補中益氣湯對阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病的作用

郭繼光，張海燕，李朝鵬，高颯，李蕓

（1.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.保定市安新縣醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 保定 071600；3.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司 質(zhì)量保證部，河北 石家莊 050035；4.高碑店市醫(yī)院 兒科，河北 高碑店 074000；5.保定市第三醫(yī)院 護理部，河北 保定 071000）

補中益氣湯出自金元四大家的李杲所著的《脾胃論》，具有調(diào)補脾胃、升陽益氣的作用.藥物組成為黃芪、黨參、白術(shù)、陳皮、升麻、炙甘草、當(dāng)歸、柴胡.方中的黃芪作為君藥健脾補氣，而它與黨參和白術(shù)聯(lián)合使用則在補氣之余兼具養(yǎng)陰之功效，也就是說具有補氣固精的效果，實際上按照現(xiàn)代中醫(yī)理論，這種效果的實際作用就包含對尿蛋白的排泄的抑制作用.已經(jīng)有許多現(xiàn)代藥理研究表明黃芪能夠改善腎小球疾病患者的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝，改善腎功能［1］.當(dāng)歸是一味常用的補血和血藥，能夠改善血液循環(huán)［2－3］；陳皮能夠理氣健脾，加強消化和吸收；炙甘草具有氣血雙補的功效，能夠提高機體的免疫功能，抗炎止痛；升麻具有清熱解毒和升陽舉陷的功效，其作用和柴胡類似.目前，已經(jīng)有數(shù)個臨床實驗表明補中益氣湯可能對腎病起到一定的治療作用［4－6］，但是之前的工作中，都存在樣本數(shù)量低、缺乏嚴(yán)格的定量測定的問題.本研究根據(jù)Deschenes等［7］尾靜脈注射阿霉素的方法建立腎病大鼠模型，并使用此模型檢測補中益氣湯對阿霉素腎病的作用，從而進一步揭示其作用機理.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague Dawley大鼠60 只，雄性，體質(zhì)量約200g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.給藥前，先進行適應(yīng)性飼養(yǎng)約7d，使用普通飼料喂養(yǎng)，并保證充足的飲水.

1.2 試劑和設(shè)備

鹽酸阿霉素（Adriamycin，ADR），Sigma公司，使用時新鮮配置成5mg／mL.

代謝籠，Tecniplast，意大利；考馬斯亮藍G－250，Sigma公司；Albumin Bovine V，Sigma公司.

1.3 補中益氣湯水提取液的制備

補中益氣湯組方：黃芪15g，黨參10g，白術(shù)9g，陳皮6g，升麻6g，當(dāng)歸10g，柴胡6g，炙甘草9g.

水提取液制法：按處方比例加10倍量水浸泡30min，加熱煎煮1h，濾過，濾液備用.藥渣再加8倍量水，煎煮30min，濾過，濾液合并，濃縮至生藥質(zhì)量濃度1g／mL，靜置沉降24h，濾取上清夜，加熱濃縮至生藥質(zhì)量濃度2g／mL，即得.

1.4 阿霉素腎病大鼠模型的建立方法

按6mg／kg的劑量，初次大鼠尾靜脈注射阿霉素溶液，1周后，進行第2次尾靜脈阿霉素的注射，劑量為3mg／kg.如果在30d左右大鼠尚未死亡，則可認為已經(jīng)成功建立了阿霉素腎病大鼠模型.

1.5 動物分組及給藥

將60只大鼠分為6組，即對照組、模型組、激素組和補中益氣湯低劑量、中劑量及高劑量治療組，每組各10只.

補中益氣湯治療組大鼠，在首次尾靜脈注射阿霉素溶液后，立即進行補中益氣湯灌胃，每日1次，持續(xù)6周.

對照組和模型組使用同補中益氣湯等量的生理鹽水進行灌胃，同樣每日1次，持續(xù)6周.

補中益氣湯成人1日劑量（生藥）約為1g／kg（以人的體質(zhì)量為70kg計算）.依據(jù)Meeh－Rubner公式，換算200g大鼠1日的等效劑量（生藥）大約是人的6倍，即6g／kg.為了涵蓋湯劑的有效給藥劑量范圍，本實驗以此估算劑量為基礎(chǔ)，進行了梯度給藥.詳細的分組給藥方式見表1.

表1 動物分組和給藥方式Tab.1 Drug administrations in different rat groups

1.6 24h 尿蛋白定量測定

以首次尾靜脈注射阿霉素溶液后第7，21，42d，按照分組給藥方式給藥結(jié)束后，將大鼠轉(zhuǎn)移至代謝籠內(nèi)，收集24h的大鼠尿液.用Bradford法測定尿蛋白濃度，并依此計算24h 尿蛋白（24－h(huán)our urine protein，24HUP）.

1.7 大鼠血液生化指標(biāo)的檢測

在首次尾靜脈注射阿霉素后第42天，大鼠眼眶靜脈叢取血.通過自動生化分析儀檢測血液生化指標(biāo)，包括SCR 和BUN.

1.8 大鼠腎組織病理改變檢測

給藥第42 天末，取出腎臟組織，在體積分數(shù)10%的福爾馬林溶液中固定，之后進行石蠟包埋和切片，切片的染色采用蘇木精－伊紅染色法（hematoxylin－eosin staining，HE staining），最后將染好的切片置于光鏡下觀察并拍攝腎臟組織的病理形態(tài)改變.

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)按照均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的方式進行表示，即Mean±SD.由于實驗分組較多（6組），因此采用了單因數(shù)方差分析（One－Way ANOVA），分析軟件使用的是SPSS，P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 給藥后大鼠體質(zhì)量、精神和毛發(fā)變化

造模1周后，注射阿霉素的大鼠開始顯得精神委靡、食欲減退、體毛凌亂無光，且出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，并隨著時間延長而加劇，尾部出現(xiàn)紅腫；在3周后個別大鼠尾部甚至產(chǎn)生了糜爛，且身體開始出現(xiàn)水腫，隨著時間的延長水腫也逐漸加劇.相對而言，補中益氣湯組雖然較對照組的大鼠在體質(zhì)量、精神和毛發(fā)上都出現(xiàn)了不良反應(yīng)，但是較模型組則顯得更為活躍，食量更多，體質(zhì)量也要偏高，脫毛和水腫也較為輕微；激素組體質(zhì)量、精神、食量、水腫和毛發(fā)狀況則與補中益氣湯的中劑量組十分接近.

在對大鼠狀態(tài)進行定性觀察和記錄的基礎(chǔ)上，對大鼠的體質(zhì)量變化進行定量地跟蹤測定.結(jié)果表明，在各個時間點注射過阿霉素的大鼠，包括了給藥組、激素組和模型組，體質(zhì)量都明顯小于對照組（P＜0.01）；從造模后第2周開始相對模型組，給藥組和激素組大鼠體質(zhì)量均有顯著增加（P＜0.01），見表2和圖1.

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（Mean±SD，n＝10）Tab.2 Mass changes of rats before and after drug administration（Mean±SD，n＝10）

由圖1可知，從第2周開始相對模型組，低中高劑量組和激素組均有顯著增加（P＜0.01），其中低劑量組的體質(zhì)量增加最多.

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢Fig.1 Variation trend of rat weight in different groups

2.2 各組大鼠24HUP的比較

在初始隨機分組后，各組大鼠的24 HUP并無統(tǒng)計學(xué)差異.在給藥后1周、3周和6周末，模型組大鼠24HUP與對照組相比，出現(xiàn)顯著增加（P＜0.01），而補中益氣湯治療組與模型組大鼠24HUP相比，出現(xiàn)顯著減少（P＜0.05），見表3和圖2.

表3 各組大鼠24HUP變化（Mean±SD，n＝10）Tab.3 Total 24－h(huán)our urine protein changes in different groups（Mean±SD，n＝10）

圖2 造模后1周，3周和6周24HUP變化趨勢Fig.2 Variation of the 24HUP tested in 1week，3weeks and 6weeks after the first adriamycin injection

2.3 各組大鼠腎功能指標(biāo)的檢測

給藥6周后，各組大鼠血清SCR 和BUN 水平較正常對照組無顯著性差異，見表4.

表4 各組大鼠腎功能比較（Mean±SD，n＝10）Tab.4 Comparison of the renal functions between different drug groups

2.4 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變

光鏡下模型組大鼠腎小球系膜硬化及玻璃樣變、細胞外基質(zhì)增生、腎小球細胞空泡樣變性、毛細血管叢萎陷及閉塞、腎小球纖維化等，均較正常對照組明顯.補中益氣湯治療組大鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，細胞空泡樣變性及纖維化程度較模型組輕，見圖3.

圖3 模型組和治療組大鼠腎臟組織的HE染色結(jié)果Fig.3 Rat kidney tissue with HE staining of model group and the treatment group

3 討論

本課題組采用了大鼠二次尾靜脈注射阿霉素方式，成功制作出了阿霉素腎病的大鼠模型.阿霉素腎病大鼠模型是一種經(jīng)過深入研究的嚙齒動物慢性腎炎模型，并且已經(jīng)為揭示深藏其中的病理機制提供了諸多便利［8］.阿霉素腎病有多種造模方式，而本課題組選擇的方法是二次尾靜脈注射阿霉素法.與單次給藥造模方式相比此法有不少優(yōu)點.首先，二次給藥法造成的腎臟病理改變復(fù)合人的微小病變腎?。╩inimal change nephropathy，MCN），在第5周腎臟上皮細胞會出現(xiàn)空泡樣變性，采用電鏡觀察還可以進一步看到足細胞的融合和裂隙的消失.其次，與單次給藥類似，此方法在用藥很短的時間內(nèi)就可以造成腎臟損傷，并產(chǎn)生持續(xù)的尿蛋白分泌，這種損傷十分穩(wěn)定，在實驗中，所有注射阿霉素的大鼠都出現(xiàn)了尿蛋白分泌的增多.此外，二次給藥法造模對大鼠的損傷相對和緩，在實驗中除了個別大鼠在后期萎靡不振以外并無一例死亡，這一點給實驗帶來很好的保障.

對大鼠在造模過程中的體質(zhì)量變化進行了跟蹤記錄（表2和圖1），結(jié)果表明：模型組和給藥組大鼠體質(zhì)量的增加速度始終明顯低于對照組（P＜0.01），而且模型組大鼠的健康活躍度降低最為顯著，并且出現(xiàn)明顯的脫毛和食欲不振的現(xiàn)象.這說明阿霉素對大鼠機體的損傷是十分顯著的.而給藥組和模型組相比，給藥組的大鼠體質(zhì)量在整個6周內(nèi)都明顯高于模型組，這表明補中益氣湯的灌胃對大鼠有一定的保護作用，在一定程度上減輕了阿霉素造成的損傷.

蛋白尿是腎臟疾病最常見的臨床癥狀之一，也是阿霉素腎病的典型癥狀，腎小球濾過屏障破壞是臨床上最為常見的引發(fā)蛋白尿的因素，其發(fā)生與腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)功能異常有關(guān).近年來的研究揭示出，這層濾過屏障，實際上是由腎小球足細胞（podocyte）形成的足突間的裂隙隔膜（slit diaphragm，SD）來控制濾過功能的.腎小球濾過膜能夠根據(jù)分子的大小進行選擇性地過濾的主要根源就是這層裂隙隔膜.換句話說，SD是腎小球濾過功能的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它的結(jié)構(gòu)的任何程度的損傷和破壞都會嚴(yán)重影響腎小球的濾過功能，從而產(chǎn)生蛋白尿［9］.有研究通過電鏡觀察阿霉素腎病模型中病理改變發(fā)現(xiàn)，腎臟毛細血管內(nèi)皮細胞和足細胞出現(xiàn)腫脹和融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大，系膜區(qū)有輕微的擴張，并且隨著時間的延長，腎小球上皮細胞足突部分融合增多，致使隔膜裂隙的消失［10］.蛋白尿不僅是腎臟疾病的病理產(chǎn)物，對腎臟也能造成進一步的損害，可引起系膜細胞損傷、增生，甚至腎小球的硬化，并且它對近曲小管細胞也有毒性作用，可導(dǎo)致小管基底側(cè)釋放PDGF，F(xiàn)N 和MCP－1，誘導(dǎo)纖維化過程［11］.目前，已經(jīng)有多篇文章在臨床上初步驗證了補中益氣湯加味或者結(jié)合其他藥物對于腎病具有一定的治療作用，并能夠降低蛋白尿，改善臨床癥狀［12－13］，但是這些工作都沒有對使用的補中益氣湯進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制；此外在這些工作中引入其他的中西藥輔助治療雖然在臨床上有不錯的療效，但也模糊了補中益氣湯在治療過程中起到的作用.在本課題組的工作中，首先在藥材上使用的都是同一批次大批量制作出來的生藥，保證了重復(fù)性，而且并未使用補中益氣湯以外的任何藥材，以此得出的結(jié)論能夠很好地證明純粹的補中益氣湯對于腎病的療效.

為了檢測補中益氣湯具體對阿霉素腎病中典型的蛋白尿的癥狀的作用，采集并記錄了造模開始后1周、3周和6周時的24 HUP.結(jié)果表明，在二次注射阿霉素后，大鼠開始表現(xiàn)出明顯的尿蛋白分泌增多，其24HUP在2～6周的時間內(nèi)隨著時間的延長而不斷地增多.相對于模型組，補中益氣湯治療組的尿蛋白分泌明顯低于模型組（P＜0.01）.這些實驗結(jié)果表明，補中益氣湯能夠?qū)Π⒚顾啬I病導(dǎo)致的蛋白尿產(chǎn)生顯著的抑制作用，提示此方可能通過抑制蛋白尿起到對腎臟的保護作用.

在本研究中，首次觀察到了補中益氣湯對腎臟組織病變的改善作用.通過對6周末大鼠腎臟病理組織切片的形態(tài)學(xué)觀察表明，模型組與正常組相比，腎小球系膜出現(xiàn)纖維化，系膜基質(zhì)出現(xiàn)增生；可見空泡樣變性的腎小球細胞；毛細血管出現(xiàn)毒性癥狀，如閉塞或呈結(jié)節(jié)狀；在局部出現(xiàn)了腎小球硬化；在間質(zhì)內(nèi)有大量的炎癥細胞浸潤；腎小管病理改變明顯，其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹和壞死，并在其腔內(nèi)觀察到凝聚的大量蛋白管型（圖3）.在給藥后，可以看出補中益氣湯，尤其在中劑量下，能夠在一定程度上恢復(fù)阿霉素造成的腎臟組織病理改變，這也再次表明了補中益氣湯對阿霉素腎病的緩解和治療作用.已有的研究表明，除了補中益氣湯外還有其他的藥物能改善腎組織病理改變，比如：六味地黃湯合黃連解毒湯［14］和南洋參［15］.

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明補中益氣湯能夠抑制阿霉素腎病中尿蛋白的分泌，明顯減輕腎小球及腎小管間質(zhì)病變，而起作用機制可能是通過減少尿蛋白分泌，從而減輕了尿蛋白對系膜細胞和腎小管上皮細胞的刺激，最終起到了對腎臟的保護作用.

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