人類Munc18－1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)和定位

吳怡 王婧 王嵐 楊衛(wèi)靜

Sec1／Munc18（SM）蛋白相對分子質(zhì)量（Mr） 為60 000～70 000，是一類與神經(jīng)遞質(zhì)分泌相關(guān)的親水性蛋白質(zhì)。SM蛋白能以多種結(jié)合方式與神經(jīng)特異性的可溶性N－乙基馬萊酰胺敏感因子（NSF）附著蛋白受體（SNARE）蛋白－Syntaxin結(jié)合，并可與SNARE復(fù)合體結(jié)合，從而參與細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過程的調(diào)控。Munc18－1也稱作p67和syntaxin結(jié)合蛋白1（STXBP1），是一種突觸前膜內(nèi)蛋白，是SM蛋白家族一員，由594個(gè)氨基酸構(gòu)成［1］，主要參與神經(jīng)突觸囊泡融合蛋白復(fù)合物的形成，在突觸小泡與突觸前膜融合過程中起重要作用［2］。Munc18－1與syntaxin結(jié)合后，能夠穩(wěn)定syntaxin的閉合構(gòu)象，進(jìn)而參與神經(jīng)遞質(zhì)的分泌調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)敲除Munc18－1，能夠?qū)е律窠?jīng)遞質(zhì)從突觸小泡釋放的功能缺失［3］，表明 Munc18－1在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)中起重要作用，這種蛋白質(zhì)功能的異?？赡軐?dǎo)致腦功能紊亂的發(fā)生。本研究旨在獲得人類 Munc18－1（hMunc18－1）全長基因序列及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位，為進(jìn)一步探討其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所扮演的角色打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 大腸桿菌DH5α感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備，非洲綠猴腎細(xì)胞COS－7細(xì)胞系為作者實(shí)驗(yàn)室保存；人胎腦 MATCHMAKER cDNA文庫、綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFPC1購自Clontech公司；PryobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA購自大連TaKaRa公司；電泳凝膠回收試劑盒購自寶信生物公司；DNA marker和protein marker購自GenScript公司；T4DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ購自NEB公司；小鼠抗人綠色熒光蛋白（GFP）單克隆抗體購自南京金思瑞公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自 GE Healthcare公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成和DNA測序由金思瑞公司完成。

1.2 方法

1.2.1 hMunc18－1全長基因擴(kuò)增及pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)設(shè)計(jì)的hMunc18－1擴(kuò)增引物，以人胎腦cDNA文庫中的cDNA為模板，以PCR方法擴(kuò)增hMunc18－1全長基因序列。引物序列：上游引物為5′－ATTCTAAGATCTATGGCCCCCATTGGC－3′，下游引物為5′－GGTGGAGAATTCATTTTAACTGCTTATTTC－3′。對擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%（質(zhì)量濃度）瓊脂糖凝膠電泳，以Lambda DNA EcoRⅠ／HindⅢ標(biāo)記作為DNA相對分子質(zhì)量（Mr）標(biāo)記，預(yù)期獲得大小約1785bp的hMunc18－1序列全長。將pEGFP－C1載體和hMunc18－1PCR片段分別用BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切后，以凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個(gè)片段用T4DNA連接酶于16℃過夜連接，取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，于37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切鑒定外源基因的插入，進(jìn)行1%（質(zhì)量濃度）瓊脂糖凝膠電泳，以Lambda DNA EcoRⅠ／HindⅢ標(biāo)記作為DNA Mr標(biāo)記，預(yù)期得到大小為4700bp的載體和大小為1785bp的基因片段。同時(shí)將重組質(zhì)粒pEGFP－h(huán)Munc18－1送到Invitrogen公司進(jìn)行測序分析，重組質(zhì)粒中的hMunc18－1測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的hMunc18－1序列100%匹配，表明構(gòu)建成功且沒有突變產(chǎn)生。

1.2.2 pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白GFP－h(huán)Munc18－1融合蛋白在 COS－7細(xì)胞的表達(dá)及定位：COS－7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞鋪于6孔板時(shí)，細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿表面積的80%～90%時(shí)，根據(jù)Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明分別進(jìn)行pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒 及pEGFP－C1真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，后者作為陰性對照。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞提取蛋白。于收集的細(xì)胞中加入RIPA裂解液，超聲5s后冰上放置30 min。4℃以12 000 g離心20min，取上清5μL進(jìn)行蛋白定量。各取30μg蛋白經(jīng)10% （質(zhì)量濃度）SDS－PAGE凝膠分離，于4℃80V2.5h轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%（質(zhì)量濃度）脫脂奶粉封閉3h，TBST洗膜。加入小鼠抗人GFP單克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠（1∶5 000）二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜。ECL顯色，發(fā)光。以 Western blot檢測pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒所表達(dá)融合蛋白 GFP－h(huán)Munc18－1的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒組預(yù)期可在Mr為94 000處出現(xiàn)條帶，轉(zhuǎn)染pEGFP－C1真核表達(dá)載體組在94 000處不能出現(xiàn)條帶。同時(shí)以GAPDH蛋白作為陽性對照。將成功構(gòu)建的pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 COS－7細(xì)胞36h后，應(yīng)用OLYMPUS FV1000S－SIM／IX81激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行掃描，激發(fā)光波長為488nm，60倍鏡下觀察，所見細(xì)胞內(nèi)綠色熒光物質(zhì)即為融合蛋白GFP－h(huán)Munc18－1，并觀察其所在位置。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%（質(zhì)量濃度）瓊脂糖凝膠電泳后獲得約為1785bp的片段（圖1）。對重組質(zhì)粒pEGFP－h(huán)Munc18－1經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切后得到約4.7kb（載體）和1785bp（基因片段）的兩條條帶（圖2），進(jìn)一步對重組質(zhì)粒pEGFP－h(huán)Munc18－1進(jìn)行hMunc18－1測序鑒定，結(jié)果顯示與NCBI數(shù)據(jù)庫中的hMunc18－1序列100%匹配。

圖1 PCR擴(kuò)增獲得hMunc18－1的基因全長電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP－h(huán)Munc18－1酶切分析結(jié)果

圖3 COS－7 細(xì)胞中融合蛋白 GFP－h(huán)Munc18－1表達(dá)（Western blot）

2.2 融合蛋白 GFP－h(huán)Munc18－1在 COS－7細(xì)胞中的表達(dá)及定位 Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒組Mr為94 000處可出現(xiàn)條帶（圖3）；轉(zhuǎn)染pEGFP－C1真核表達(dá)載體組在94 000處未出現(xiàn)條帶，在27 000處檢測到條帶（GFP蛋白）在激光共聚焦顯微鏡下可見綠色熒光物質(zhì)，主要分布在COS－7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，尤其是近細(xì)胞膜處（圖4）。

圖4 融合蛋白 GFP－h(huán)Munc18－1在 COS－7細(xì)胞內(nèi)定位：A、B分別為兩個(gè)不同細(xì)胞，靠近細(xì)胞膜處細(xì)胞質(zhì)處均可見綠色熒光物質(zhì)（免疫熒光×60）

3 討論

SM蛋白的突變會導(dǎo)致許多人類疾病，包括癲癇、炎性疾病、關(guān)節(jié)僵硬癥，以及腎功能不全等。突觸因子Munc18－1是最具特征的SM蛋白，目前已有報(bào)道Munc18－1的異常與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默?。ˋD）、癲癇等的發(fā)生密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還表明Munc18－1功能異常導(dǎo)致的行為、神經(jīng)化學(xué)、形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變與神經(jīng)分裂癥的表現(xiàn)相似，推測 Munc18－1很可能參與神經(jīng)分裂癥的發(fā)生［4］。

Munc18－1具有以下三方面的功能［5］：（1）作為syntaxin1的分子伴侶，保證syntaxin1的正確定位和表達(dá)；（2）通過促進(jìn)SNARE復(fù)合物介導(dǎo)的膜融合過程啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞胞吐；（3）促進(jìn)致密核心囊泡錨定到細(xì)胞膜。Munc18－1對于胞吐過程的調(diào)控存在兩方面相互矛盾的作用。一方面，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Munc18－1與syntaxin1結(jié)合可以穩(wěn)定syntaxin1的折疊構(gòu)象，同時(shí)還可以抑制syntaxin1與突觸小泡蛋白（synaptobrevin）和Mr為25 000的突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP－25）結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌。另一方面，體內(nèi)證據(jù)表明Munc18－1與syntaxin1結(jié)合促進(jìn)syntaxin1從高爾基復(fù)合體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且促進(jìn)syntaxin1的構(gòu)象改變，易于形成SNARE復(fù)合物，啟動(dòng)突觸小泡與細(xì)胞膜的融合［6］。

Munc18－1對于富含神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡與細(xì)胞膜的融合過程是必不可少的，其相互作用可能在蛋白融合過程中起至關(guān)重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)，通過磷酸化 Munc18－1，形成穩(wěn)定 X11－Munc18－1－Syntaxin1復(fù)合物，此復(fù)合物進(jìn)一步調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白（APP）的處理加工以及不溶性β－淀粉樣（Aβ）蛋白的產(chǎn)生，參與阿爾茨海默病的病理過程［7］。目前國外學(xué)者已經(jīng)對 Munc18－1的生物學(xué)功能進(jìn)行了一定的研究，而國內(nèi)對其研究相對較少。本文作者通過基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP－h(huán)Munc18－1，并將其轉(zhuǎn)染到 COS－7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP－h(huán)Munc18－1融合蛋白主要定位在COS－7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，尤其是細(xì)胞膜附近。這一定位特點(diǎn)與已知的hMunc18－1協(xié)助將syntaxin1輸送到細(xì)胞膜的功能正好吻合。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步提供了Munc18－1的基本生物學(xué)功能特點(diǎn)，可能為進(jìn)一步研究其復(fù)雜的生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。

GFP－h(huán)Munc18－1融合蛋白在 COS－7細(xì)胞中的成功表達(dá)，也有賴于轉(zhuǎn)染操作的成功，由于綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP－C1分子量比較大，導(dǎo)致pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒不易轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，因此融合蛋白表達(dá)量低，作者在研究過程中經(jīng)過幾次實(shí)驗(yàn)不斷調(diào)整重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染量，當(dāng)調(diào)整到LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書中所提供6孔板每孔單次可轉(zhuǎn)染DNA量的半量時(shí)，即DNA（μg）∶脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）（μL）為1∶5時(shí)，為本次實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)化比例，轉(zhuǎn)染效率最高，此時(shí)融合蛋白表達(dá)最多。另外，PCR實(shí)驗(yàn)過程中需要不斷調(diào)整退火溫度以增加產(chǎn)物的特異性，作者從60℃、55℃、52℃進(jìn)行不斷摸索，最終選擇52℃作為退火溫度，此時(shí)特異性最好，即獲得目的DNA的量最多，雜帶少。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示作者從cDNA文庫的cDNA中擴(kuò)增片段，可以嘗試溫度梯度PCR，以便快速地找出最適合的退火溫度，從而可在短時(shí)間內(nèi)對PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，大大提高PCR科研效率。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pEGFP－h(huán)Munc18－1重組質(zhì)粒，將為今后建立穩(wěn)定表達(dá)hMunc18－1的細(xì)胞模型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其相互作用蛋白，檢測其下游靶基因的表達(dá)和活性提供了一定基礎(chǔ)，并有助于研究 Munc18－1對神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，同時(shí)便于研究Munc18－1在AD、癲癇等疾病中的致病機(jī)制。

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