全細胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究進展

張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

全細胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究進展

張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac）及其衍生物不僅在人體內(nèi)發(fā)揮重要的生理生化功能，且已經(jīng)應(yīng)用到流感的預(yù)防和治療。但已有的N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)方法產(chǎn)量低、成本高，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及糖組學(xué)研究的發(fā)展與成熟，一種新型的生物技術(shù)即全細胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸正成為研究的熱點。旨在介紹全細胞催化技術(shù)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究進展。

N-乙酰神經(jīng)氨酸；唾液酸；全細胞催化法；生物轉(zhuǎn)化

唾液酸（Sialic acid，SA）是一類Neu5Ac的O-乙?；苌铮?］，在微生物及哺乳動物體內(nèi)大量存在［2］。迄今，分離鑒定的唾液酸類化合物已有40多種［3］，其中Neu5Ac約占整個唾液酸家族的99%以上［4，5］。少以游離形式存在，多連接在細胞膜表面的糖蛋白、糖脂或寡糖末端［6］。Neu5Ac是細胞信息傳遞的第一接觸位點［7］，且其分子結(jié)構(gòu)具有多樣性，因此Neu5Ac參與細胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、受精等多個生理過程［8-12］。此外，Neu5Ac能調(diào)節(jié)IgG的抗炎活性，增強嬰兒免疫力，影響神經(jīng)細胞的完整性、滲透性及活性，促進嬰兒大腦的發(fā)育［13-16］。以唾液酸為主體結(jié)構(gòu)的一系列藥物已被用于癌癥、炎癥及流感的治療［17，18］。但現(xiàn)有生產(chǎn)方法產(chǎn)量低、成本高，難以滿足市場需求，因而建立經(jīng)濟高效的生產(chǎn)方法成為研究熱點。

目前制備Neu5Ac的方法主要有：天然原料提取法、化學(xué)合成法、酶促合成法、生物轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法等。19世紀(jì)60年代以來，研究者相繼從牛初乳、卵黃、酪蛋白和燕窩等SA含量相對豐富的天然材料中提取Neu5Ac［19-22］。但SA在天然原料中總含量低、分離提純過程復(fù)雜，導(dǎo)致其收率低、成本高、產(chǎn)物立體選擇性較差，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法多是在堿性或酸性條件下，由多種底物在催化劑的催化下合成，整個過程既需高溫、高壓等嚴苛的反應(yīng)條件、復(fù)雜的生產(chǎn)工藝，還涉及復(fù)雜的基團保護、去保護問題；且反應(yīng)過程中生成較多的中間產(chǎn)物及異構(gòu)體，使產(chǎn)物后處理極其繁瑣，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求［23-27］。此外，Neu5Ac還可通過水解微生物發(fā)酵的聚唾液酸得到。但此法產(chǎn)物濃度低，生長周期長，多伴有副產(chǎn)物，僅限于小規(guī)模試驗。生物合成法反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、后處理簡單、專一性好、產(chǎn)品純度高，已逐漸取代傳統(tǒng)工藝成為新型“綠色”生產(chǎn)技術(shù)。隨著代謝工程、基因工程手段的發(fā)展，與基因工程技術(shù)相結(jié)合的全細胞催化法（whole-cell biocatalysis），已成為大規(guī)模生產(chǎn)Neu5Ac的最理想途徑。因此，本文將重點介紹近年來全細胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的研究進展。

1 全細胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸

全細胞催化法的基本原理是利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學(xué)轉(zhuǎn)化，將某種前體分子轉(zhuǎn)化成特定產(chǎn)物，其實質(zhì)是利用生物體系中酶的催化作用［28］。該方法主要是利用代謝工程原理，結(jié)合基因工程手段，對Neu5Ac代謝途徑進行改造進而實現(xiàn)產(chǎn)物的大量合成。主要手段包括在宿主細胞中過表達合成途徑中的相關(guān)酶蛋白，或敲除其降解途徑的相關(guān)酶基因，解除產(chǎn)物的反饋抑制。而該方法的主要依據(jù)是Neu5Ac在生物體內(nèi)的多種合成途徑（圖1）。

圖1 Neu5Ac的生物合成途徑［29-32］

全細胞催化法合成Neu5Ac得以實現(xiàn)首先歸功于1986年Aisaka等的工作，他們首次從E.coli中克隆并表達出N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（N-Acetylneuraminic acid aldolase，NanA），揭開了全細胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的序幕。隨后，研究者相繼從多殺巴斯德桿菌?。≒asteurella multocida）、Bacteroides ovatus ATCC 8483中分別克隆出NanA、N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶（GlcNAc 2-epimerase）［33-36］，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了較全面的研究，促使全細胞催化技術(shù)不斷發(fā)展并日益成熟。迄今，全細胞催化技術(shù)經(jīng)歷了多細胞偶聯(lián)和單細胞合成兩個階段。

1.1 雙細胞及多細胞偶聯(lián)系統(tǒng)

Tabata等［37］創(chuàng)造性地將全細胞催化法應(yīng)用于Neu5Ac的合成。他們以E. coli NM522為宿主菌，分別克隆并過表達單細胞集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（slr1975）、大腸桿菌（E.coli K-1）的Neu5Ac合酶基因（neuB），同時偶聯(lián)產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes）并利用其代謝過程中產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），共同合成Neu5Ac，構(gòu)建了一個新型的微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖2）。該方法以800 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）和360 mmol/L葡萄糖作為起始反應(yīng)體系，反應(yīng)22 h后產(chǎn)生39.7 mmol/L（12.3 g/L） Neu5Ac，GlcNAc轉(zhuǎn)化率為5%。

雖然產(chǎn)物的產(chǎn)量較低，但這是首次在原核生物中克隆并表達出slr1975，為日后的研究工作提供了新思路。這種方法最大優(yōu)點是利用工程菌的胞內(nèi)酶，使整個反應(yīng)在細胞內(nèi)完成，前體物質(zhì)GlcNAc經(jīng)異源表達的專一性酶催化生成目標(biāo)產(chǎn)物，實現(xiàn)了酶的級聯(lián)反應(yīng)。該方法有效提高了合成效率，避免了繁瑣的酶純化過程，簡化了生產(chǎn)工藝，節(jié)省了ATP的添加成本，為工業(yè)化生產(chǎn)Neu5Ac提供了新的實驗依據(jù)。

圖2 多細胞偶聯(lián)催化合成Neu5Ac［37］

2007年，Xu等［38］提出了化學(xué)合成法與生物轉(zhuǎn)化法相結(jié)合的新方法。該方法綜合了細菌氧化乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)專一性與化學(xué)異構(gòu)化合成ManNAc的高效性，建立了一種高效、經(jīng)濟的復(fù)合式轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其利用E.coli K-12 的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因（nanA）與E. coli BL21構(gòu)建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET15b-nanA，并與施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri SDM）相偶聯(lián)，形成雙細胞偶聯(lián)系統(tǒng)。施氏假單胞菌的乳酸氧化酶復(fù)合物（lactate oxidase，LOX）專一性地催化乳酸生成丙酮酸［39］，與化學(xué)異構(gòu)化得到的ManNAc在重組細胞內(nèi)協(xié)同合成Neu5Ac（圖3）。結(jié)果顯示，223.18 g/L GlcNAc及65.61 g/L乳酸生成18.32 g/L Neu5Ac，產(chǎn)量比Tabata等的研究結(jié)果提高了約50%，同時提高了GlcNAc的轉(zhuǎn)化效率，達到6%。

該方法的優(yōu)點在于將化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合，一方面利用化學(xué)合成法高效快速地異構(gòu)化GlcNAc產(chǎn)生高濃度的ManNAc，促使可逆反應(yīng)向生成Neu5Ac的方向進行，提高了GlcNAc的轉(zhuǎn)化效率；另一方面，在重組菌中表達的NanA比E.coli K-12中的活性高約56倍，極大地提高了酶活性，有效提高了生物合成效率。而且生物轉(zhuǎn)化法能夠減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使反應(yīng)易于控制與操作。對于工業(yè)化生產(chǎn)，用低價的乳酸取代丙酮酸作為底物，極大地降低了生產(chǎn)成本。

圖3 化學(xué)合成法與雙細胞偶聯(lián)法相結(jié)合生成Neu5Ac［38］

同年，Lee等［40］研究發(fā)現(xiàn)魚腥藻屬（Anabaena sp. CH1）的N-乙酰葡糖胺異構(gòu)酶（bGlcNAc 2-epimerase，bage）活性比豬腎的N-乙酰葡糖胺異構(gòu)酶（pGlcNAc 2-epimerase，page）高11.5倍。因此構(gòu)建工程菌時，他們將bage和E. coli K-1的nanA，分別導(dǎo)入宿主菌E. coli BL21，構(gòu)建了兩株重組 菌E. coli BL21（DE3）/pET-bage及E. coli BL21（DE3）/pET-nanA，形成雙細胞偶聯(lián)的微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖4）［41］。由1 200 mmol/L GlcNAc和1 200 mmol/L丙酮酸作為初始反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化12 h后，產(chǎn)物Neu5Ac終濃度高達122.3 g/L，生成速率為10.2 g/L/h，GlcNAc轉(zhuǎn)化效率達到33%。該方法的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化效率均較同期的全細胞催化法有大幅度的提高。該方法的另一個創(chuàng)新之處為該系統(tǒng)的工程菌細胞能循環(huán)使用8次，并且每個循環(huán)中Neu5Ac生成速率均維持在8.0 g/L/h以上。

該方法比較了不同的異構(gòu)酶基因活性，運用高活性的異構(gòu)酶促進了Neu5Ac產(chǎn)量顯著提高。同時，目標(biāo)產(chǎn)物的生成速率提高了近5倍。這為后期提高Neu5Ac產(chǎn)量，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的實驗思路。更值得一提的是，該方法首次提出多次循環(huán)利用工程菌，縮短了生產(chǎn)周期，簡化了操作工藝，降低了發(fā)酵成本，使工程菌得到了最大程度的利用。但該方法仍存在需改進的工藝，其要求的底物濃度較高，較高的成本限制了工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 雙細胞偶聯(lián)法催化合成Neu5Ac［41］

2010年，Zhang等［42］在雙細胞偶聯(lián)法的基礎(chǔ)上，首次使用溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)取代化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)。以E. coli K12作為宿主菌，分別用溫度誘導(dǎo)載體pBV220克隆表達Synechocystis sp. PCC 6803的slr1975以及E. coli K-1的nanA，以丙酮酸和GlcNAc為前體物質(zhì)合成Neu5Ac。轉(zhuǎn)化36 h后，由200 mmol/L GlcNAc生成61.9 mmol/L（19.1 g/ L） Neu5Ac，轉(zhuǎn)化率達到30.95%（圖5）。雖然該方法的產(chǎn)量沒有明顯提高，但僅通過簡單地提高溫度來誘導(dǎo)表達相比于有毒性的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)更安全高效。該方法不僅保證了底物的高轉(zhuǎn)化率，也創(chuàng)新性提出了一種簡便安全、經(jīng)濟有效的生產(chǎn)工藝，為安全化工業(yè)生產(chǎn)提供了有力的保障。

圖5 溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)為特征的雙細胞偶聯(lián)法合成Neu5Ac［42］

微生物多細胞及雙細胞偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的提出與發(fā)展，使得產(chǎn)量顯著提高，極大地推動了實現(xiàn)Neu5Ac工業(yè)化生產(chǎn)的進程。在此基礎(chǔ)上，不斷有人對Neu5Ac的合成，包括宿主菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)、催化酶及供體基因進行研究和優(yōu)化，使該工藝日臻完善，操作流程更簡單，反應(yīng)條件更溫和，生產(chǎn)工藝更環(huán)保，生產(chǎn)成本更低廉。但由于多細胞及雙細胞偶聯(lián)系統(tǒng)常需兩種及兩種以上細胞作為載體，一方面難以維持系統(tǒng)的平衡以及細胞間的協(xié)調(diào)；另一方面細胞間傳質(zhì)阻力會阻礙中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運，降低了底物利用率。此外，系統(tǒng)中的副反應(yīng)也在一定程度上降低Neu5Ac的產(chǎn)量。因此，為了克服細胞間的傳質(zhì)阻力、解決系統(tǒng)間的協(xié)調(diào)與平衡、提高底物利用率，嘗試將整個合成過程在單細胞內(nèi)實現(xiàn)成為研究者追求的目標(biāo)。

1.2 單細胞合成系統(tǒng)

2010年Ishikawa等［43］在前期工作的基礎(chǔ)上，首次實現(xiàn)了單細胞合成Neu5Ac技術(shù)（圖6）。將slr1975、neuB基因?qū)隕.coli構(gòu)建重組菌E.coli N18-14/pLT4K，使其具備異構(gòu)酶及合酶活性，從而在單細胞內(nèi)完成整個合成過程。這有效地避免了傳質(zhì)阻力引起的底物利用率降低。同時，敲除了nanA，使菌體喪失醛縮酶活性，防止Neu5Ac裂解。并且將工程菌用表面活性劑Nymeen S-215和甲苯處理，使之獲得高通透性，利于底物跟產(chǎn)物的胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運從而促進反應(yīng)向合成方向進行。在GlcNAc用量為540 mmol/L（120 g/L）的體系反應(yīng)22 h，產(chǎn)物濃度達172 mmol/L（53 g/L），產(chǎn)物生成速率為2.41 g/L/h，轉(zhuǎn)化率達32%。這是利用單細胞系統(tǒng)生產(chǎn)Neu5Ac的首創(chuàng)。

該技術(shù)與多細胞偶聯(lián)系統(tǒng)相比具有明顯優(yōu)勢：首先，該體系僅由一種工程菌組成，更利于系統(tǒng)內(nèi)的平衡與協(xié)調(diào)，也簡化了工藝過程；其次，減少了底物及中間產(chǎn)物在細胞間的傳遞步驟，提高了底物利用率；三是，隨著底物利用率的增加，Neu5Ac的產(chǎn)量明顯提高；四是，代謝途徑的進一步優(yōu)化，減少了合成過程中的副反應(yīng)，進一步促進了產(chǎn)物的積累；五是，應(yīng)用單細胞體系，便于菌體的分離及循環(huán)利用，簡化了Neu5Ac的分離純化流程。另外，在反應(yīng)體系中添加表面活性劑以增強細胞膜通透性，促進物質(zhì)轉(zhuǎn)運，為后期研究提供了新思路，但尋求更加安全合適的表面活性劑將是研究者進一步探究的方向。

圖6 單細胞催化合成Neu5Ac［43］

2011年，Tao等［44］在前期工作基礎(chǔ)上結(jié)合單細胞合成法，進一步優(yōu)化改造宿主菌的代謝途徑，建立了“one-pot”反應(yīng)系統(tǒng)。首先敲除編碼葡萄糖特異PTS轉(zhuǎn)運體的基因（nagE），使磷酸轉(zhuǎn)移酶活性喪失，因此GlcNAc能夠直接進入Neu5Ac合成途徑。然后用溫度誘導(dǎo)載體pBV220將slr1975轉(zhuǎn)化到突變體E.coli K-12中，與nanA共表達，組成“one-pot”轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖7）。該方法以溴化十六烷三甲基銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）作為表面活性劑，使Neu5Ac產(chǎn)量提高了一倍多。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)36 h 能產(chǎn)生191 mmol/L（59 g/L）的Neu5Ac，產(chǎn)物生成速率約1.64 g/L/h。

該方法在保障高產(chǎn)高轉(zhuǎn)化率的前提下，以溫度誘導(dǎo)型質(zhì)粒作為載體，以CTAB取代二甲苯作為表面活性劑，保證了生產(chǎn)過程的安全性。而且，由于大腸桿菌對CTAB的較高耐受性，能在一定程度上提高菌體效率，從而提高了整個系統(tǒng)的生產(chǎn)效率。

2012年，Kang等［45］在E. coli中 設(shè)計了一條以葡萄糖為唯一底物、以N-乙酰葡糖胺六磷酸（GlcNAc-6-P）為中間產(chǎn)物的Neu5Ac合成通路（圖8）。首先將Saccharomyces cerevisiae EBY100的葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（GNA1）、slr1975及nanA導(dǎo)入受體菌E. coli DH5α中共表達。同時過表達葡萄糖-6-磷酸合酶基因（glmS）解除其反饋抑制，并敲除nanE、nanK、nagA等基因以增加GlcNAc及ManNAc的積累；敲除丙酮酸在其他代謝途徑中的相關(guān)酶基因以保證丙酮酸完全進入Neu5Ac合成途徑而不被降解；敲除Neu5Ac向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的基因nanT保證產(chǎn)物充分運輸?shù)郊毎?，促進反應(yīng)向合成方向進行。最初該工程菌直接利用葡萄糖可產(chǎn)生1.62 g/L Neu5Ac，后經(jīng)分批補料發(fā)酵產(chǎn)量可達7.85 g/L。

圖7 “one-pot”反應(yīng)系統(tǒng)［44］

該方法利用菌體自身的代謝途徑并加以改造，實現(xiàn)了以葡萄糖為唯一底物合成Neu5Ac的愿景。雖然產(chǎn)量較低但用葡萄糖取代了GlcNAc、丙酮酸等高價的底物，極大地降低了生產(chǎn)成本，為開發(fā)更加簡潔高效的Neu5Ac合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

圖8 以葡萄糖為底物的Neu5Ac合成途徑［45］

2013年，Sun等［32］研究了多順反子質(zhì)粒上Nal與anAGE基因順序?qū)eu5Ac產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明重組菌E. coli Rosetta（DE3） pLysS：pET-28a-Nal-anAGE合成的Neu5Ac產(chǎn)量最高。含0.8 mol/L GlcNAc與1.2 mol/L丙酮酸的反應(yīng)體系產(chǎn)生了61.3 g/L Neu5Ac。該研究創(chuàng)造性的提出了基因順序?qū)eu5Ac產(chǎn)量有影響并得到證實，為進一步優(yōu)化合成途徑提供了一定理論依據(jù)。

關(guān)于全細胞催化法合成Neu5Ac的最新報道是本研究組在大量前期研究的基礎(chǔ)上提出的一個更簡單高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖9）［46］。該系統(tǒng)以E. coli K-12為宿主菌，敲除nanTEK，導(dǎo)入age及nanA共表達，獲得重組菌E. coliΔ nanTEK/pNA。在此菌株中阻斷了Neu5Ac合成的競爭反應(yīng)，保證ManNAc充分進入Neu5Ac合成途徑，同時使Neu5Ac不斷運出細胞促使反應(yīng)向合成方向進行，結(jié)果0.6 mol/L GlcNAc 及0.8 mol/L丙酮酸的反應(yīng)體系生成74.2 g/L Neu5Ac，產(chǎn)物生成速率達到6.2 g/L/h，轉(zhuǎn)化率高達40%。并且菌體可以回收循環(huán)利用5次。

該系統(tǒng)Neu5Ac的產(chǎn)量及產(chǎn)物生產(chǎn)速率均是目前報道的單細胞合成法最高值。其利用較低的底物濃度，獲得較高的產(chǎn)物生成速率，成為目前合成Neu5Ac最為理想的方式，進一步推動了全細胞催化法合成Neu5Ac實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的進程。

圖9 優(yōu)化后的Neu5Ac單細胞合成系統(tǒng)［46］

2 展望

在最近10多年中，依賴于基因工程與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Neu5Ac的全細胞催化合成與應(yīng)用取得了引人矚目的成績和進步，已成為合成Neu5Ac的最理想方式。全細胞催化法作為對環(huán)境友好，低投資的前瞻性工藝路線，與化學(xué)合成法相比，全細胞催化法應(yīng)用專一性的酶對前體物質(zhì)進行專一性地酶促反應(yīng)，副產(chǎn)物少，且反應(yīng)條件溫和、污染低；與微生物發(fā)酵法相比，全細胞催化法生產(chǎn)周期更短，操作條件更容易控制，細胞或酶易再生、可循環(huán)使用，更適合大規(guī)模生產(chǎn)；與酶法合成相比，全細胞催化法在細胞內(nèi)進行催化合成，能夠激活異構(gòu)酶，還可省去繁瑣耗時的酶純化過程，并且生產(chǎn)過程中的反應(yīng)是通過生命體自動調(diào)節(jié)方式進行，可充分利用微生物代謝產(chǎn)生的ATP，避免了添加昂貴的ATP，從而使反應(yīng)過程更高效率、低成本、綠色環(huán)保。

迄今，Neu5Ac的合成工藝已日趨完善，但仍存在一定的改進空間。例如，尋找更高活性的合成酶，從而提高全細胞催化速率；設(shè)計更高效的合成途徑，構(gòu)建更加穩(wěn)定耐受的工程菌，最大程度上解除反饋抑制與競爭性反應(yīng)，盡量減少副產(chǎn)物積累，提高工程菌的利用率；尋找更廉價的底物代替常用底物，降低生產(chǎn)成本；優(yōu)化反應(yīng)條件，進行工業(yè)化放大，建立一條簡便、安全、環(huán)保的生產(chǎn)工藝路線。因此，運用代謝工程、基因手段改造及篩選更合適的微生物催化劑仍是重要的研究課題。

［1］ Chen X, Varki A. Advances in the biology and chemistry of sialic acids［J］. ACS Chemical Biology, 2009, 5（2）：163-176.

［2］ Schauer R. Biochemistry and role of sialic acids［M］// Rosenberg A. Biology of the Sialic Acids. New York：Plenum Publishing Corporation, 1995：57-67.

［3］ Tao F, Zhang Y, Ma C, et al. Biotechnological production and applications of N-acetyl-D-neuraminic acid：current state and perspectives［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87（4）：1281-1289.

［4］ Yu R, Ledeen R. Configuration of the ketosidic bond of sialic acid［J］. Journal of Biological Chemistry, 1969, 244（5）：1306-1313.

［5］ Rosenberg A, Schengrund CL. Biological roles of sialic acid［M］. New York：Plenum Publishing Corporation, 1976.

［6］ Varki A. Diversity in the sialic acids［J］. Glycobiology, 1992, 2（1）：25-40.

［7］ Reuter G, Gabius HJ. Sialic acids structure analysis metabolism occurrence recognition［J］. Biological Chemistry Hoppe-Seyler, 1996, 377（6）：325-342.

［8］ Schauer R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions［J］. Current Opinion in Structural Biology, 2009, 19（5）：507-514.

［9］ Schauer R. Achievements and challenges of sialic acid research［J］. Glycoconjugate Journal, 2000, 17（7-9）：485-499.

［10］ Hu S, Chen J, Yang Z, et al. Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85（5）：1383-1391.

［11］ Kelm S, Schauer R, Crocker P. The Sialoadhesins—a family of sialic acid-dependent cellular recognition molecules within the immunoglobulin superfamily［J］. Glycoconjugate Journal, 1996, 13（6）：913-926.

［12］ Kelm S, Schauer R. Sialic acids in molecular and cellularinteractions［J］. International Review of Cytology, 1997, 175：137-240.

［13］ B?hm S, Schwab I, Lux A, et al. The role of sialic acid as a modulator of the anti-inflammatory activity of IgG［J］. Seminars in Immunopathology, 2012, 34（3）：443-453.

［14］ Oriquat GA, Saleem TH, Abdullah, ST, et al. Soluble CD14, sialic acid and L-fucose in breast milk and their role in increasing the immunity of breast-fed infants［J］. American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 2011, 7（1）：21-28.

［15］ Wielga P, Braszko JJ. The participation of sialic acids in microglia neuron interactions［J］. Cellular Immunology, 2012, 273（1）：17-22.

［16］ Sprenger N, Julita M, Donnicola D, et al. Sialic acid feeding aged rats rejuvenates stimulated salivation and colon enteric neuron chemotypes［J］. Glycobiology, 2009, 19（12）：1492-1502.

［17］ Varki NM, Varki A. Diversity in cell surface sialic acid presentations：implications for biology and disease［J］. Laboratory Investigation, 2007, 87（9）：851-857.

［18］ Bondioli L, Ruozi B, Belletti D, et al. Sialic acid as a potential approach for the protection and targeting of nanocarriers［J］. Expert Oopinion on Drug Delivery, 2011, 8（7）：921-937.

［19］ Blix F, Gottschalk A, Klenk E. Proposed nomenclature in the field of neuraminic and sialic acids［J］. Nature, 1957, 179：1088.

［20］ Juneja LR, Koketsu M, Nishimoto K, et al. Large-scale preparation of sialic-acid from chalaza and egg-yolk membrane［J］. Carbohydrate Research, 1991, 214（1）：179-186.

［21］ Schaue R, Stoll S, Reuter G. Differences in the amount of N-acetyland N-glycoloyl-neuraminic acid, as well as O-acylated sialic acids, of fetal and adult bovine tissues［J］. Carbohydrate Research, 1991, 213：353-359.

［22］ Koketsu M, Juneja LR, Kawanami H, et al. Preparation of N-acetylneuraminic acid from delipidated egg yolk［J］. Glycoconjugate Journal, 1992, 9（2）：70-74.

［23］ Furuhata K. Chemistry of N-acetylneuraminic acid（Neu5Ac）［J］. Trends Glycosci Glycotechnol, 2004, 16：143-169.

［24］ Cornforth J, Firth M, Gottschalk A. The synthesis of N-acetylneuraminic acid［J］. Biochemical J, 1958, 68（1）：57.

［25］ Chan TH, Lee MC. Indium-mediated coupling of α-（Bromomethyl）acrylic acid with carbonyl compounds in aqueous media. concise syntheses of（+）-3-Deoxy-D-glycero-D-galacto- nonulosonic acid and N-acetylneuraminic acid［J］. The Journal of Organic Chemistry, 1995, 60（13）：4228-4232.

［26］ Danishefsky SJ, DeNinno MP, Chen SH. Stereoselective total syntheses of the naturally occurring enantiomers of N-acetylneuraminic acid and 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid. A new and stereospecific approach to sialo and 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid conjugates［J］. Journal of the American Chemical Society, 1988, 110（12）：3929-3940.

［27］ Haag-Zeino B, Schmidt RR. De novo synthesis of carbohydrates and related natural products, 34. Synthesis of N-acetyl-β-D-neuraminic acid derivatives via inverse-type hetero-Diels-Alder reaction［J］. Liebigs Annalen der Chemie, 1990, 1990（12）：1197-1203.

［28］ 郭明, 胡昌華. 生物轉(zhuǎn)化—從全細胞催化到代謝工程［J］. 中國生物工程雜志, 2010, 30：110-115.

［29］ Plumbridge J, Vimr E. Convergent pathways for utilization of the amino sugars N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine, and N-acetylneuraminic acid by Escherichia coli［J］. Journal of bacteriology, 1999, 181（1）：47-54.

［30 Vimr ER, Kalivoda KA, Deszo EL, et al. Diversity of microbial sialic acid metabolism［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2004, 68（1）：132-153.

［31］ Ferrero Má, Aparicio LR. Biosynthesis and production of polysialic acids in bacteria［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86（6）：1621-1635.

［32］ Sun W, Ji W, Li N, et al. Construction and expression of a polycistronic plasmid encoding N-acetylglucosamine 2-epimerase and N-acetylneuraminic acid lyase simultaneously for production of N-acetylneuraminic acid［J］. Bioresource Technology, 2013, 130：23-29.

［33］ Li Y, Yu H, Cao H, et al. Pasteurella multocida sialic acid aldolase：a promising biocatalyst［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 79（6）：963-970.

［34］ North RA, Kessans SA, Atkinson SC, et al. Cloning, expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of N-acetylneuraminate lyase from methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］. Acta Crystallogr Sect F, 2013, 69（3）：306-312.

［35］ Maru I, Ohta Y, Murata K, et al. Molecular cloning and identification of N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase from porcine kidney as a renin-binding protein［J］. Journal of BiologicalChemistry, 1996, 271（27）：16294-16299.

［36］ Sola-Carvajal A, Sánchez-Carrón G, García-García MI, et al. Properties of BoAGE2, a second N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase from Bacteroides ovatus ATCC 8483［J］. Biochimie, 2012, 94（1）：222-230.

［37］ Tabata K, Koizumi S, Endo T, et al. Production of N-acetyl-D-neuraminic acid by coupling bacteria expressing N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid synthetase［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 30（3）：327-333.

［38］ Xu P, Qiu JH, Zhang YN, et al. Efficient whole-cell biocatalytic synthesis of N-acetyl-D- neuraminic acid［J］. Advanced Synthesis & Catalysis, 2007, 349（10）：1614-1618.

［39］ Hao J, Ma C, Gao C, et al. Pseudomonas stutzeri as a novel biocatalyst for pyruvate production from DL-lactate［J］. Biotechnology Letters, 2007, 29（1）：105-110.

［40］ Lee YC, Wu HM, Wang WC, et al. The central cavity from the（α/α）6 barrel structure of Anabaena sp. CH1 N-acetyl-D- glucosamine 2-epimerase contains two key histidine residues for reversible conversion［J］. Journal of Molecular Biology, 2007, 367（3）：895-908.

［41］ Lee YC, Chien HC, Hsu WH. Production of N-acetyl-D-neuraminic acid by recombinant whole cells expressing Anabaena sp. CH1 N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase and Escherichia coli N-acetyl-D-neuraminic acid lyase［J］. Journal of Biotechnology, 2007, 129（3）：453-460.

［42］ Zhang YN, Tao F, Du MF, et al. An efficient method for N-acetyl-D-neuraminic acid production using coupled bacterial cells with a safe temperature-induced system［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86（2）：481-489.

［43］ Ishikawa M, Koizumi S. Microbial production of N-acetylneuraminic acid by genetically engineered Escherichia coli［J］. Carbohydrate Research, 2010, 345（18）：2605-2609.

［44］ Tao F, Zhang YN, Ma CQ, et al. One-pot bio-synthesis：N-acetyl-D-neuraminic acid production by a powerful engineered whole-cell catalyst［J］. Scientific Reports, 2011, 1：142.

［45］ Kang J, Gu P, Wang Y, et al. Engineering of an N-acetylneuraminic acid synthetic pathway in Escherichia coli［J］. Metabolic Engineering, 2012, 14（6）：623-629.

［46］ Lin BX, Zhang ZJ, Liu WF, et al. Enhanced production of N-acetyl-D-neuraminic acid by multi-approach whole-cell biocatalyst［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97（11）：4775-4784.

Advances in Production of N-acetyl-D-neuraminic Acid by Whole-cell Biocatalysis

Zhang Congcong Chen Caixia Chen Xiao Wen Ya Yan Liming Tao Yong
（Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

N-acetyl-D-neuraminic acid and its derivatives have versatile biological functions and considerable contribution in the therapeutics field. But the production and wide applications of Neu5Ac are limited by the low yield and high cost. With the development of Molecular Biology and the research of Glycomics, the production Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, a novel type of biocatalysis, has attracted researchers’ attention. In this paper, we report that the advances in production of Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, and also propose some guidelines for future studies.

N-acetyl-D-neuraminic acid；sialic acid；whole-cell biocatalysis；biotransformation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.020

2014-11-17

張叢叢，女，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：andrea718098@163.com

晏禮明，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物工程；E-mail：yanlm@im.ac.cn

陶勇，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：以代謝工程為基礎(chǔ)的新型生物催化劑開發(fā)與利用；E-mail：taoyong@im.ac.cn