植物細(xì)胞壁多糖合成酶系及真菌降解酶系

公維麗 王祿山 張懷強(qiáng)

（山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

植物細(xì)胞壁多糖合成酶系及真菌降解酶系

公維麗 王祿山 張懷強(qiáng)

（山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

秸稈類植物細(xì)胞壁多糖高效降解轉(zhuǎn)化對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，然而植物細(xì)胞壁在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜結(jié)構(gòu)限制了工業(yè)化酶解轉(zhuǎn)化的過程。一方面從植物細(xì)胞壁多糖合成酶系的多樣性、細(xì)胞壁多糖成分的復(fù)雜性、超分子結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性等方面綜述了形成植物細(xì)胞壁抗降解屏障的原因；另一方面從真菌降解植物細(xì)胞壁酶系的多樣性、不同菌株降解酶組成差異性等分析降解轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞壁時(shí)發(fā)揮的不同作用，從而為工業(yè)轉(zhuǎn)化合理復(fù)配真菌降解酶系，提高秸稈生物質(zhì)的利用效率提供理論支持。

植物細(xì)胞壁；抗降解屏障；多糖合成酶系；真菌降解酶系；綠色可持續(xù)發(fā)展

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著我國(guó)農(nóng)耕經(jīng)濟(jì)向著機(jī)耕經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)化，農(nóng)作物秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然廢棄物未得到充分利用，常常就地焚燒等，既浪費(fèi)了資源，又污染了環(huán)境。從化學(xué)成分分析，秸稈等生物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化為生物燃料與生物化工產(chǎn)品，相關(guān)研究已引起人們的廣泛關(guān)注。從物質(zhì)結(jié)構(gòu)角度分析，植物生物質(zhì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而致密，形成了防止微生物與酶解的抗降解屏障，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)可發(fā)酵的糖類，仍未進(jìn)入大規(guī)模生產(chǎn)階段［1］。

植物細(xì)胞壁高效降解生產(chǎn)可發(fā)酵的糖類，一方面，需要深入研究植物細(xì)胞壁中多糖的合成酶系、合成過程及其形成的超分子結(jié)構(gòu)；另一方面基于超分子結(jié)構(gòu)研究其高效降解所需要的酶類與數(shù)量，從而為合理復(fù)配高效酶系奠定理論基礎(chǔ)。只有深入研究植物細(xì)胞壁在長(zhǎng)期進(jìn)化過程形成的“系鈴”過程，才能全面了解“解鈴”降解過程中所需要的酶系統(tǒng)組成與濃度［2］。只有認(rèn)識(shí)植物細(xì)胞壁合成過程中所需要的酶類及其在植物細(xì)胞壁合成中發(fā)揮的功能，才能全面了解植物細(xì)胞壁降解過程中所需酶系及在生物轉(zhuǎn)化優(yōu)化工藝路線，提高工業(yè)應(yīng)用過程酶解的轉(zhuǎn)化整體效率。

1 植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其多糖合成酶系

植物細(xì)胞壁主要包括纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等聚合物，這些聚合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，形成微生物和酶分子都很難降解，現(xiàn)在稱為“生物質(zhì)抗降解屏障（Biomass recalcitrance）”［3］。 其中纖維素和基質(zhì)多糖（半纖維素、果膠）通過不同的路徑合成。前者由膜上大的酶復(fù)合物合成，酶復(fù)合物將微纖絲從細(xì)胞膜表面分泌出（圖1-A），而基質(zhì)多糖是由高爾基體中的合成酶合成，并通過囊泡運(yùn)輸與質(zhì)膜融合后將多糖分泌到胞外（圖1-B），這些多糖在物理作用和酶分子催化交聯(lián)作用下鑲嵌到纖維素形成的細(xì)胞壁骨架中。

雖然在不同類型細(xì)胞壁中，以纖維素作為骨架的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似，但是細(xì)胞壁半纖維素、果膠及木質(zhì)素等組分在分子結(jié)構(gòu)、種類及含量上具有較大的異質(zhì)性。纖維素由沒有側(cè)鏈分支的（1，4）-β-D-葡聚糖鏈通過大量分子間與分子內(nèi)氫鍵，以及疏水作用力形成非共價(jià)的微纖絲構(gòu)成［4］，其基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)在不同植物、器官及組織的細(xì)胞壁中是一致的，但纖維素鏈的長(zhǎng)度及結(jié)晶度具有較大的異質(zhì)性。半纖維素（木葡聚糖、甘露聚糖、β-（1，3；1，4）-葡聚糖、木聚糖）和果膠等基質(zhì)多糖結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，不僅具有多種骨架結(jié)構(gòu)，而且還含有豐富的側(cè)鏈分支，無論是從植物種類、組織層次、細(xì)胞發(fā)育時(shí)期至分子水平上相同聚合物不同局部結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性［5，6］。例如，雙子葉植物含有豐富的果膠和木葡聚糖，而在單子葉植物中這兩種多糖的含量較低，取而代之的是高含量的木聚糖和（1，3；1，4）- β-D-葡聚糖［7］。

植物細(xì)胞壁復(fù)雜結(jié)構(gòu)和異質(zhì)組分與植物基因組中參與細(xì)胞壁合成基因的多樣性和差異性表達(dá)有關(guān)［8］。在過去的幾十年，模式植物在研究植物細(xì)胞壁合成中發(fā)揮了重要作用，單子葉植物中的玉米（Zea mays L.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、水稻（Oryza sativa L.）及二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和雙子葉植物中的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花（Gossypium spp.）等已獲得了測(cè)序，據(jù)估計(jì)大約2 000多種基因的產(chǎn)物參與細(xì)胞壁的合成與維持，其中多糖的合成主要是由糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs；EC 2.4.x.y）完成。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy，http：// www.cazy.org/）收錄了能夠合成或分解復(fù)雜碳水化合物和糖復(fù)合物的酶類，基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列相似性，將碳水化合物活性酶類歸入不同的家族［9］。目前在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中糖基轉(zhuǎn)移酶分布于97個(gè)家族，其中植物的糖基轉(zhuǎn)移酶位于45個(gè)家族［10］。僅在擬南芥基因組中參與細(xì)胞壁多糖糖苷鍵合成的351種糖基轉(zhuǎn)移酶就分布于27個(gè)家族［11］；且Hansen 等［12］發(fā)現(xiàn)一些沒有被歸類到CAZy家族的可能的糖基轉(zhuǎn)移酶也參與到細(xì)胞壁的合成。但是單子葉植物細(xì)胞壁合成酶相關(guān)基因的研究滯后于雙子葉植物，尤其是擬南芥的研究。目前纖維素合成酶系，基質(zhì)多糖合成酶系及果膠合成酶系的許多進(jìn)展都是從擬南芥中獲得的［13-15］。在本篇綜述中，除擬南芥多糖合成酶系研究進(jìn)展外也包括了一些單子葉植物合成酶系的研究結(jié)果。

1.1 纖維素合成酶系

纖維素是由β-1，4糖苷鍵連接形成無分支的葡聚糖鏈構(gòu)成（圖1-A纖維素）。纖維素由位于細(xì)胞膜上的纖維素合成酶A（CESA）復(fù)合物合成，CESA具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性且歸于GT2家族，在高等植物中，CESA復(fù)合物成六角玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)，且每一個(gè)玫瑰花環(huán)亞基包括6個(gè)CESA蛋白，其中的3個(gè)CESA蛋白具有不同的結(jié)合特性，每個(gè)CESA蛋白可以合成一條葡聚糖鏈，因此CESA復(fù)合物一般可以同時(shí)合成36條葡聚糖鏈，并立即組裝成一個(gè)纖維素微纖絲基本單元［4］，其橫截面寬和高大約為5.3 nm× 3.2 nm［16］，在氫鍵和疏水作用力的作用下微纖絲可以再聚集成更大宏纖絲，但是由于微纖絲具有不同的長(zhǎng)度、橫截面區(qū)及形狀，并且可以進(jìn)行不同程度的彎曲［17］，因此微纖絲中分子鏈可以以結(jié)晶形式堆積，也存在非結(jié)晶區(qū)形式的堆積。

隨著基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，以及CESA蛋白突變體的獲得，大大增加了人們對(duì)CESA蛋白生理生化功能的認(rèn)識(shí)。在擬南芥、水稻及高粱基因組中分別包含10個(gè)CESA基因，而玉米基因組中包含20個(gè)（http：//cellwall.genomics.prudue.edu/）［13］?；谶z傳分析，CESAs分為參與初生細(xì)胞壁纖維素合成以及參與次生細(xì)胞壁合成的兩大類，在擬南芥中AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6主要負(fù)責(zé)初生細(xì)胞壁中纖維素的合成，而AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8與次生細(xì)胞壁纖維素的合成密切相關(guān)［18］（表1）。之前研究者猜想次生細(xì)胞壁中長(zhǎng)度更長(zhǎng)且結(jié)晶度更高的微纖絲可能是由纖維素酶復(fù)合物中CESA組分差異導(dǎo)致的，但是目前的一些研究顯示AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6在擬南芥的初生壁和次生壁中都有表達(dá)［19］，并且與AtCESA6具有較高相似性的AtCESA2、AtCESA5、AtCESA9參與次生細(xì)胞壁纖維素的合成，這說明參與初生壁和次生壁纖維素合成的CESAs組分并不是一成不變的。對(duì)單子葉植物纖維素合成的研究主要是基于系統(tǒng)發(fā)育分析得到的一些結(jié)果，直接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要有：Juhasz等［20］利用基因突變方法對(duì)水稻CesAs基因功能進(jìn)行研究，其結(jié)果顯示OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9基因突變導(dǎo)致次生細(xì)胞壁纖維素含量降低（表1），玉米中的12個(gè)CesA基因也得到了克隆表達(dá)，其中ZmCESA10、ZmCESA11、ZmCESA12與擬南芥中AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8屬于同源基因［20，21］。

圖1 植物細(xì)胞壁多糖合成模式圖

纖維素合成主要是由CESA基因編碼蛋白參與完成，與此同時(shí)，許多非CESA基因編碼蛋白（表1，輔助酶）也發(fā)揮了不可或缺的作用。在擬南芥中，COBRA（AT5G60920）、 COBL4（AT5G15630）、POM-POM1（AT1G05850）、 KOBITO1（AT3G08550）以及KORRIGAN1（AT5G49720）是研究較為清楚的幾種纖維素合成輔助酶，其中COBRA（AT5G60920）蛋白定位于類微管結(jié)構(gòu)蛋白上，在調(diào)節(jié)微纖絲排列方向中發(fā)揮作用，KOBITO1（AT3G08550）蛋白也有類似的功能；COBL4（AT5G15630）是COBRA的同源蛋白主要參與次生細(xì)胞壁纖維素的合成；POMPOM1（AT1G05850）是一種類似于幾丁質(zhì)酶的蛋白，可能通過蛋白與纖維素的相互作用影響纖維素的合成；而KORRIGAN1（AT5G49720）蛋白不僅可能去除纖維素合成起始引物，而且可去除葡萄糖鏈合成過程出現(xiàn)錯(cuò)誤的葡聚糖鏈，同時(shí)，微纖絲的合成終止也可能由這一蛋白參與完成［22］。

隨著對(duì)纖維素合成過程及其酶系認(rèn)識(shí)的增加，人們逐漸可以通過改變纖維素合成酶來提高生物燃料產(chǎn)率，DeBolt通過對(duì)擬南芥中AtCESA1、AtCESA3蛋白C末端跨膜結(jié)構(gòu)域的突變來降低纖維素微纖絲的結(jié)晶度從而提高糖化率［23］。但是目前還有許多重要的問題懸而未決，如CSC玫瑰花樣的TC復(fù)合物如何組裝、纖維素合成起始是否需要引物、微纖絲合成后如何聚集成束，以及纖維素的結(jié)晶程度受何種因素控制等相關(guān)問題的解決需要細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)和計(jì)算建模等領(lǐng)域的共同努力。

1.2 半纖維素合成酶系

半纖維素的化學(xué)組成主要包括（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖、木聚糖、及β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖等結(jié)構(gòu)類型，與纖維素不同，半纖維素不僅具有多樣的骨架結(jié)構(gòu)，而且還有復(fù)雜的側(cè)鏈分支。因此參與半纖維素合成的酶系比纖維素合成酶系更為復(fù)雜，不但包括骨架合成酶而且還有大量的側(cè)鏈轉(zhuǎn)移酶，并且這些酶類不是位于細(xì)胞膜上而是位于高爾基體中，因此半纖維素的合成是在高爾基體上完成的（圖1-B）。

表1 擬南芥、水稻及玉米中已鑒定的參與纖維素合成的纖維素合成酶和輔助酶組分

（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖和木聚糖骨架分別由甘露糖殘基、葡萄糖殘基和木糖殘基通過β-1，4糖苷鍵連接而成（圖1-C）。與這3種半纖維素類型不同，β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖骨架是通過β-1，4-和β-1，3-糖苷鍵連接葡萄糖殘基形成，并且β-1，4-糖苷鍵可以2個(gè)或3個(gè)連續(xù)存在，但沒有連續(xù)的β-1，3-糖苷鍵，因此β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖可以看作纖維三糖和纖維四糖通過β-1，3-糖苷鍵連接而成的葡聚糖。

類纖維素合成酶基因（Cellulose synthases-like genes，Csls）編碼的多糖合成酶（類纖維素合成酶）參與半纖維素骨架合成，Csls與CesA基因具有很高的相似性，目前，9個(gè)類纖維素合成酶（Csl）基因（CslA-H 和J）家族和1個(gè)纖維素合成酶（CesA）基因家族構(gòu)成了纖維素合成酶基因超家族（表2），并且CslF、CslH只在禾本科植物中檢測(cè)到，而CslB和CslG是非禾本科植物所獨(dú)有的。類纖維素合成酶和纖維素合成酶一樣位于GT2家族，是含有多個(gè)跨高爾基體膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domains，TMDs）的完整膜蛋白。對(duì)纖維素合成酶功能的研究主要采用基因突變的方法，但是由于類纖維素合成酶基因在不同物種中存在差異，因此這一方法對(duì)研究類纖維素合成酶功能并不適合，對(duì)類纖維素合成酶功能的認(rèn)識(shí)主要通過異源表達(dá)等方法獲得。

CslA基因家族的多個(gè)基因編碼（半乳）甘露聚糖骨架合成酶（ManS），在雙子葉植物擬南芥和楊樹（Populus trichocarpa） 中，AtCSLA2、AtCSLA3、AtCSLA7、AtCSLA9和PtCSLA1的β-甘露聚糖合成酶活性已經(jīng)在體外得到了驗(yàn)證。同時(shí)，在單子葉植物魔芋（Amorphophallus konjac）中，異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CslA3的直系同源蛋白AkCSLA3可以同時(shí)利用GDP-甘露糖和GDP-葡萄糖來合成甘露聚糖。除CslA之外，CSLD 蛋白（AtCSLD2，3和 5）及MSR基因編碼蛋白也可能參與到甘露聚糖骨架的合成［24］。木葡聚糖骨架合成是由CslC 基因家族的一個(gè)或多個(gè)基因參與，研究者對(duì)旱金蓮（Tropaeolum majus）種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析得出TmCSLC4基因與木葡聚糖合成相關(guān)，對(duì)其異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)只有與木葡聚糖木糖基轉(zhuǎn)移酶（XyG∶XylT）共表達(dá)時(shí)才可以合成β-1，4-葡聚糖，但這一過程并不需要UDP-木糖基的存在，因此XyG∶XylT蛋白是木葡聚糖骨架合成所必需［25］。通過比較基因組學(xué)分析，Burton等［26］發(fā)現(xiàn)CslH和CslF 是禾本科植物所獨(dú)有的CSL基因家族，由此推測(cè)CslH和CslF在β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖合成中可能發(fā)揮功能，并采用轉(zhuǎn)基因等方法對(duì)他們的推測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證。但是這些蛋白具體是參與β-1，4-鍵還是β-1，3-鍵的合成，目前研究得還不清楚。與上述3種半纖維素類型不同，目前沒有試驗(yàn)證據(jù)顯示CSL蛋白在木聚糖骨架合成中發(fā)揮作用，而IRX9（GT43）、IRX14（GT43）及 IRX10（GT47）等其他GT家族的GT酶被認(rèn)為代替它們發(fā)揮功能，但是對(duì)木聚糖骨架合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

除β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖沒有側(cè)鏈以外，（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖和木聚糖都具有短的糖鏈、乙?；蚍尤┗鶊F(tuán)等側(cè)鏈分支。多種多樣的糖基轉(zhuǎn)移酶（GlyTs）負(fù)責(zé)將這些不同的側(cè)鏈基團(tuán)添加到多糖骨架上［27］。

（半乳）甘露聚糖取代基包括α-1，6-半乳糖殘基和O-乙?；?。α-1，6-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶最早是在胡蘆巴（Trigonella foenum-graecum）中得到鑒定，也是第一個(gè)純酶活性得到驗(yàn)證的參與植物細(xì)胞壁合成的GT酶［24］，O-乙?；奶砑涌赡苁怯蒚BL（Trichome birefringence-like）蛋白家族的O-乙?；D(zhuǎn)移酶參與完成，TBL 基因家族是植物所特有的O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因家族（表2，乙?；D(zhuǎn)移酶），甘露聚糖、木葡聚糖的O-乙?；夹枰@一基因家族編碼蛋白參與［28］。

木葡聚糖側(cè)鏈基本基團(tuán)有：D-木糖殘基、D-半乳糖殘基和L-巖藻糖基，在雙子葉植物和非禾本科單子葉植物中木葡聚糖具有規(guī)則的取代模式，每4個(gè)骨架葡萄糖殘基中的連續(xù)3個(gè)通過α-1，6糖苷鍵與木糖殘基相連，第2和第3個(gè)木糖殘基可以被半乳糖通過β-1，2糖苷鍵取代，而第2個(gè)半乳糖殘基還可以進(jìn)一步被巖藻糖基通過α-1，2糖苷鍵取代。幾種木葡聚糖木糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)得到了鑒定，在擬南芥中，7個(gè)基因編碼蛋白位于GH34家族，其中5個(gè)具有木葡聚糖木糖基轉(zhuǎn)移酶活性，但是目前還不清楚木葡聚糖中木糖殘基取代模式的形成機(jī)制。第2和第3位木糖半乳糖基分別由AtMUR3 和AtXLT2添加，這兩個(gè)蛋白是位于GH47家族的β-1，2 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。第2位半乳糖殘基上巖藻糖基的進(jìn)一步取代是由GT37家族的木葡聚糖α -1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（AtFUT1）參與完成，fut1/mur2的突變導(dǎo)致擬南芥中木葡聚糖的完全去巖藻糖基化，說明AtFUT1是非冗余蛋白［29］。除了規(guī)則的糖基取代模式之外，在不同植物類型中木葡聚糖的不同位置可以被乙酰基取代，在擬南芥中O-乙?；梢蕴囟ǖ匕l(fā)生在半乳糖殘基，由TBL家族的AtAXY4編碼蛋白介導(dǎo)；而在禾本科植物和茄目物種中，木葡聚糖骨架中的葡萄糖殘基可以被O-乙?；?，但是，目前負(fù)責(zé)這一修飾的特定基因還沒有得到鑒定［24］。與此同時(shí)，一些實(shí)驗(yàn)表明幾種XyG修飾蛋白包括內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶（XTHs）對(duì)改變木葡聚糖長(zhǎng)度，將其鑲嵌到細(xì)胞壁中，或者是在細(xì)胞伸長(zhǎng)過程中重塑細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有重要作用［30］。

木聚糖側(cè)鏈取代基在不同物種及組織中存在較大差異，通常木聚糖骨架可以被葡萄糖醛酸（GlcA）和4-O-甲基葡萄糖醛酸（MeGlcA）通過α-1，2糖苷鍵取代，同時(shí)O-乙酰基團(tuán)也可以通過酯鍵與骨架相連。在單子葉植物中，除了上面的取代基團(tuán)之外，大量的阿拉伯呋喃糖基（Araf）可以通過α-1，3或/和α-1，2-糖苷鍵與骨架相連。此外，阿拉伯呋喃糖還可以與阿魏酸或香豆酸形成酯鍵從而與木素相互交連。近年來，雖然對(duì)木聚糖骨架合成研究取得的進(jìn)展較小，但對(duì)木聚糖取代基合成研究進(jìn)展較大。在擬南芥中，AtGUX1 和AtGUX2負(fù)責(zé)將葡萄糖醛酸殘基添加到木聚糖骨架上，對(duì)多種gux突變體及相應(yīng)回補(bǔ)菌株研究表明GUX蛋白的多樣性決定了木聚糖中不同的葡萄糖醛酸取代模式［31］。擬南芥中葡萄糖醛酸的進(jìn)一步取代與一種木聚糖甲基轉(zhuǎn)移酶（GXMT/GMX3）相關(guān)，GXMT/GMX3突變導(dǎo)致葡萄糖醛酸的甲基取代減少75%［24］。在水稻中，GT61家族的OsXAX1參與木聚糖β-木糖-1-2-α-阿拉伯糖側(cè)鏈中木糖基的添加，同時(shí)，OsXAX1突變植物中阿魏酸和香豆酸等組分缺少，但是具體作用機(jī)制還不明確［32］。同屬于GT61家族的XATs與木聚糖中阿拉伯呋喃糖殘基側(cè)鏈形成具有密切關(guān)系，Anders等［33］對(duì)小麥胚乳中的TaXAT1和TaXAT261敲除后木聚糖α-1，3-連接的阿拉伯取代基減少，而回補(bǔ)后恢復(fù)取代水平。

雖然利用功能基因組學(xué)的方法已經(jīng)對(duì)多種參與半纖維素合成酶進(jìn)行了鑒定，但是對(duì)半纖維素合成酶系的深入研究也面臨許多挑戰(zhàn)。例如，這些酶類的晶體結(jié)構(gòu)、酶活性及底物特異性怎樣，以及它們?cè)跁r(shí)間和空間尺度上是怎樣相互合作來高效有序的合成這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多糖。隨著比較基因組學(xué)，標(biāo)記代謝組學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，這些問題將逐漸被解決。

1.3 果膠合成酶系

果膠是植物細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的多糖，其含量約占禾本科植物細(xì)胞壁的2%-10%，占雙子葉植物和非禾本科單子葉植物初生細(xì)胞壁的35%，主要包括聚半乳糖醛酸（HG）、木糖聚半乳糖醛酸（XG）、鼠李聚半乳糖醛酸 Ⅰ（RG Ⅰ）和鼠李聚半乳糖醛酸Ⅱ（RG Ⅱ）4種結(jié)構(gòu)類型（圖1-A果膠）［2］，其中HG是由半乳糖醛酸通過α-1，4糖苷鍵形成的聚糖，高達(dá)80% 半乳糖醛酸的羧基可以被甲基酯化，其O-2 或O-3位置還可被乙?；?，一些半乳糖醛酸的O-3位置可以被β-D-木糖取代形成木糖聚半乳糖醛酸（XG），RG Ⅱ也是聚半乳糖醛酸（HG）的進(jìn)一步取代形式，并有4種不同類型的側(cè)鏈。與以上3種果膠類型不同，RG Ⅰ骨架是由重復(fù)的［4）-α-D-半乳糖醛酸-（1，2）-α-L-鼠李糖-（1，］n聚合而成，其側(cè)鏈包括α-1，5-L-阿拉伯聚糖、β-1，4-D-半乳聚糖和β-1，6-D-半乳聚糖，果膠的合成至少需要67種糖基轉(zhuǎn)移酶參與完成［34］。

目前研究果膠合成轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因的進(jìn)展緩慢，主要是由于很難獲得有活性的純果膠合成酶，只有少數(shù)果膠合成酶酶活性得到生化驗(yàn)證（表3），另外還有一些基因可能參與到果膠的合成，主要包括參與HG、XG和RGⅠ骨架合成的HG半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，以及與側(cè)鏈添加相關(guān)的HG甲基轉(zhuǎn)移酶、RGⅠα-1，5-阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶、RGⅠβ-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、RG Ⅱα-1，3-木糖基轉(zhuǎn)移酶和XGα-1，3-木糖基轉(zhuǎn)移酶。通過免疫共沉淀方法研究發(fā)現(xiàn)GAUT1和GAUT7形成HG∶GalAT復(fù)合物參與果膠合成，且GAUT1∶GAUT7是HG∶GalAT的核心組分，與這一復(fù)合物相互作用的12個(gè)蛋白也可能在果膠合成中發(fā)揮作用［35］。這一多糖合成復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)為理解植物細(xì)胞壁糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組裝及其在復(fù)雜多糖合成中如何發(fā)揮作用提供了參考，同時(shí)也增加人們對(duì)GTs及多糖修飾酶多樣性的認(rèn)識(shí)。

果膠合成酶位于高爾基體中，與半纖維素一樣，果膠的合成也是在高爾基體中完成。關(guān)于果膠合成有兩個(gè)假設(shè)模型，（1）連續(xù)的糖基轉(zhuǎn)移酶模型（Consecutive glycosyltransferase model）；（2）結(jié)構(gòu)域合成模型（Domain synthesis model），這兩個(gè)模型在果膠合成酶添加果膠結(jié)構(gòu)單元方式上存在差異，但認(rèn)為兩者果膠骨架的延伸和修飾側(cè)鏈添加都是在高爾基體中完成，通過囊泡運(yùn)輸釋放到胞外，從而與細(xì)胞壁骨架相互交聯(lián)。

表2 已鑒定的參與半纖維素骨架和側(cè)鏈合成的半纖維素合成酶

2 植物細(xì)胞壁多糖真菌降解酶系

植物細(xì)胞壁中多糖合成酶系合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖，形成了抵抗微生物及相關(guān)酶系降解的“抗降解屏障”。同樣，微生物在與植物共同進(jìn)化過程中也形成了許多降解細(xì)胞壁的策略［6］。尤其是真菌通過分泌大量的游離酶系在降解植物生物質(zhì)中發(fā)揮了重要作用，隨著越來越多真菌基因組數(shù)據(jù)的獲得，人們對(duì)真菌降解植物細(xì)胞壁的生物多樣性也有了更為深入的認(rèn)識(shí)，在進(jìn)化過程中由于不同真菌生存環(huán)境存在差異，因此其降解酶種類及數(shù)量也各不相同。例如，瑞氏木霉（Trichoderma reesei）具有更加高效的纖維素降解酶系，曲霉屬（Aspergillus sp.）部分物種分泌更多的降解果膠酶系，而草酸青霉（Penicillium oxalicum）具有更多數(shù)量的纖維素酶和半纖維素酶系（表4）［13，36，37］。

碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）不僅包含不同GT家族的參與植物細(xì)胞壁多糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，而且包含不同家族的降解多糖的糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GH）。參與植物細(xì)胞壁降解的真菌酶類被歸入糖苷水解酶（GHs）家族、碳水化合物酯酶（Carbohydrateesterases，CEs）家族、多糖裂解酶（Polysaccharide lyases，PLs）家族和輔助酶類（Auxiliary activities，AAs）家族，這些不同家族的降解酶協(xié)同對(duì)纖維素、半纖維素及果膠等多糖降解。

表3 擬南芥基因組中已經(jīng)驗(yàn)證與預(yù)測(cè)的果膠合成酶基因

2.1 纖維素降解酶系

雖然纖維素只有一種結(jié)構(gòu)單元和一種鍵型，但是其形態(tài)具有結(jié)晶區(qū)和非晶區(qū)的差異。降解纖維素的絲狀真菌通常分泌3種典型酶類［38］：β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（EGL，EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（CBH，EC 3.2.1.91；EC3.2.1.176）以及β-葡萄糖苷酶（BGL，EC 3.2.1.21）［39］，內(nèi)切葡聚糖酶從無定型區(qū)內(nèi)部水解纖維素鏈的糖苷鍵，產(chǎn)生的葡聚糖鏈可以進(jìn)一步被外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶降解，外切纖維素酶對(duì)結(jié)晶區(qū)的降解具有重要作用，可以從纖維素鏈還原端（CBH I，EC 3.2.1.176）或非還原端（CBH Ⅱ，EC 3.2.1.91）持續(xù)降解產(chǎn)生纖維二糖，纖維二糖可以進(jìn)一步被β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖，這對(duì)解除外切纖維素酶的產(chǎn)物抑制起著不可或缺的作用。

內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶具有大量的同工酶，并且分布于不同的家族，真菌內(nèi)切葡聚糖酶主要位于GH5、GH7、GH12、GH45等家族，外切葡聚糖酶主要分布于GH6、GH7家族，而β-葡萄糖苷酶的主要家族有GH1、GH3家族［40］。雖然大部分降解木質(zhì)纖維素的絲狀真菌都可以分泌這三種酶類，但同工酶的數(shù)量及分布的家族存在明顯差異。例如，黑曲霉具有7個(gè)EGLs分別位于GH5 和GH12家族中，6個(gè)CBHs分布于GH6和GH7家族，以及15個(gè)BGLs位于GH1和GH3家族，比較而言，降解纖維素最為高效的真菌之一——瑞氏木霉，具有7個(gè)EGLs，分布于GH5、GH7、GH12及GH45家族，2個(gè)高效表達(dá)的CBHs位于GH6和GH7家族，以及11個(gè)位于GH1和GH3家族的BGLs。研究顯示，GH5、GH6、GH7、GH9、GH12及GH45家族的內(nèi)切葡聚糖酶同工酶的底物專一性存在差異［41］。利用熒光輔助糖電泳對(duì)瑞氏木霉等產(chǎn)的4個(gè)內(nèi)切纖維素酶作用模式研究表明，它們結(jié)合的糖鏈聚合度存在差異，產(chǎn)物譜也各不相同［42］。因此纖維素酶功能還需要進(jìn)一步細(xì)化，如EGL不是

簡(jiǎn)單的作用于無定型區(qū)，而應(yīng)是對(duì)特定長(zhǎng)度的寡糖有專一性。

表4 瑞氏木霉、黑曲霉、草酸青霉基因組中纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表4 （續(xù)）瑞氏木霉、黑曲霉、草酸青霉基因組中纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

除了經(jīng)典類型的纖維素降解酶之外，最近研究發(fā)現(xiàn)，大量的輔助酶類也參與到纖維素的降解［38］。多糖單氧化物酶（PMOs）是銅離子依賴酶，屬于AA9家族，可以接受纖維二糖脫氫酶（Cellobiose dehydrogenases，CDHs）氧化纖維二糖提供的電子對(duì)纖維素氧化降解，PMOs作用于纖維素表面而無需從結(jié)晶纖維素中解離出單根葡聚糖鏈。在粗糙脈胞菌中，敲除一個(gè)纖維二糖脫氫酶基因就可以使其總纖維素酶酶活降低一半，這說明氧化還原系統(tǒng)是纖維素降解機(jī)制中非常重要的部分［43］。不同絲狀真菌之間PMOs編碼基因的數(shù)量具有很大差異，糞殼菌綱的一些種類，如球毛殼菌、粗糙脈胞菌等，PMOs編碼基因的數(shù)量明顯高于黑曲霉和瑞氏木霉［16］。與此同時(shí)，絲狀真菌基因組編碼和表達(dá)大量的PMOs同工酶，類似于內(nèi)切纖維素酶同工酶，這些PMOs同工酶可能在纖維素的精細(xì)結(jié)構(gòu)中具有不同的作用位點(diǎn)［16，44］。Swollenin是與植物擴(kuò)展蛋白（Expansins）具有序列同源性的一種蛋白（圖2-A），最早是在瑞氏木霉中鑒定和表達(dá)，在纖維素酶中添加Swollenin蛋白后可以顯著提高纖維素酶降解濾紙的效率［45］。目前認(rèn)為Swollenin作用機(jī)制是影響微纖絲的超微結(jié)構(gòu)，使微纖絲之間的空隙變大，增加纖維素酶對(duì)微纖絲中葡聚糖鏈的可及性，而不是直接斷裂微纖絲產(chǎn)生可檢測(cè)的葡聚糖鏈還原端。Cip1（Cellulose induced protein-1）和Cip2（Cellulose induced protein-2）蛋白最早是在瑞氏木霉轉(zhuǎn)錄分析中檢測(cè)到，兩者都包含一個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）并與已知的纖維素酶共調(diào)控［46］，瑞氏木霉Cip1對(duì)p-硝基苯-β-D-纖維二糖苷具有微弱的降解活性，并可以與PMO及Swollenin協(xié)同作用，但是其具體作用機(jī)制還是未知的［38］，Cip2具有酯酶活性，可以斷裂4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸的甲酯鍵［16］。在植物細(xì)胞壁的降解中纖維素底物的暴露是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，輔助蛋白可以顯著提高這一環(huán)節(jié)的效率［47］。因此，在工業(yè)應(yīng)用中對(duì)這些輔助蛋白功能的深入研究是十分必要的。

2.2 半纖維素降解酶系

在半纖維素合成的論述中已提到，它具有復(fù)雜的骨架結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈分支，所以對(duì)它的降解不僅需要骨架降解酶，而且還需要大量的側(cè)鏈降解酶。

木聚糖骨架是由β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-1，4-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）降解（圖2-D），真菌分泌的β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶主要位于GH10和GH11家族［48］，通常GH10家族的木聚糖酶比GH11家族的酶組分具有更廣泛的底物專一性，它不僅可以降解線性的木聚糖鏈，而且可以降解高度取代基的木聚糖骨架和木寡糖，因此GH10家族的木聚糖酶對(duì)于含有取代基的木聚糖降解更徹底［40］。內(nèi)切木聚糖酶降解產(chǎn)生的木寡糖可以被β-木糖苷酶進(jìn)一步降解，大多數(shù)真菌的β-木糖苷酶位于GH3家族，但是一些真菌的β-木糖苷酶位于GH43家族，如米曲霉［49］。

真菌分泌的降解木葡聚糖骨架的木葡聚糖β-1，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.151）（圖2-B）主要位于GH12和GH74家族，這兩個(gè)家族的酶具有不同的作用模式。黑曲霉GH12家族的木葡聚糖β-1，4-葡聚糖酶不能斷裂含有取代基的葡萄糖苷鍵，并且更傾向于降解至少包含6個(gè)葡萄糖殘基的木葡寡糖，且其中至少有一個(gè)葡萄糖殘基未被取代；而瑞氏木霉GH74家族的木葡聚糖酶可以降解更短的木葡寡糖，降解活性也不受取代基的影響［50］，因此GH74家族的β-1，4-葡聚糖酶可以對(duì)木葡聚糖骨架進(jìn)行更為有效的降解。

降解甘露聚糖骨架的內(nèi)切甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）（圖2-E）屬于GH5和GH26家族。真菌的內(nèi)切甘露聚糖酶主要位于GH5家族，并且研究顯示，黑曲霉和瑞氏木霉GH5家族的內(nèi)切甘露聚糖酶都具有底物專一性，都只能降解含有3個(gè)以上D-甘露糖殘基的甘露寡糖［51］；內(nèi)切甘露聚糖酶產(chǎn)生的甘露二糖或甘露三糖可以進(jìn)一步被GH2家族的β-1，4-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.23）降解，因此甘露糖苷酶對(duì)甘露聚糖骨架徹底降解為甘露糖結(jié)構(gòu)單元起著重要作用。

β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖雖然同纖維素一樣都是由β-D-葡萄糖構(gòu)成，但是由于兩者合成酶合成鍵型的差異，所以在降解過程中除了降解纖維素的β-1，4-葡聚糖酶（纖維素酶EC 3.2.1.4）之外，還需要另外3種類型的酶組分：β-1，3-1，4-葡聚糖酶（地衣聚糖酶，EC 3.2.1.73）、 β-1，3-葡聚糖酶（海帶多糖酶，EC 3.2.1.39）和 β-1，3（4）-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6），它們主要位于GH16、GH17、GH55、GH64、GH71、GH81家族中［52，53］。

半纖維素側(cè)鏈完全降解需要至少9種活性酶的作用，這些酶位于至少11個(gè)GH家族和4個(gè)CE家族，酶種類主要包括α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-木糖苷酶、α-巖藻糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、p-香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶［40］。

L-阿拉伯糖是木葡聚糖和（阿拉伯）木聚糖中常見的取代基，可以被α-阿拉伯呋喃糖苷酶（Abf）（EC 3.2.1.55）和阿拉伯木聚糖-阿拉伯呋喃糖苷酶（圖2-B，2-D）從木葡聚糖和（阿拉伯）木聚糖中降解出來，真菌的α-阿拉伯呋喃糖苷酶主要位于GH51和GH54家族，對(duì)黑曲霉兩個(gè)分別位于GH51和GH54家族的α-阿拉伯呋喃糖苷酶底物專一性研究顯示，AbfA（GH51）可以降解阿拉伯聚糖而AbfB（GH54）具有碳水化合物結(jié)合模塊（CBM 42）還可以特定的降解半纖維素中的阿拉伯呋喃糖取代基。

與木葡聚糖骨架通過α-糖苷鍵連接的D-木糖殘基的可以被α-木糖苷酶（EC 3.2.1.177）降解，曲霉基因組分析數(shù)據(jù)顯示，α-木糖苷酶降解位于GH31家族，這已通過在畢赤酵母中過表達(dá)得到驗(yàn)證［54］。

L-巖藻糖苷基是木葡聚糖的主要取代基，可以被位于GH29和GH95家族的α-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）降解，許多植物的α-巖藻糖苷酶可以降解木葡聚糖巖藻糖側(cè)鏈，但在真菌中，只有黑曲霉（A. niger）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）和多色青霉（Penicillium multicolor）分泌的α-巖藻糖苷酶可以降解木葡聚糖中的巖藻糖苷基［40］。

在木聚糖和半乳甘露聚糖中，D-半乳糖苷基可通過α-糖苷鍵與骨架相連，α-半乳糖苷基可被GH27和 GH36家族的α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）（圖2-D，2-E）降解，這兩個(gè)家族的α-半乳糖苷酶都采用雙交換機(jī)制，并具有共同的進(jìn)化起源，通常GH36家族的α-半乳糖苷酶分子量更大且對(duì)單糖和寡糖都具有降解作用［55］。在木葡聚糖和半乳葡甘露聚糖中，D-半乳糖苷基還可通過β-糖苷鍵連接到骨架上，這說明β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.25）（GH2 和 GH35）在降解含有β-半乳糖殘側(cè)鏈的半纖維素中具有重要作用（圖2-B，2-E），研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，將黑曲霉的β-半乳糖苷酶（LacA）添加到酶復(fù)合物中可以顯著提高小麥粉中D-半乳糖基的釋放［56］。

D-葡萄糖醛酸殘基是木聚糖的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，由位于GH67家族和新鑒定的GH115家族α-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.131）降解，兩個(gè)家族的酶在底物專一性上存在明顯差異，GH67家族的酶對(duì)寡糖具有降解活性而GH115家族的酶對(duì)木聚糖聚合物的降解起作用。Chong等的研究顯示，GH67家族α-葡萄糖醛酸酶廣泛分布于子囊菌分泌酶系中，而GH115家族的酶既存在于子囊菌，也存在于擔(dān)子菌中［40］。

乙?；悄揪厶堑某Ｒ娙〈?，它是由CE1、 CE4、CE5和CE16家族的乙酰木聚糖酯酶降解，乙酰木聚糖酯酶的存在對(duì)內(nèi)切木聚糖酶有效降解木聚糖骨架具有重要作用，如只有當(dāng)乙酰木聚糖酯酶存在時(shí)，黑曲霉的3個(gè)內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶才可有效降解樺木木聚糖［57］。

阿魏酸和p-香豆酸對(duì)木聚糖和木素的交聯(lián)具有重要作用，可以被阿魏酸酯酶/香豆酸酯酶移除，但是這些酯酶大部分還沒有被歸類到相應(yīng)的CE家族。

2.3 果膠降解酶系

在果膠的4種類型中，聚半乳糖醛酸（HG）、木糖聚半乳糖醛酸（XG）和鼠李聚半乳糖醛酸Ⅱ（RGⅡ）具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，鼠李聚半乳糖醛酸 Ⅰ（RGⅠ）骨架與前3者存在差異，四者具有甲基、乙?；吞擎湹炔煌娜〈鶊F(tuán)。

對(duì)果膠骨架降解的真菌降解酶主要分為兩種類型：糖苷水解酶和果膠裂解酶（PLs）（圖2-F）。糖苷水解酶主要位于GH28家族，根據(jù)它們作用果膠骨架部位的不同分為內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.15）、外切聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.67）、內(nèi)切鼠李聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.171）、外切鼠李聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.173）、木糖聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.-）和α-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40），同時(shí)GH88家族的不飽和葡萄糖醛酸水解酶（EC 3.2.1.-）和GH105家族的不飽和鼠李半乳糖醛酸水解酶（EC 3.2.1.172）也參與果膠骨架的降解。果膠裂解酶和果膠酸裂解酶都采用β-消除機(jī)制斷裂果膠中沒有取代基部分的α-1，4-糖苷鍵，果膠裂解酶主要位于PL1家族，果膠酸裂解酶在PL1、PL3和 PL9家族都有分布，鼠李半乳糖醛酸裂解酶與果膠裂解酶和果膠酸裂解酶結(jié)構(gòu)上存在差異，作用底物部位也不同，它可降解果膠骨架中含有取代基的部分。

降解果膠骨架的糖苷水解酶和裂解酶也具有大量的同工酶。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉基因組的7個(gè)內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶分別表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特性、甲基敏感性和作用模式［37］，米曲霉的15個(gè)半乳糖醛酸酶對(duì)聚半乳糖醛酸表現(xiàn)出不同的底物特異性［58］，同工酶的不同作用特點(diǎn)說明了對(duì)于多糖的降解需要大量同工酶的共同作用。

圖2 真菌基因組中降解纖維素、半纖維素和果膠相關(guān)酶類

木糖聚半乳糖醛酸和鼠李聚半乳糖醛酸側(cè)鏈的去除還需要側(cè)鏈降解酶的作用，絲狀真菌分泌的α-阿拉伯呋喃糖苷酶（GH51和 GH54）、β-半乳糖苷酶（GH2 和 GH35）和β-木糖苷酶（GH3和GH43）不僅對(duì)半纖維素側(cè)鏈起作用，而且在果膠側(cè)鏈去除中也發(fā)揮功能。此外，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶（GH43），外切阿拉伯聚糖酶（GH93），β-內(nèi)切半乳聚糖酶（GH53）和幾種酯酶（CE8、 CE12及 CE13）只對(duì)果膠側(cè)鏈進(jìn)行降解。

3 展望

植物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示了植物基因組中含有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶，僅在擬南芥基因組中就有351種，由于糖基轉(zhuǎn)移酶的作用特異性使得每種糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)應(yīng)著一種糖苷鍵，由此推測(cè)植物細(xì)胞壁中有幾百種糖苷鍵類型［59］，因此將這些糖苷鍵斷裂實(shí)現(xiàn)單糖的有效釋放也相應(yīng)的需要多種糖苷水解酶的作用。絲狀真菌雖然是降解植物細(xì)胞壁多糖的主要類群，但是對(duì)已測(cè)序的絲狀真菌基因組同源注釋分析表明，單一絲狀真菌基因組中糖苷水解酶的數(shù)量要遠(yuǎn)少于植物細(xì)胞壁糖苷鍵類型［19］，所以單一一種絲狀真菌并不能將復(fù)雜的天然生物質(zhì)（Natural biomass）徹底有效的降解，必須依靠多種微生物的協(xié)同作用。絲狀真菌糖苷水解酶基因注釋提供了一定的絲狀真菌降解酶種類的信息，但只有少量的糖苷水解酶功能得到了生化功能驗(yàn)證，大量糖苷水解酶的生化功能驗(yàn)證將不僅有助于真菌基因組更好的注釋，而且為植物細(xì)胞壁多糖的有效降解提供更多具有明確、精細(xì)降解功能的酶資源。研究需通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、蛋白質(zhì)組技術(shù)及結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)技術(shù)等進(jìn)行高通量的功能分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

植物基因組中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)在不同植株、不同組織以及細(xì)胞的不同生長(zhǎng)周期都存在顯著差異，合成的多糖種類、結(jié)構(gòu)及含量也具有明顯異質(zhì)性（Heterogeneity）［60］。而絲狀真菌主要為腐生真菌或植物病原菌，在與植物共同進(jìn)化過程中形成了降解特定類型多糖的降解酶系，對(duì)于不同的多糖具有各自的降解優(yōu)勢(shì)和偏好性。King等［7］對(duì)156種真菌的降解酶譜分析發(fā)現(xiàn)，以單子葉植物作為宿主的植物病原菌對(duì)于單子葉植物的半纖維素和細(xì)胞壁類型具有更高的降解能力，而雙子葉植物病原菌更傾向于降解雙子葉植物的木葡聚糖等半纖維素。對(duì)絲狀真菌降解天然生物質(zhì)偏好性的研究，將會(huì)為尋找降解特定底物的優(yōu)勢(shì)降解酶系，根據(jù)底物類型復(fù)配降解酶系提供指導(dǎo)，從而為工業(yè)轉(zhuǎn)化合理復(fù)配微生物降解區(qū)系，提高秸稈生物質(zhì)的利用效率提供理論支持。

［1］ Brandt A, Gr?svik J, Hallett JP, et al. Deconstruction of lignocellulosic biomass with ionic liquids［J］. Green Chemistry, 2013, 15（3）：550-583.

［2］ Himmel ME, Ding SY, Johnson DK, et al. Biomass recalcitrance：engineering plants and enzymes for biofuels production［J］. Science, 2007, 315（5813）：804-807.

［3］ 曲音波, 王祿山. 生物質(zhì)的抗降解性及其生物煉制中的科學(xué)問題［M］. 中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué), 2009, 11（5）：55-58.

［4］ 孟凡輝, 蔣緒愷, 劉琳, 等. 纖維素酶解速度的可視化表征與限制因素分析［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2015, 42（3）：201-210.

［5］ Burton RA, Gidley MJ, Fincher GB. Heterogeneity in the chemistry, structure and function of plant cell walls［J］. Nature Chemical Biology, 2010, 6（10）：724-732.

［6］ Sarkar P, Bosneaga E, Auer M. Plant cell walls throughout evolution：towards a molecular understanding of their design principles［J］. Journal of Experimental Botany, 2009, 60（13）：3615-3635.

［7］ King BC, Waxman KD, Nenni NV, et al. Arsenal of plant cell wall degrading enzymes reflects host preference among plant pathogenic fungi［J］. Biotechnology for Biofuels, 2011, 4（4）：1-14.

［8］ Fangel JU, Ulvskov P, Knox JP, et al. Cell wall evolution and diversity［J］. Frontiers in Plant Science, 2012, 3（152）：1-8.

［9］ 王帥, 張懷強(qiáng), 王祿山, 等. 碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）及其研究趨勢(shì)［J］. 生物加工過程, 2014, 12（1）：102-108.

［10］ Ribeiro DA, Cota J, Alvarez TM, et al. The Penicillium echinulatum secretome on sugar cane bagasse［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：1-9.［11］ Liepman AH, Wightman R, Geshi N, et al. Arabidopsis-a powerful model system for plant cell wall research［J］. The Plant Journal, 2010, 61（6）：1107-1121.

［12］ Hansen SF, Harholt J, Oikawa A, et al. Plant glycosyltransferases beyond CAZy：a perspective on DUF families［J］. Frontiers in Plant Science, 2012, 3（59）：1-10.

［13］ Henrissat B, Coutinho PM, Davies GJ. A census of carbohydrateactive enzymes in the genome of Arabidopsis thaliana［M］. Plant Cell Walls Springer, 2001：55-72.

［14］ Liu G, Zhang L, Wei X, et al. Genomic and secretomic analyses reveal unique features of the lignocellulolytic enzyme system of Penicillium decumbens［J］. PLoS One, 2013, 8（2）：1-12.

［15］ Zhao X, Zhang L, Liu D. Biomass recalcitrance. Part I：the chemical compositions and physical structures affecting the enzymatic hydrolysis of lignocellulose［J］. Biofuels, Bioproducts and Biorefining, 2012, 6（4）：465-482.

［16］ Glass NL, Schmoll M, Cate JH, et al. Plant cell wall deconstruction by ascomycete fungi［J］. Annual Review of Microbiology, 2013, 67：477-498.

［17］ Zhao Z, Shklyaev OE, Nili A, et al. Cellulose microfibril twist, mechanics, and implication for cellulose biosynthesis［J］. The Journal of Physical Chemistry A, 2013, 117（12）：2580-2589.

［18］ Chundawat SP, Beckham GT, Himmel ME, et al. Deconstruction of lignocellulosic biomass to fuels and chemicals［J］. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2011, 2：121-145.

［19］ Zhao Z, Liu H, Wang C, et al. Comparative analysis of fungal genomes reveals different plant cell wall degrading capacity in fungi［J］. BMC Genomics, 2013, 14（1）：274-289.

［20］ Juhasz T, Szengyel Z, Reczey K, et al. Characterization of cellulases and hemicellulases produced by Trichoderma reesei on various carbon sources［J］. Process Biochemistry, 2005, 40（11）：3519-3525.

［21］ Stricker AR, Mach RL, De Graaff LH. Regulation of transcription of cellulases-and hemicellulases-encoding genes in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina（Trichoderma reesei）［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78（2）：211-220.

［22］ Goyal H, Seal D, Saxena R. Bio-fuels from thermochemical conversion of renewable resources：a review［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2008, 12（2）：504-517.

［23］ Li Y, Horsman M, Wu N, et al. Biofuels from microalgae［J］. Biotechnology progress, 2008, 24（4）：815-820.

［24］ Pauly M, Gille S, Liu L, et al. Hemicellulose biosynthesis［J］. Planta, 2013, 238（4）：627-642.

［25］ Crutzen PJ, Mosier AR, Smith KA, et al. N2O release from agrobiofuel production negates global warming reduction by replacing fossil fuels［J］. Atmospheric Chemistry and Physics, 2008, 8（2）：389-395.

［26］ Burton RA, Wilson SM, Hrmova M, et al. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall（1, 3；1, 4）- -D-glucans［J］. Science, 2006, 311（5769）：1940-1942.

［27］ Huntley ME, Redalje DG. CO2mitigation and renewable oil from photosynthetic microbes：a new appraisal［R］. Mitigation and adaptation strategies for global change, 2007, 12（4）：573-608.

［28］ Gille S, de Souza A, Xiong G, et al. O-acetylation of Arabidopsis hemicellulose xyloglucan requires AXY4 or AXY4L, proteins with a TBL and DUF231 domain［J］. The Plant Cell Online, 2011, 23（11）：4041-4053.

［29］ Zabotina OA, Avci U, Cavalier D, et al. Mutations in multiple XXT genes of Arabidopsis reveal the complexity of xyloglucan biosynthesis［J］. Plant Physiology, 2012, 159（4）：1367-1384.

［30］ Rose JK, Braam J, Fry SC, et al. The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis：current perspectives and a new unifying nomenclature［J］. Plant and Cell Physiology, 2002, 43（12）：1421-1435.

［31］ Pauly M, Gille S, Liu L, et al. Hemicellulose biosynthesis［J］. Planta, 2013, 238（4）：627-642.

［32］ Chiniquy D, Sharma V, Schultink A, et al. XAX1 from glycosyltransferase family 61 mediates xylosyltransfer to rice xylan［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109（42）：17117-17122.

［33］ Anders N, Wilkinson MD, Lovegrove A, et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109（3）：989-993.

［34］ Caffall KH, Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides［J］. Carbohydrate Research, 2009, 344（14）：1879-1900.

［35］ Atmodjo MA, Sakuragi Y, Zhu X, et al. Galacturonosyltransferase（GAUT）1 and GAUT7 are the core of a plant cell wall pectin biosynthetic homogalacturonan：galacturonosyltransferase complex［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108（50）：20225-20230.

［36］ Kubicek CP, Herrera-Estrella A, Seidl-Seiboth V, et al. Comparative genome sequence analysis underscores mycoparasitism as the ancestral life style of Trichoderma［J］. Genome Biology, 2011, 12（4）：R40.

［37］ Martens-Uzunova ES, Schaap PJ. Assessment of the pectin degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional genomics［J］. Fungal Genetics and Biology, 2009, 46（1）：S170-S179.

［38］ Sweeney MD, Xu F. Biomass converting enzymes as industrial biocatalysts for fuels and chemicals：recent developments［J］. Catalysts, 2012, 2（4）：244-263.

［39］ 張小梅, 李單單, 王祿山, 等. 纖維素酶家族及其催化結(jié)構(gòu)域分子改造的新進(jìn)展［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29（4）：422-433.

［40］ van den Brink J, de Vries RP. Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91（6）：1477-1492.

［41］ Vlasenko E, Schülein M, Cherry J, et al. Substrate specificity of family 5, 6, 7, 9, 12, and 45 endoglucanases［J］. Bioresource Technology, 2010, 101（7）：2405-2411.

［42］ Zhang Q, Zhang X, Wang P, et al. Determination of the action modes of cellulases from hydrolytic profiles over a time course using fluorescence-assisted carbohydrate electrophoresis［J］. Electrophoresis, 2015, 36（6）：910-917.

［43］ Phillips CM, Beeson WT, Cate JH, et al. Cellobiose dehydrogenase and a copper-dependent polysaccharide monooxygenase potentiate cellulose degradation by Neurospora crassa［J］. ACS Chemical Biology, 2011, 6（12）：1399-1406.

［44］ Berka RM, Grigoriev IV, Otillar R, et al. Comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris［J］. Nature Biotechnology, 2011, 29（10）：922-927.

［45］ Wang M, Cai J, Huang L, et al. High-level expression and efficient purification of bioactive swollenin in Aspergillus oryzae［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 162（7）：2027-2036.

［46］ Foreman PK, Brown D, Dankmeyer L, et al. Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the filamentous fungus Trichoderma reesei［J］. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278（34）：31988-31997.

［47］ Eijsink VG, Vaaje-Kolstad G, V?rum KM, et al. Towards new enzymes for biofuels：lessons from chitinase research［J］. Trends in Biotechnology, 2008, 26（5）：228-235.

［48］ Polizeli M, Rizzatti A, Monti R, et al. Xylanases from fungi：properties and industrial applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67（5）：577-591.

［49］ Machida M, Asai K, Sano M, et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae［J］. Nature, 2005, 438（7071）：1157-1161.

［50］ Master E, Zheng Y, Storms R, et al. A xyloglucan-specific family 12 glycosyl hydrolase from Aspergillus niger：recombinant expression, purification and characterization［J］. Journal of Biochemistry, 2008, 411：161-170.

［51］ Do BC, Dang TT, Berrin JG, et al. Cloning, expression in Pichia pastoris, and characterization of a thermostable GH5 mannan endo-1,4-β-mannosidase from Aspergillus niger BK01［J］. Microbial Cell Factories, 2009, 8（1）：59-71.

［52］ Boyce A, Walsh G. Production, purification and applicationrelevant characterisation of an endo-1,3（4）-β-glucanase from Rhizomucor miehei［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76（4）：835-841.

［53］ McCarthy T, Hanniffy O, Savage AV, et al. Catalytic properties and mode of action of three endo-β-glucanases from Talaromyces emersonii on soluble β-1,4-and β-1,3；1,4-linked glucans［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 33（1）：141-148.

［54］ De Vries R, Van Grieken C, VanKuyk P, et al. The value of genome sequences in the rapid identification of novel genes encoding specific plant cell wall degrading enzymes［J］. Current Genomics, 2005, 6（3）：157-187.

［55］ Duffaud GD, McCutchen CM, Leduc P, et al. Purification and characterization of extremely thermostable beta-mannanase, betamannosidase, and alpha-galactosidase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga neapolitana 5068［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63（1）：169-177.

［56］ De Vries RP, Kester H, Poulsen CH, et al. Synergy between enzymes from Aspergillus involved in the degradation of plant cell wall polysaccharides［J］. Carbohydrate Research, 2000, 327（4）：401-410.

［57］ Kormelink FJ, Gruppen H, Vi?tor RJ, et al. Mode of action of the xylan-degrading enzymes from Aspergillus awamori on alkaliextractable cereal arabinoxylans［J］. Carbohydrate Research, 1993, 249（2）：355-367.

［58］ Mertens JA, Bowman MJ. Expression and characterization of fifteen Rhizopus oryzae 99-880 polygalacturonase enzymes in Pichia pastoris［J］. Current Microbiology, 2011, 62（4）：1173-1178.

［59］ Kenneth Keegstra NR. Plant glycosyltransferases［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4（3）：219-224.

［60］ Burton RA, Gidley MJ, Fincher GB. Heterogeneity in the chemistry, structure and function of plant cell walls［J］. Nature Chemical Biology, 2010, 6（10）：724-732.

Diverse Synthetases and Fungi Degradation Enzymes for the Polysaccharides of Plant Cell Walls

Gong Weili Wang Lushan Zhang Huaiqiang
（The State Key Laboratory of Microbial Technology，Shandong University，Ji’nan 250100）

Efficient degradation and conversion of the polysaccharides in the plant cell wall of straw is of great significance for green and sustainable development of agriculture economy in China. But the enzymatic hydrolysis process of the polysaccharides was restricted by the complex structures of plant cell wallsformed in the long-term evolution process. In this paper, the diversity of plant cell wall polysaccharides synthetases, the complexity of cell wall polysaccharides, and the heterogeneity of supramolecular structures are reviewed from the perspective of the reasons causing plant cell wall recalcitrance；in addition, the variety of plant cell wall degradation enzymes of fungi, and the discrepancy among different strains in degrading different biomass were also summarized, which provide theoretical support for reasonable recompounding of fungi degradation enzymes in industrial to improve the utilization efficiency of straw biomass.

plant cell wall；recalcitrance；polysaccharides synthetases；fungi degradation enzymes；green and sustainable development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.014

2015-03-06

國(guó)家“ 973”計(jì)劃（2011CB707401），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370111，31170071），山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013CM038）

公維麗，女，博士，研究方向：微生物生理生化；E-mail：15264110812@163.com

張懷強(qiáng)，男，博士，研究方向：微生物生理生化；zhq@sdu.edu.cn