水煮加熱蝦肉蛋白變化研究

李曉龍,劉書成,解萬翠,吉宏武,毛偉杰

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,廣東湛江 524088)

水煮加熱蝦肉蛋白變化研究

李曉龍,劉書成,解萬翠,吉宏武,毛偉杰*

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產(chǎn)品深加工重點實驗室,廣東湛江 524088)

水煮加熱是熟蝦制品加工中一種常用手段。為了研究水煮加熱蝦肉蛋白變性和分子間作用力的變化規(guī)律,測定了80、90、100 ℃三種加熱溫度條件下蝦仁的中心溫度、蛋白各組分含量、溶解度、總巰基含量和Ca2+-ATPase活性變化。結(jié)果表明,溫度越高,蛋白組分含量變化越明顯(p<0.05);80 ℃加熱條件下離子鍵和氫鍵變化最為明顯,終點含量明顯低于90、100 ℃加熱(p<0.05);溫度對疏水作用的影響大小為90 ℃>100 ℃>80 ℃;不同加熱條件下,總巰基含量和Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢,最終趨近于0,100 ℃加熱條件下兩者變化最為顯著。

水煮,蝦肉,蛋白變化,總巰基

蝦肉蛋白質(zhì)含量高,營養(yǎng)豐富,味道鮮美,深受人們喜愛。蝦是一種季節(jié)性的水產(chǎn)品,價格隨季節(jié)波動較大且易腐敗,為了提高蝦的經(jīng)濟價值,避免資源浪費,需要對生鮮蝦進行加工,目前蝦的冷凍加工品較多,但是熟蝦制品還比較少,為保證蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,方便人們的生活,開發(fā)熟制蝦品具有廣闊的市場前景。

水煮加熱是蝦類熟制品加工中的一種常用手段。水煮加熱條件會對水產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。適當?shù)臒崽幚碛兄谒a(chǎn)品品質(zhì)的提高[1],一方面有助于水產(chǎn)品風味[2]、色澤和質(zhì)構(gòu)[3]的形成,但過度加熱會導致肌肉持水能力降低,質(zhì)構(gòu)及風味變差[4],水產(chǎn)品性質(zhì)的改變多由蛋白質(zhì)變性引起,蛋白的變性程度是影響熱加工后品質(zhì)變化的主要因素。

肌肉蛋白質(zhì)的構(gòu)象是通過離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵、范德華力等化學作用力來穩(wěn)固的[5]。水煮加熱過程中,分子間作用力發(fā)生改變,結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白發(fā)生聚集變性,最終體現(xiàn)為蛋白物理或者化學性質(zhì)的改變。目前,魚、蝦、貝類等蛋白的熱變性研究主要集中失水率、質(zhì)構(gòu)等物理變化,對于熱處理過程中的蛋白質(zhì)變化多將肌原纖維蛋白[6]、肌漿蛋白[7]、肌動球蛋白[8]等提取出來進行研究,姚磊等[6]研究發(fā)現(xiàn)總巰基含量和Ca2+-ATPase活性和蛋白質(zhì)變性程度密切相關(guān)。單一的蛋白變化無法全面反映整體蛋白的變化過程。而在熟蝦制品加工過程中,多以整只蝦或蝦仁為原料,因此,對加熱過程中全蛋白的變化進行研究更有現(xiàn)實意義。

目前,對水煮加熱過程中蝦肉蛋白質(zhì)變性規(guī)律和內(nèi)部化學鍵的變化的研究還較少。本研究主要針對不同的水煮加熱條件下蝦肉蛋白質(zhì)的組分、溶解度、總巰基含量和Ca2+-ATPase活性進行研究,探討其水煮加熱條件下變化規(guī)律,為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍基圍蝦(Metapenaeusensis)仁 (6.52±0.37)g/只,體長(6.81±0.47)cm，購于國聯(lián)水產(chǎn)有限公司;氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、尿素和氯化鈉 廣州化學試劑廠,分析純;ATPase測試試劑盒 南京建成生物工程研究所;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) Sigma公司。

ES-C300A電子天平 湘儀天平儀器有限公司;恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠;VX5000R無紙記錄儀 杭州盤古自動化系統(tǒng)有限公司;Philips 2860 打漿機 珠海菲利普家庭電器有限公司;高速臺式離心機 湛江裕鑫實業(yè)有限公司;UV757T紫外可見分光光度計 上海江岳儀器儀表有限公司;凱氏定氮裝置 林達化學儀器公司;均質(zhì)機 順城儀器設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將冷凍蝦仁從冷柜取出,置于4 ℃冰箱解凍12 h,備用。恒溫水浴鍋溫度分別設置為80、90、100 ℃,原料與水比例為1∶10,將無紙記錄儀溫度探針插入蝦仁第二腹節(jié)中心,當中心溫度達到25、35、45、55、65、75 ℃時迅速取出樣品,置于封口袋中冰水冷卻30 min,備用,未處理蝦仁作為對照樣品。每隔10 s記錄樣品中心溫度變化。

1.2.2 蛋白各組分含量變化測定 將制備的樣品用打漿機打成肉糜狀。準確稱取蝦肉1.00 g,加入15 mL磷酸鹽緩沖液A(3.5 mol/L KH2PO4,15.6 mmol/L Na2HPO4,pH 7.0),20000 r/min 條件下均質(zhì)1 min,4 ℃條件下7500 r/min離心30 min,收集上清液,重復三次,上清液即為水溶性蛋白溶液,向離心后的沉淀中加入磷酸鹽緩沖液B(0.45 mol/L KCl,3.5 mol/L KH2PO4,15.6 mmol/L Na2HPO4,pH 7.0),20000 r/min 均質(zhì)1 min后7500 r/min,4 ℃離心30 min,收集上清液,重復三次,即為鹽溶性蛋白溶液,沉淀為不溶性蛋白[9]。蛋白含量測定采用凱氏定氮法,平行測定三次。

1.2.3 蛋白溶解度變化測定 根據(jù)Liu[10]的測定方法,稍加修改。分別稱取蝦肉1.00 g,加入25 mL SA(0.05 mol/L NaCl)、SB(0.6 mol/L NaCl)、SC(0.6 mol/L NaCl,1.5 mol/L Urea),SD(0.6 mol/L NaCl,8 mol/L Urea)。冰水浴20000 r/min勻漿2 min,4 ℃條件下7000 r/min離心15 min,福林酚法測各溶液中蛋白濃度,平行測定三次。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性測定 酶活測定利用南京建成生物工程研究所ATPase測試試劑盒測定,ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷。因此,測定結(jié)果用每小時每毫克組織蛋白中ATPase酶分解ATP產(chǎn)生無機磷的量表示,即微摩爾分子磷/毫克蛋白/小時(μmol Pi/mgprot/h)。

1.2.5 總巰基含量測定 總巰基測定采用Jiang[11]的方法,稍加修改。吸取1 mL 1.2.2中鹽溶性蛋白溶液,加入3 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(8 mol/L Urea,10 mmol/L EDTA,2% SDS,pH 6.8)?；旌暇鶆蚝蠹尤?.4 mL 0.1% DTNB(0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.0)。置于40 ℃溫水浴中25 min,412 nm 測其吸光度,平行測定三次?？値€基含量用公式1計算。

總巰基含量(mol/105g)

=A×D/(13600 L·mol-1·cm-1×C)

式(1)

A為吸光度,D為稀釋倍數(shù),13600 L·mol-1·cm-1為分子吸光系數(shù),C為蛋白濃度(mg/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用JMP 7.0.2和Excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計。數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,組間分析采用t-檢驗,p<0.01為極顯著,p<0.05為顯著,p>0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱條件下蝦仁中心溫度變化

蝦肉蛋白變性的程度受加熱溫度和加熱時間的影響。為了最大限度地保持肉原有的營養(yǎng)及風味,殺滅大多數(shù)微生物,設置中心溫度達到75 ℃為加熱終點[12]。如圖1所示,未經(jīng)熱處理的蝦肉初始中心溫度均控制在10 ℃左右,隨著加熱的溫度越高,蝦仁中心溫度變化越快,100 ℃加熱條件下,中心溫度達到75 ℃只需70 s。100 ℃加熱時,中心溫度的上升速度與加熱時間接近于9∶10的比例關(guān)系,而80、90 ℃加熱時在中心溫度達到40 ℃之前升溫速度與加熱時間分別接近于1∶1、4∶5的正比例關(guān)系,之后增長趨勢緩慢。

圖1 80、90、100 ℃水煮加熱蝦仁中心溫度變化Fig.1 Changes of shrimp central temperature during80,90 and 100 ℃ boiled

2.2 蛋白含量變化

蝦肉蛋白主要有水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白構(gòu)成。水溶性蛋白主要成分為肌漿蛋白,鹽溶性蛋白成分主要為肌原纖維蛋白,不溶性蛋白包括肌基質(zhì)蛋白和熱處理后的變性蛋白[13]。如圖2中所示,未處理樣品水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白的含量分別為5.89%±0.25%、11.04%±0.18%、1.57%±0.05%,隨著加熱的進行,水溶性蛋白和鹽溶性蛋白逐漸減少(p<0.05),不溶性蛋白含量增加(p<0.05)。加熱的溫度越高,變化越明顯(p<0.05)。

圖2 80、90和100 ℃加熱條件下蛋白組分含量變化Fig.2 Contents change of protein components during80,90 and 100 ℃ boiled

如圖2a所示,80 ℃加熱前期水溶性蛋白含量變化差異不大(p>0.05),加熱終點含量明顯下降(p<0.05),但仍高于90 ℃和100 ℃加熱。如圖2b所示,在中心溫度達到65 ℃以后繼續(xù)加熱,鹽溶性蛋白含量變化不再顯著(p>0.05)。通過對比可以發(fā)現(xiàn),鹽溶性蛋白在加熱初期變化比較明顯(p<0.05),而水溶性蛋白含量下降較為緩慢,說明鹽溶性蛋白變性溫度要低于水溶性蛋白,這與Belibaghet等人的研究結(jié)果吻合[14]。在不同加熱溫度下,蛋白含量變化程度不同。100 ℃加熱條件達到不同中心溫度時,水溶性蛋白和鹽溶性蛋白含量變化最為明顯(p<0.05),加熱溫度高更容易引起水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的變性。袁莉莉?qū)ξr肉糜升溫過程中蛋白質(zhì)種類及含量變化進行了研究,結(jié)果表明水溶性蛋白和鹽溶性蛋白受熱含量減少,不溶性的蛋白含量升高,熱處理過程中水溶性和鹽溶性蛋白發(fā)生共價鍵交聯(lián),形成了高分子量的蛋白質(zhì)聚集體,生成了不溶性的蛋白[15]。

2.3 蛋白溶解度變化

蛋白的空間結(jié)構(gòu)決定了蛋白的物化性質(zhì),當?shù)鞍资艿轿锢怼⒒瘜W等因素的作用時,空間結(jié)構(gòu)受到破壞,發(fā)生重組、聚集,分子間作用力也會經(jīng)歷斷裂、重新形成的過程。蛋白溶解度和分子間作用力有密切的關(guān)系。蛋白的溶解是同溶劑之間的相互作用[16],蛋白的溶解度是蛋白的一種重要功能性質(zhì),也是反應蛋白變性程度的一個重要指標,通過測定蛋白在不同溶液中的溶解度,可以反應相應分子間作用力的變化。

如圖3所示,用SB溶液和SA溶液的蛋白濃度差表示離子鍵變化,SC溶液和SB溶液蛋白濃度差表示氫鍵變化,SD溶液和SC溶液蛋白濃度差表示疏水相互作用的變化[10]。蝦肉蛋白質(zhì)的離子鍵和氫鍵從10 ℃到75 ℃熱處理過程中顯著降低(p<0.05),疏水作用升高趨勢明顯(p<0.05)。溫度對蛋白質(zhì)分子間作用力的影響程度不同。從圖3a中可以看出,加熱溫度升高,離子鍵含量反而下降較為緩慢,溫度較低的情況下,氫鍵含量變化顯著(p<0.01)。對于氫鍵變化,80 ℃加熱初始階段氫鍵含量降低明顯(p<0.01),加熱終點含量最低,其次為100、90 ℃加熱,這可能是因為加熱條件下蛋白受熱變性,離子鍵和氫鍵斷裂,含量降低,而在90 ℃和100 ℃加熱條件下,離子鍵和氫鍵重新形成,生成穩(wěn)定的蛋白構(gòu)象。溫度對疏水作用的影響為90 ℃>100 ℃>80℃。100 ℃加熱條件下疏水作用小于90 ℃加熱,有可能是因為100 ℃加熱溫度較高,蛋白形成凝膠以后發(fā)生劣化,降低了其疏水作用。分子間作用力和蝦仁的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)緊密相關(guān),控制加熱條件和蛋白分子間作用力的變化,對提高熟蝦制品的品質(zhì)有著重要的意義。

圖3 80、90、100 ℃加熱條件下蛋白質(zhì)在不同溶液中溶解度差變化Fig.3 Difference of protein solubility indifferent solution during 80,90 and 100 ℃ boiled

2.4 總巰基含量變化

如圖4所示,三種熱處理條件下,總巰基含量下降。蝦仁中心溫度達到45 ℃之前,巰基含量變化明顯(p<0.01),中心溫度達到45 ℃后,隨著加熱的進行,巰基含量沒有顯著變化(p>0.05)。Wang等人[7]測定了冰凍鯉魚肌原纖維蛋白從20 ℃加熱到80 ℃的總巰基含量變化,發(fā)現(xiàn)當中心溫度達到45 ℃以后,總巰基含量變化不明顯。

圖4 80、90、100 ℃加熱條件下巰基含量變化Fig.4 Contents change of total thiol group during80,90 and 100 ℃ boiled

蛋白變性的過程涉及到巰基和二硫鍵的轉(zhuǎn)化。熱處理過程中,蛋白的空間結(jié)構(gòu)受到破壞,蛋白結(jié)構(gòu)打開,隱藏在分子內(nèi)部的巰基基團暴露出來,氧化形成二硫鍵,巰基基團數(shù)量減少,導致ATPase活性降低[17]。因此,總巰基含量可一定程度上反映蛋白變性程度的大小。

2.5 Ca2+-ATPase活性變化

研究表明,在冷藏和熱處理過程中,Ca2+-ATPase活性都會有不同程度的降低。Ca2+-ATPae存在于組織細胞及細胞器的膜上,是生物膜上的一種蛋白酶,它在物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要作用。Ca2+-ATPase活性主要與肌球蛋白球狀頭部結(jié)構(gòu)有關(guān),肌球蛋白球狀頭部命名為SH1、SH2的巰基基團被證實與ATPase活性有關(guān),Ca2+-ATPase活性和巰基數(shù)量有一定的聯(lián)系[18]。

Ca2+-ATPase活性下降的快慢主要和肌球蛋白的變性程度有關(guān),肌球蛋白與蝦仁的持水能力密切相關(guān)[19]。肌球蛋白變性程度越快,Ca2+-ATPase活性下降越明顯,如圖5所示,隨著加熱的進行,Ca2+-ATPase活性呈下降趨勢。其中,和80 ℃水煮加熱條件相比,90、100 ℃加熱條件下,Ca2+-ATPase活性下降更快(p<0.05)。當蝦仁中心溫度在10～45 ℃區(qū)間內(nèi),Ca2+-ATPase活性在溫度較高的加熱條件下變化顯著(p<0.05),之后變化趨于平緩(p>0.05)。雖然加熱過程中,酶活性變化程度不同,但加熱終點含量區(qū)別不明顯(p>0.05),趨近于零。

圖5 80、90和100 ℃加熱條件下Ca2+-ATPase活性變化Fig.5 The activity changes of Ca2+-ATPase during80,90 and 100 ℃ boiled

3 結(jié)論

水煮熱處理作為一種經(jīng)濟實用的加工方式,廣泛應用于水產(chǎn)品等食品加工中。本研究以整只蝦仁為研究對象,通過比較80、90、100 ℃三種加熱條件下蛋白質(zhì)的理化變化發(fā)現(xiàn),加熱溫度越高,蝦仁中心溫度變化越迅速。對于蛋白組分含量、總巰基含量和Ca2+-ATPase活性,溫度越高,變化越明顯(p<0.05)。蛋白變性過程中分子間作用力的變化與加熱的溫度和時間關(guān)系密切,分子間作用力的計算結(jié)果卻不同于其他變化。80 ℃加熱條件下離子鍵變化最為明顯,終點含量最低,其次是90 ℃加熱和100 ℃加熱,氫鍵含量變化則是80 ℃>100 ℃>90 ℃,疏水作用90 ℃條件下變化最明顯,其次是100 ℃和80 ℃,分子間作用力變化和蝦仁口感、質(zhì)構(gòu)品質(zhì)有密切聯(lián)系。通過測定加熱過程中蝦仁的理化變化,可以優(yōu)化加工條件,進而提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

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Protein changes in shrimp muscle during boiled processing

LI Xiao-long,LIU Shu-cheng,XIE Wan-cui,JI Hong-wu,MAO Wei-jie*

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China)

Water heating is a common method used in shrimp cooking. In order to investigate the changes of protein denaturation and intermolecular forces of shrimp during boiling,central temperature,contents change of each protein component,protein solubility,total sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity under 80,90 and 100 ℃ were measured. The results showed that the higher the temperature was,the more significantly protein components changed. It was obvious that the changes of contents of ionic bonds and hydrogen bonds under 80 ℃ heating were less than those under 90 ℃ and 100 ℃(p<0.05). Effect of temperature on the hydrophobic interaction was 90 ℃>100 ℃>80 ℃. The total sulfhydryl(-SH)content and Ca2+-ATPase activity were showed a downward trend under different heating conditions,approaching 0 finally and both of them were significantly changed under 100 ℃ heating.

boiled;shrimp muscle;protein change;total-SH

2014-10-23

李曉龍(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工及貯藏工程,E-mail:xiaolong7269@163.com。

*通訊作者:毛偉杰(1973-)，女，博士，研究方向：低值海洋生物資源化學成分及高值化利用, E-mail:973575112@qq.com。

國家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(CARS-48)；國家自然科學基金(31301513)。

TS254.1

A

1002-0306(2015)15-0066-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.005