǎng)滿玻片的70%左右給細(xì)胞換培養(yǎng)液，更換為含有1.0μmol／L魚(yú)藤酮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，兩組細(xì)胞均予4%（40g／L）多聚甲醛固定經(jīng)Triton－X－100破膜，小牛血清封閉，加入兔抗α－synuclein抗體（1∶100）4℃過(guò)夜，再加羅丹明標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶100）孵育1h，漂洗后加入Thioflavin S溶液染色，充分漂洗后在400倍激光共聚焦顯微鏡下觀察α－synuclein分布變化及聚集體形成。α－synuclein經(jīng)染色后在激光顯微鏡下呈紅色熒光，淀粉樣結(jié)構(gòu)經(jīng)Thioflavin S染色后呈現(xiàn)綠色熒光，共聚焦后呈黃色熒光為兩者共同染色，于激光共聚焦顯微鏡下觀察是否有兩者共染色陽(yáng)性聚集體形成。

上述實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間細(xì)胞存活率及α－synuclein相對(duì)表達(dá)量比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SH－SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 空白對(duì)照組24h和48h時(shí)均可見(jiàn)SH－SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)較密，神經(jīng)突起明顯且細(xì)長(zhǎng)，輕搖晃培養(yǎng)基細(xì)胞不易脫落，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在24h時(shí)，魚(yú)藤酮0.5 μmol／L組細(xì)胞突起減少；魚(yú)藤酮1.0μmol／L組細(xì)胞突起減少較0.5μmol／L組稍明顯并皺縮；魚(yú)藤酮2.5μmol／L組細(xì)胞體腫脹明顯，胞體稍腫脹；魚(yú)藤酮5.0μmol／L組細(xì)胞突起減少更明顯，圓縮細(xì)胞增多；48h與相應(yīng)濃度24h組比較，魚(yú)藤酮各組細(xì)胞突起減少及細(xì)胞腫脹、皺縮更明顯，漂浮細(xì)胞增多（圖1）。

2.2 魚(yú)藤酮對(duì)細(xì)胞活性的影響 魚(yú)藤酮0.5 μmol／L、1.0μmol／L、2.5μmol／L和5.0μmol／L組24h時(shí)細(xì)胞存活率分別為（90.76±11.60）%、（86.06±9.06）%、（83.38±10.06）%和（80.06±11.39）%，48h時(shí)細(xì)胞存活率分別為（62.06±7.13）%、（60.88±8.50）%、（56.22±6.69）%和（50.26±6.94）%。除0.5μmol／L魚(yú)藤酮組24h外，其余各魚(yú)藤酮組細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞內(nèi)α－synuclein表達(dá) 魚(yú)藤酮0.5、1.0、2.5和5.0μmol／L 組 SH－SY5Y 細(xì)胞內(nèi) α－synuclein相對(duì)表達(dá)水平分別為1.23±0.11、1.41±0.20、1.77±0.09和1.31±0.28，其中1.0μmol／L、2.5μmol／L魚(yú)藤酮組α－synuclein相對(duì)表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 不同濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)SH－SY5Y細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（倒置顯微鏡×200）

2.4 各組細(xì)胞包涵體形成觀察 光鏡下可見(jiàn)，24 h和48h時(shí)空白對(duì)照組細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)且明顯，胞核呈嗜堿性，胞質(zhì)內(nèi)未觀察到嗜酸性包涵體形成；魚(yú)藤酮0.5μmol／L組24h時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，未觀察到包涵體形成；魚(yú)藤酮1.0μmol／L組24h和魚(yú)藤酮0.5μmol／L組48h胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)邊界清楚的嗜伊紅的類路易小體樣包涵體（如箭頭所示），細(xì)胞突起較少，胞體和胞核增大，胞質(zhì)疏松；魚(yú)藤酮1.0μmol／L組4 8h時(shí)細(xì)胞體腫脹，胞質(zhì)疏松、空泡化，部分胞體變圓，核固縮的細(xì)胞明顯增加，未觀察到包涵體形成（圖3）。

圖2 不同濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)SH－SY5Y細(xì)胞中α－synuclein表達(dá)（Western blot法）

圖3 不同濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)SH－SY5Y細(xì)胞形態(tài)及包涵體形成情況（HE×400）：圖中箭頭所示為胞質(zhì)內(nèi)包涵體

2.5 魚(yú)藤酮組α－synuclein的分布 在激光共聚焦顯微鏡下，魚(yú)藤酮1.0μmol／L組24h時(shí)SHSY5Y細(xì)胞中可見(jiàn)顆粒狀α－synuclein免疫染色（紅色熒光）陽(yáng)性聚集物（白色箭頭所示），可被Thioflavin S（綠色熒光）共定位，提示這類聚集物含有β－淀粉樣結(jié)構(gòu)；空白對(duì)照組細(xì)胞可見(jiàn)α－synuclein均勻分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，呈均一染色的紅色熒光（圖4）。

3 討論

PD是由多種病因?qū)е碌膹?fù)雜疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。為更好地研究PD發(fā)病機(jī)制，研究者不斷改進(jìn)其細(xì)胞和動(dòng)物模型。目前常用的PD造模工具藥有1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine，MPTP）、6－羥多巴胺（6－h(huán)ydroxydopamine，6－OHDA）及魚(yú)藤酮［2］。在PD發(fā)病的眾多學(xué)說(shuō)中，目前證據(jù)顯示線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制是PD發(fā)病的核心機(jī)制之一，干擾復(fù)合物Ⅰ活性可以導(dǎo)致α－synuclein聚集［1，5］。魚(yú)藤酮作為殺蟲(chóng)劑和魚(yú)塘清理劑，是一種廣泛存在于自然界的環(huán)境毒素，與人們的生活密切相關(guān)且易于接觸。它正是通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ活性的作用，抑制線粒體呼吸鏈對(duì)氧的利用而發(fā)揮毒性作用。魚(yú)藤酮作為目前新型的造模工具藥受到廣泛關(guān)注［2］。魚(yú)藤酮在其誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型中，能選擇性地引起黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性，使黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)泛素和α－synuclein陽(yáng)性的包涵體，在解剖學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、行為學(xué)和神經(jīng)病理特征等方面更好地模仿PD發(fā)病機(jī)制［1］。因此，本實(shí)驗(yàn)選取魚(yú)藤酮作為神經(jīng)毒素誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元SH－SY5Y細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型。

圖4 魚(yú)藤酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)α－synuclein的分布改變（免疫熒光×400）：圖中箭頭所示綠色熒光為Thioflavin S染色陽(yáng)性聚集體，紅色熒光為α－synuclein染色陽(yáng)性聚集體，黃色熒光為兩者共染色陽(yáng)性聚集體

常用的PD急性模型由于毒物使用劑量大，往往作用很短時(shí)間如數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)就造成細(xì)胞大量死亡［6－7］。然而，在自然環(huán)境中人們很難接觸到如此高濃度的魚(yú)藤酮，且作用時(shí)間過(guò)短，與PD的慢性病程不相符，因此慢性細(xì)胞模型更具現(xiàn)實(shí)意義。Sherer等［8］用較低濃度魚(yú)藤酮（5.0nmol／L）處理SH－SY5Y細(xì)胞18d，發(fā)現(xiàn)它不僅對(duì)細(xì)胞活性影響不大，對(duì)線粒體膜電位的影響也不明顯。雖然Sherer等用可接觸劑量處理了足夠長(zhǎng)的時(shí)間，但并未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡造成明顯的影響，顯然通過(guò)延長(zhǎng)處理時(shí)間來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑诓僮魃嫌幸欢y度。為尋找合適的藥物濃度和作用時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選取不同濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)了24h和48h，分別觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞活性改變。結(jié)果顯示，魚(yú)藤酮作用細(xì)胞后細(xì)胞突起減少皺縮、細(xì)胞腫脹、圓縮，部分細(xì)胞死亡，這種改變48h組比24h組更明顯；MTT結(jié)果顯示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞活性下降，其中1.0 μmol／L及以上濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)24h和0.5μmol／L及以上濃度魚(yú)藤酮培養(yǎng)48h較空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選取不同濃度魚(yú)藤酮作用于SHSY5Y細(xì)胞24h，Western blot法檢測(cè)α－synuclein表達(dá)變化，結(jié)果顯示1.0μmol／L魚(yú)藤酮培養(yǎng)24h可引起細(xì)胞內(nèi)α－synuclein表達(dá)水平上調(diào)。既往研究結(jié)果也顯示，PD細(xì)胞和動(dòng)物模型中均觀察到αsynuclein水平上調(diào)［9－11］，本研究結(jié)果與之相符。為實(shí)現(xiàn)模型的高效性及有效性，且更好地模擬疾病的自然過(guò)程，需選擇相對(duì)低濃度及適當(dāng)?shù)臅r(shí)間建立模型。結(jié)合MTT和Western blot結(jié)果，低濃度（1.0 μmol／L）魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞24h建立模型可能更好地模擬PD病理過(guò)程。

為進(jìn)一步探討1.0μmol／L魚(yú)藤酮濃度處理SH－SY5Y細(xì)胞24h的細(xì)胞模型能否很好地模擬PD的病理改變，本研究通過(guò)HE染色、免疫熒光染色進(jìn)一步觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞改變。PD重要病理特征是殘存多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)路易小體和路易軸突，其主要成分是α－synuclein［12］。α－synuclein是一種自然伸展，無(wú)折疊構(gòu)象，在腦內(nèi)廣泛表達(dá)的小分子蛋白，α－synuclein的聚集是路易小體形成的重要環(huán)節(jié)［13］。本實(shí)驗(yàn)中，1.0μmol／L魚(yú)藤酮培養(yǎng)24h組和0.5μmol／L魚(yú)藤酮培養(yǎng)48h組，HE染色均觀察到嗜伊紅、邊界清楚的類路易小體樣包涵體；免疫熒光染色共聚焦顯微鏡下，1.0 μmol／L魚(yú)藤酮培養(yǎng)24h組中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)αsynuclein和Thioflavin S共染色陽(yáng)性顆粒狀聚集物。且蛋白電泳也顯示了該濃度魚(yú)藤酮可引起αsynuclein表達(dá)升高。這些病理改變與Lee等［14］的研究結(jié)果一致。1.0μmol／L 魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SHSY5Y細(xì)胞24h的模型中出現(xiàn)路易小體形成和αsynuclein的過(guò)表達(dá)、聚集，均提示該模型可以很好地模擬PD的病理改變。同時(shí)，HE染色也顯示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞發(fā)生核固縮，表明細(xì)胞以凋亡為主。以往研究也顯示，抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ活性可引起多種凋亡相關(guān)蛋白活化，如caspase－3、Bax、p53等表達(dá)上調(diào)，提示細(xì)胞凋亡在PD多巴胺能神經(jīng)元死亡中的重要作用，是PD發(fā)病過(guò)程中多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性的基本步驟［15－18］。本課題前期結(jié)果也顯示線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞發(fā)生早期凋亡［19］，上述結(jié)果說(shuō)明魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞活性下降并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，能夠建立多巴胺能神經(jīng)元凋亡模型，亦符合PD的病理生理過(guò)程。

綜上，本實(shí)驗(yàn)中使用1.0μmol／L魚(yú)藤酮誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y細(xì)胞24h，細(xì)胞活力明顯降低，α－synuclein水平上調(diào)，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、嗜酸性包涵體形成及α－synuclein染色陽(yáng)性聚集體形成，提示選用魚(yú)藤酮處理SH－SY5Y細(xì)胞能夠成功建立神經(jīng)元早期凋亡模型，符合PD病理改變，成功建立了PD細(xì)胞模型，為PD的神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)作用等實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，可作為探討PD發(fā)病機(jī)制的可靠模型。

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