脫髓鞘疾病患者神經(jīng)束蛋白155抗體的表達(dá)及臨床意義

季秋虹 胡旻婧 王玉琴 柯開富

慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病（chronic inflammatory demyelinating polyradicul－oneuropathy，CIDP）、吉蘭－巴雷綜合征（Guillain－Barrésyndrome，GBS）、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）及視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）都是以脫髓鞘為特征的疾病，與自身免疫應(yīng)答密切相關(guān)。神經(jīng)束蛋白（neurofascin，NF）是神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1家族的成員，在維持郎飛結(jié)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用［1］。Lonigro等［2］在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）動物模型中檢測到NF的自身抗體，但目前對NF的特異性抗體在周圍及中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中的表達(dá)仍缺乏系統(tǒng)的臨床分析和研究。本研究擬通過ELISA法檢測脫髓鞘疾病患者血清及腦脊液中NF155的抗體水平，探討其在脫髓鞘疾病患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 選取2010－01－2014－10南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的脫髓鞘性疾病患者116例，其中包括：CIDP組23例，男13例、女10例，年齡19～75歲，平均（45.6±13.9）歲，符合INCAT診斷標(biāo)準(zhǔn)；GBS組63例，男38例、女25例，年齡17～69歲，平均（43.6±12.6）歲，符合Asbury診斷標(biāo)準(zhǔn)。其他脫髓鞘疾?。∣D）組30例，男13例、女17例，年齡20～65歲，平均（42.8±13.2）歲，其中包括MS 24例（按 McDonald標(biāo)準(zhǔn)確診），NMO 6例（均符合2006年Wingerchuk修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)）。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病（neurodegenerative diseases，ND）組33例，男16例、女17例，年齡30～71歲，平均（46.6±16.3）歲，其中帕金森病（Parkinson disease，PD）8例，符合英國腦庫帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)動神經(jīng)元疾病（motor neuron disease，MND）15例，遺傳性共濟(jì)失調(diào)10例。對照組分為兩部分，血液標(biāo)本取自同一時期作者醫(yī)院體檢中心的健康志愿者36名，男20名、女16名，年齡23～66歲，平均（41.9±13.8）歲；腦脊液標(biāo)本取自6例闌尾炎外科手術(shù)腰椎局麻患者及6例血管性頭痛患者，其中男7例、女5例，年齡26～71歲，平均（43.8±15.8）歲，12例患者均排除脫髓鞘疾病可能。五組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清及腦脊液樣本采集：各組患者均于入院次日空腹采靜脈血，GBS患者起病2周后行腰椎穿刺，其他組患者入院3d內(nèi)行腰椎穿刺，腦脊液送常規(guī)檢查及蛋白質(zhì)、糖和氯化物，MS及NMO患者查腦脊液IgG寡克隆帶。對照組健康志愿者于體檢中心空腹采血，對照組腦脊液取自闌尾炎外科手術(shù)腰麻患者及血管性頭痛患者。各組留取血清及腦脊液標(biāo)本于－80℃凍存，用于ELLSA檢測。

1.2.2 ELISA 法檢測 NF155抗體：采用5μg／mL的 NF－155（R＆D）包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃孵育過夜，隨后用1%（質(zhì)量濃度）BSA每孔200μL 37℃封閉1h。在包被好的酶標(biāo)板中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，1∶200稀釋的血清，腦脊液原液和作為空白對照的1%（質(zhì)量濃度）HSAPBS，每孔100μL，37℃孵育1.5h。PBS洗3次后加 HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體100μL／孔，37℃孵育1h，PBS洗3次后每孔加入100μL顯色劑，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15min后每孔加50μL終止劑，振蕩混勻后以酶標(biāo)儀檢測450nm的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的濃度曲線，分別計算各組樣本中NF155抗體的濃度。

1.2.3 神經(jīng)電生理檢測：CIDP和GBS患者應(yīng)用丹麥Medtronic型肌電圖儀進(jìn)行檢查，體表電極刺激并記錄正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)運(yùn)動傳導(dǎo)速度、復(fù)合肌肉動作電位和末端運(yùn)動潛伏期，順向傳導(dǎo)法記錄正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)、腓腸神經(jīng)的感覺傳導(dǎo)速度、感覺神經(jīng)動作電位、F波潛伏期和出現(xiàn)率。

1.2.4 腓腸神經(jīng)活檢：對懷疑CIDP但電生理檢查結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的3例患者，在簽署知情同意書后行左腓腸神經(jīng)活檢：均于局麻下于外踝后方取腓腸神經(jīng)約1.0cm。（1）神經(jīng)組織三色染色：冷凍切片20張，片厚10μm，亮綠－變色酸2R－磷鎢酸對切片染色，每張觀察5個視野。（2）透射電鏡觀察：4%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片（70nm）10余張，醋酸鈾染，枸櫞酸鉛復(fù)染，JEM－1230透射電鏡觀察髓鞘和軸索超微結(jié)構(gòu)并拍照。（3）免疫熒光染色：冷凍切片2張，片厚10μm，一抗為兔抗人S－100多克隆抗體和小鼠抗人神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF），二抗分別為山羊抗兔IgGTRITC和山羊抗小鼠IgG－FITC，一抗、二抗均由Sigma公司孵育。400倍熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)組織病理學(xué)改變情況并拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析one－way ANOVA，兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液檢查 CIDP組細(xì)胞數(shù)0～10個，蛋白質(zhì)0.75～2.32g／L，91%（21／23）有細(xì)胞－蛋白分離現(xiàn)象。GBS組細(xì)胞數(shù)0～40個，蛋白質(zhì)0.5～2.0g／L，93%（59／63）有細(xì)胞－蛋白分離現(xiàn)象。OD組細(xì)胞數(shù)0～26個，蛋白質(zhì)0.65～1.32g／L，96%（29／30）CSF－IgG 寡克隆帶陽性。ND組細(xì)胞數(shù)0～10個，蛋白在正常范圍內(nèi)。對照組結(jié)果正常。

2.2 電生理檢查 23例CIDP和63例GBS患者均行神經(jīng)電生理檢測，結(jié)果均顯示有周圍神經(jīng)脫髓鞘性損害和／或軸索損害。23例CIDP患者共測定運(yùn)動神經(jīng)138條，感覺神經(jīng)106條。運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MCV）減慢66條，復(fù)合肌肉動作電位（CMAP）波幅降低35條，末端運(yùn)動潛伏期（DML）延長38條。感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SCV）減慢36條，未引出15條，感覺神經(jīng)動作電位（SNAP）波幅降低25條，3例出現(xiàn)傳導(dǎo)阻滯，23例均有F波潛伏期延長或消失。63例GBS患者共測定運(yùn)動神經(jīng)358條，異常295條，感覺神經(jīng)186條，SCV減慢83條，伴波幅減慢65條，62例有F波潛伏期延長或消失。

2.3 CIDP患者腓腸神經(jīng)病理表現(xiàn) 神經(jīng)組織三色染色顯示：髓鞘軸索均腫脹，膠原纖維明顯增生（圖1A），施蘭切跡密度大，結(jié)締組織增生，提示慢性炎性反應(yīng)（圖1B）；電鏡下可見部分有髓纖維髓鞘退變，板層結(jié)構(gòu)松散，成剝離的洋蔥皮樣結(jié)構(gòu)（圖1C），髓鞘的板層狀結(jié)構(gòu)扭曲變形，板層結(jié)構(gòu)松解，破裂、軸索破壞（圖1D）；NF染色顯示軸突斷斷續(xù)續(xù)，表達(dá)不完整（圖1E）。免疫熒光染色顯示雪旺細(xì)胞S－100陽性區(qū)域變?。▓D1F）。

圖1 CIDP患者腓腸肌神經(jīng)病理表現(xiàn)：三色染色（bar＝10 μm）顯示髓鞘軸索均腫脹，膠原纖維明顯增生（A），施蘭切跡密度大，結(jié)締組織增生（B）；電鏡（bar＝2μm）下可見部分有髓纖維髓鞘退變，板層結(jié)構(gòu)松散，成剝離的洋蔥皮樣結(jié)構(gòu)（C），電鏡下可見髓鞘的板層狀結(jié)構(gòu)扭曲變形，板層結(jié)構(gòu)松解，破裂、崩解、軸索裸露（D）；NF染色（bar＝10μm）可見軸突斷斷續(xù)續(xù)，表達(dá)不完整（E）；免疫熒光染色（bar＝10μm）顯示S－100蛋白陽性區(qū)域變薄（F）

2.4 NF155抗體測定 具體結(jié)果見表1。各組血清及腦脊液NF155抗體水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。CIDP、GBS和OD組血清及腦脊液中NF155抗體水平均較ND組及對照組增高（P＜0.01），但CIDP、GBS和OD組三個脫髓鞘疾病組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），ND組與對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 抗NF155抗體在各組脫髓鞘疾病患者及對照組血清和腦脊液中的表達(dá) （）

表1 抗NF155抗體在各組脫髓鞘疾病患者及對照組血清和腦脊液中的表達(dá) （）

注：CIDP：慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，GBS：吉蘭－巴雷綜合征，OD：其他脫髓鞘疾病，ND：神經(jīng)系統(tǒng)變性疾??；a：對照組中血液標(biāo)本對照36例，腦脊液標(biāo)本對照12例；與對照組及ND組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

血清 腦脊液CIDP組 23 0.69±0.4＊＊ 0.45±0.18組別 n＊GBS組 63 0.62±0.42＊＊ 0.46±0.22＊＊OD組 30 0.50±0.33＊ 0.43±0.22＊ND組 33 0.34±0.14 0.27±0.18對照組 36／12a 0.35±0.17 0.27±0.16 F值0.001 0.006 8.12 3.82 P值 ＜

3 討論

免疫介導(dǎo)的脫髓鞘性疾病的發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚。由于缺乏明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)和可靠的血清學(xué)試驗(yàn)作為脫髓鞘疾病特異性診斷指標(biāo)，其發(fā)病率有可能被低估。無論選擇目前的哪種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床診斷，仍有部分患者因漏診而不能得到及時、有效的治療。已有的有研究提示，針對郎飛結(jié)的自身抗體可能是致病的重要原因。在一些自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，朗飛結(jié)區(qū)、結(jié)側(cè)區(qū)、近結(jié)側(cè)區(qū)的分子都有可能成為自身抗體的靶抗原［3］。

NF屬于免疫球蛋白超家族，有NF155和NF186兩種亞型。NF155位于郎飛結(jié)側(cè)區(qū)膠質(zhì)環(huán)中，使接觸蛋白相關(guān)蛋白（Caspr）和接觸蛋白（contactin）在結(jié)側(cè)區(qū)聚集，形成間隔樣連接，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞黏附和軸突生長［4］。NF186位于郎飛結(jié)和軸突起始段，抑制細(xì)胞黏附和軸突增生。兩者在神經(jīng)發(fā)育及維持膠質(zhì)細(xì)胞和軸索結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的過程中發(fā)揮重要作用［5］。

本研究采用ELISA法檢測了CIDP、GBS、MS和NMO患者血清及腦脊液中NF155抗體水平，并與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病患者及健康對照者進(jìn)行比較，結(jié)果顯示脫髓鞘疾病患者血清和腦脊液中NF155抗體水平均較神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病患者及對照者明顯增加（P＜0.01），這與 Yan等［6］和Mathey等［7］的研究結(jié)果一致。此前的研究發(fā)現(xiàn)NF的單克隆抗體可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型的軸索損害［7］，海馬腦片的體外培養(yǎng)模型也證實(shí)NF抗體以補(bǔ)體依賴性方式抑制軸突傳導(dǎo)［5］，因此，NF可能是自身抗體介導(dǎo)軸索損害的靶抗原?？筃F155的抗體通過阻止結(jié)側(cè)區(qū)膠質(zhì)環(huán)的核心結(jié)構(gòu)Caspr／contactin／NF155復(fù)合物形成，進(jìn)而抑制髓鞘形成［8］。Yan等［6］的研究證實(shí) GBS和CIDP患者血清NF155抗體水平增高，并通過動物模型驗(yàn)證NF155抗體結(jié)合在郎飛結(jié)，促進(jìn)補(bǔ)體沉積，導(dǎo)致電壓門控鈉通道和郎飛結(jié)的結(jié)構(gòu)被破壞。對血清NF155抗體的研究，不僅有助于增進(jìn)對脫髓鞘疾病的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，也可能為脫髓鞘疾病的臨床診斷和治療提供了新的思路和途徑。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，脫髓鞘疾病患者血清及腦脊液中存在著高水平的NF155抗體，且各脫髓鞘疾病組間血清及腦脊液中NF155抗體的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)合已有的報道，提示NF可能是一種普遍存在于自身免疫性脫髓鞘疾病的靶抗原，可能參與了與中樞和周圍神經(jīng)脫髓鞘疾病的病理生理過程。但由于本研究為小樣本探討，能否將NF155抗體作為脫髓鞘疾病診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣例深入地進(jìn)行研究。

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