我國(guó)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展

許鍇 陳霞 高紹榮

（同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092）

我國(guó)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展

許鍇 陳霞 高紹榮

（同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092）

關(guān)于細(xì)胞重編程問(wèn)題的探討可以追溯至20世紀(jì)30年代。從漢斯·斯佩曼提出“胚胎誘導(dǎo)”概念開(kāi)始，到20世紀(jì)60年代，約翰·戈登成功獲得了經(jīng)過(guò)體細(xì)胞核移植發(fā)育而來(lái)的爪蟾，再到1996年世界首例克隆哺乳動(dòng)物克隆羊“多莉”的誕生，生物學(xué)家終于證實(shí)了高等動(dòng)物的體細(xì)胞核能夠通過(guò)核移植的方式重新建立多能性，但這一方法面臨著很多社會(huì)倫理學(xué)問(wèn)題，無(wú)法應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐。直到2006年Yamanaka小組誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS 細(xì)胞），成功地繞過(guò)了這些倫理問(wèn)題，誘導(dǎo)重編程才成為了當(dāng)今干細(xì)胞生物學(xué)最為熱門的研究方向。在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞領(lǐng)域，我國(guó)一直位居世界前列，近年來(lái)更是在iPS技術(shù)的優(yōu)化、機(jī)制研究和應(yīng)用研究等方面作出了令世界矚目的貢獻(xiàn)，就這幾方面做一綜述。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；體細(xì)胞重編程；表觀遺傳學(xué)；機(jī)制；重編程臨床應(yīng)用

從2006年Yamanaka課題組利用導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子成功地將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能性細(xì)胞［1］開(kāi)始，我國(guó)的體細(xì)胞重編程領(lǐng)域就一直緊跟國(guó)際一流水平，取得了很多富有價(jià)值的研究成果。自2008年以來(lái)，我國(guó)科學(xué)家建立了多種哺乳動(dòng)物iPS細(xì)胞系。例如，鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室建立了恒河猴的iPS細(xì)胞系［2］，肖磊實(shí)驗(yàn)室建立了大鼠和綿羊的iPS細(xì)胞系［3］，肖磊與裴端卿實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道建立了豬的iPS細(xì)胞系［4，5］等。在人類體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程方面同樣取得了一系列重大成果。例如，金穎實(shí)驗(yàn)室以人成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，在無(wú)LIF條件下建立了神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞［6］；我們實(shí)驗(yàn)室建立了β-地中海貧血患者的iPS細(xì)胞系［7］等。在驗(yàn)證iPS細(xì)胞全能性方面，我們實(shí)驗(yàn)室［8］與中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員［9］同時(shí)報(bào)道利用四倍體囊胚互補(bǔ)技術(shù)得到了完全由iPS細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的小鼠，首次證明了iPS細(xì)胞具有真正的全能性；該研究成果被評(píng)選為《時(shí)代周刊》2009年十大醫(yī)學(xué)突破之一。在iPS細(xì)胞分化為成體細(xì)胞的研究領(lǐng)域中，鄧宏魁課題組將人的iPS細(xì)胞成功誘導(dǎo)為胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞［10，11］。這些工作為我國(guó)的iPS領(lǐng)域的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，目前的研究主要集中在iPS誘導(dǎo)體系的優(yōu)化、iPS機(jī)制研究和iPS技術(shù)的臨床應(yīng)用研究三方面，本文將著重從這幾個(gè)角度介紹近幾年我國(guó)在iPS領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)體系及方法優(yōu)化

在iPS技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生效率和產(chǎn)生的細(xì)胞克隆質(zhì)量曾一度是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。要解決iPS技術(shù)的應(yīng)用難題就要能夠高效率地獲得高質(zhì)量的iPS細(xì)胞克隆。這種高質(zhì)量主要體現(xiàn)在分化為各種成體組織與器官的多能性，以及無(wú)致癌性和無(wú)衰老傾向的安全性方面。

1.1 Yamanaka四因子的經(jīng)典iPS細(xì)胞誘導(dǎo)體系

在iPS技術(shù)出現(xiàn)初期，Yamanaka誘導(dǎo)因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc（OSKM）是誘導(dǎo)重編程領(lǐng)域的明星因子。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)OSKM四因子誘導(dǎo)出的iPS克隆分化能力有限，在裸鼠體內(nèi)形成畸胎瘤的能力較差，且只有極少數(shù)的iPS細(xì)胞克隆能夠通過(guò)四倍體囊胚互補(bǔ)試驗(yàn)得到完全由iPS細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的小鼠（又稱all-iPS小鼠）。值得注意的是得到的all-iPS小鼠及其子代小鼠更容易罹患腫瘤?，F(xiàn)在認(rèn)為，造成這一問(wèn)題的主要原因在于導(dǎo)入的兩個(gè)原癌基因c-Myc和Klf4在重編程完成后仍有少量表達(dá)［8，9，12］。針對(duì)這一問(wèn)題，生物學(xué)家主要應(yīng)用兩種策略對(duì)這種傳統(tǒng)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法進(jìn)行優(yōu)化，一種策略是將c-Myc基因從誘導(dǎo)體系中去掉，僅利用OSK三因子進(jìn)行iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)；另一種策略則是放棄病毒載體，應(yīng)用非整合型載體等方法進(jìn)行iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。這兩種方案雖然在一定程度上提高了應(yīng)用Yamanaka因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的安全性，但是仍然未能解決這種因子組合產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的多能性較差的問(wèn)題。因此，很多課題組將注意力放在如何優(yōu)化iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)體系或方法上來(lái)。其中具有代表性的方法是用不同的轉(zhuǎn)錄因子部分或全部替代Yamanaka的四因子誘導(dǎo)體系；另一種方法則是運(yùn)用小分子化合物減少轉(zhuǎn)錄因子的使用，從而避免外源轉(zhuǎn)錄因子錯(cuò)位的時(shí)空性表達(dá)對(duì)iPS細(xì)胞質(zhì)量的影響。

1.2 替代OSKM四因子的研究進(jìn)展

從理論上講，轉(zhuǎn)入體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子能夠激活一些特定基因的表達(dá)，并通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控最終建立細(xì)胞的多能性狀態(tài)，而這些轉(zhuǎn)入的外源因子會(huì)逐漸沉默，這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子在體細(xì)胞重編程過(guò)程中的作用實(shí)際上是通過(guò)啟動(dòng)特定基因群實(shí)現(xiàn)的。鑒于此，人們開(kāi)始考慮是否能夠通過(guò)替換OSKM四因子中的一個(gè)或多個(gè)得到更多更好的iPS細(xì)胞。

一開(kāi)始，生物學(xué)家將注意力主要放在如何替換原癌基因Klf4上，研究發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白家族（Bone morphogenetic proteins，BMPs）能夠替代Klf4［13］，其作用機(jī)制主要是促進(jìn)體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程過(guò)程中體細(xì)胞從間充質(zhì)樣狀態(tài)到上皮樣狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，而這種轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程起始的標(biāo)志性事件。

隨著替代研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Oct4在誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程過(guò)程中起到中心的作用，雖然Nr5a2能夠替代Oct4而與其他Yamanaka因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，但是Nr5a2的作用仍然是作為Oct4的上游調(diào)控因子啟動(dòng)Oct4的表達(dá)［14］。然而，有趣的是Oct4缺失的卵子能夠?qū)⒊衫w維細(xì)胞重編程為多能性細(xì)胞［15］，這表明Oct4在體細(xì)胞重編程過(guò)程中并不是必須的，因此推測(cè)應(yīng)當(dāng)存在不依賴于Oct4的重編程因子組合。隨后，這些因子組合逐漸被發(fā)現(xiàn)。例如，本實(shí)驗(yàn)室建立的Tet1替代Oct4的體細(xì)胞重編程體系能較高效地對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行重編程［16］，并且獲得的iPS克隆能夠高效地形成四倍體囊胚互補(bǔ)小鼠，這表明這種因子組合大大提高了iPS細(xì)胞的多能性。這種iPS細(xì)胞質(zhì)量的提升主要依賴于Tet1這種雙加氧酶，它能夠把5-甲基化胞嘧啶氧化為5-羥甲基化胞嘧啶，從而使起始體細(xì)胞重編程過(guò)程中的DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程，建立起多能性細(xì)胞所特有的基因組低甲基化的特征。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，僅利用Oct4和Tet兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也能夠使體細(xì)胞發(fā)生重編程，并且這種組合產(chǎn)生的iPS細(xì)胞具有非常高的四倍體囊胚互補(bǔ)小鼠的產(chǎn)生效率［17］，隨后對(duì)小鼠的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)這種完全由Oct4/Tet1 iPS細(xì)胞形成的小鼠腫瘤發(fā)生率極低，且壽命與對(duì)照組小鼠無(wú)明顯差異。這表明這種iPS細(xì)胞的多能性以及安全性較經(jīng)典Yamanaka因子都有明顯的提高，同時(shí)也印證了DNA的去甲基化與iPS細(xì)胞的質(zhì)量具有很高的相關(guān)性。

1.3 降低iPS技術(shù)基因整合風(fēng)險(xiǎn)的研究

對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子隨機(jī)整合的不安全性，科學(xué)家提出了多種解決方案。2008年，Konrad Hochedlinger小組利用非整合性的腺病毒載體導(dǎo)入經(jīng)典的Yamanaka因子，成功得到了iPS細(xì)胞［18］。同年，Yamanaka小組也通過(guò)多次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法得到了iPS細(xì)胞［19］。2009年，兩個(gè)團(tuán)隊(duì)同時(shí)報(bào)道使用piggyBAC轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能夠成功對(duì)小鼠和人類的成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程［20，21］。同年，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了直接向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入重編程蛋白質(zhì)因子使其獲得多能性的工作，其中丁勝課題組在添加丙戊酸的條件下將融合了穿膜信號(hào)肽11R的OSKM四因子或OSK三因子導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞使其成功重編程［22］；而Kim課題組使用的是帶有穿膜信號(hào)肽9R的OSKM四因子，成功地將新生兒的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能細(xì)胞［23］。2010年，Yakubov等［24］成功將Oct4、Sox2、Lin28和Naong成熟mRNA導(dǎo)入人類的成纖維細(xì)胞，得到了iPS細(xì)胞。2011年，Mori小組運(yùn)用成熟雙鏈microRNA成功將小鼠和人類的體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞［25］。2014年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的吳森教授與美國(guó)猶他大學(xué)的科研人員合作首次獲得了高質(zhì)量的無(wú)外源基因整合的小鼠iPS細(xì)胞，吳教授［26］通 過(guò) 將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Nr5a2、microRNA302/367和正負(fù)篩選標(biāo)記基因構(gòu)建到一個(gè)非整合型質(zhì)粒上，在獲得iPS細(xì)胞后通過(guò)負(fù)篩選標(biāo)記去除殘留有該質(zhì)粒的細(xì)胞以達(dá)到確保無(wú)外源基因插入。雖然這些方法能夠在極大限度上降低外源基因隨機(jī)整合的幾率，但這些方法或多或少都會(huì)存在一些問(wèn)題。例如，運(yùn)用腺病毒載體或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)并不能確保完全沒(méi)有外源基因的整合；轉(zhuǎn)錄因子蛋白直接誘導(dǎo)的方法往往存在效率極低、需要不斷補(bǔ)充外源蛋白因子等問(wèn)題。

1.4 體細(xì)胞核移植技術(shù)對(duì)iPS技術(shù)的啟示

自iPS誕生以來(lái)，iPS技術(shù)與體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)的孰優(yōu)孰劣的問(wèn)題就一直縈繞在科學(xué)家的頭腦中，根據(jù)以往的研究來(lái)看，應(yīng)用減數(shù)分裂中期次級(jí)卵母細(xì)胞（metaphase II，MII）作為體細(xì)胞核受體的SCNT技術(shù)產(chǎn)生的多能性細(xì)胞可能比通過(guò)iPS技術(shù)得到的多能性細(xì)胞具有更好的性質(zhì)。最近，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表在《Cell Stem Cell》雜志上的文章報(bào)道了核移植技術(shù)在增長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度方面比iPS技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)［27］。我們通過(guò)建立端粒酶敲除小鼠的核移植胚胎干細(xì)胞系（NTESC）和iPS細(xì)胞系來(lái)模擬建立人類衰老病人的多能性細(xì)胞系。對(duì)兩種多能性細(xì)胞系的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)NT-ESC的端粒長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，而iPS細(xì)胞系的端粒長(zhǎng)度增長(zhǎng)不明顯，這就提示了利用傳統(tǒng)iPS技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能性細(xì)胞可能存在端粒長(zhǎng)度過(guò)短的風(fēng)險(xiǎn)。而人類的端粒長(zhǎng)度要明顯短于小鼠的，因而端粒長(zhǎng)度過(guò)短對(duì)人類的影響可能更加嚴(yán)重。這些問(wèn)題的存在促使生物學(xué)家尋找卵母細(xì)胞中存在的更優(yōu)質(zhì)的iPS因子［28-32］，例如，今年發(fā)表在《Science》雜志的一篇文章就指出，在人類MII細(xì)胞中特異性高表達(dá)的組蛋白伴侶蛋白ASF1A對(duì)人類iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)是必要的；而且通過(guò)向人類皮膚成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入ASF1A和OCT4能夠在添加卵細(xì)胞特異性旁分泌因子GDF9的培養(yǎng)條件下得到iPS細(xì)胞［33］。這一研究提醒人們，除了在胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)的因子能夠?qū)w細(xì)胞進(jìn)行重編程外，未受精的MII細(xì)胞中高表達(dá)的因子也能應(yīng)用于iPS技術(shù)，并可能取得更加優(yōu)化的iPS細(xì)胞系。實(shí)際上，我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)這一問(wèn)題也開(kāi)展了進(jìn)一步的研究，我們通過(guò)對(duì)受精卵進(jìn)行3次顯微操作對(duì)比了受精卵的雌雄原核的重編程能力［34］。首先，將處于間期的受精卵去掉雄原核或雌原核，將單倍體的受精卵繼續(xù)培養(yǎng)，阻滯在有絲分裂的中期并去除紡錘體及染色體，再把供體細(xì)胞的核物質(zhì)注入到去核的受精卵中繼續(xù)培養(yǎng)或移植到代孕母鼠體內(nèi)。研究結(jié)果表明，去除雌原核的單倍體小鼠受精卵可以獲得由胚胎干細(xì)胞作為核供體的克隆小鼠，并且支持體細(xì)胞核移植克隆胚胎發(fā)育至囊胚，并建立具有多能性的核移植胚胎干細(xì)胞系；而去除雄原核的受精卵則無(wú)法支持體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育到囊胚。對(duì)這兩種克隆胚胎的表觀遺傳標(biāo)記檢測(cè)表明，雌雄原核表現(xiàn)出對(duì)體細(xì)胞的不同表觀遺傳重編程能力，去除雄原核的受精卵不能正確重編程體細(xì)胞。而通過(guò)在受精卵中融合入一個(gè)額外的雄原核顯著提高了核移植的效率，這進(jìn)一步證明了雄原核中確實(shí)存在對(duì)體細(xì)胞重編程至關(guān)重要的效應(yīng)因子，并且提示我們可以從雄原核中尋找促進(jìn)體細(xì)胞重編程的因子。

1.5 化學(xué)小分子iPS細(xì)胞的建立

基于轉(zhuǎn)錄因子的iPS技術(shù)主要存在兩個(gè)關(guān)鍵的安全性問(wèn)題，其一為隨機(jī)整合的外源DNA片段會(huì)影響基因組的自有結(jié)構(gòu)，并可能影響相關(guān)基因的表達(dá)情況，而且這種影響具有可遺傳性和永久性，這一問(wèn)題僅針對(duì)病毒載體而言；其二為不正常的基因表達(dá)水平和不同細(xì)胞間的基因表達(dá)差異可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)上的紊亂及增加細(xì)胞之間的異質(zhì)性。而小分子化合物組合誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，因其無(wú)需轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)而成功避開(kāi)了iPS技術(shù)安全性的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，并因此得到了全世界的矚目。

在獲得并培養(yǎng)小鼠或人類的胚胎干細(xì)胞的嘗試中，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)添加一些小分子化合物能夠提高胚胎干細(xì)胞的建系效率，并提升其生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些小分子物質(zhì)主要參與了調(diào)控胚胎干細(xì)胞的多能性的細(xì)胞信號(hào)通路。因此，相同的思路可以用來(lái)提高iPS細(xì)胞產(chǎn)生效率和質(zhì)量甚至優(yōu)化iPS技術(shù)。例如，對(duì)胚胎干細(xì)胞的多能性維持具有重要作用的Gsk3β的抑制劑CHIR-99021和MEK抑制劑PD-0325901能夠提高重編程效率［35］。另一種尋找有利于重編程的化學(xué)小分子的路徑，是對(duì)多能性相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行研究并篩選，這類小分子物質(zhì)包括上述兩種激酶抑制劑、TGFβ抑制劑［36，37］、GSK3、周期蛋白激酶抑制劑Kenpaullone［38］和mTOR細(xì)胞信號(hào)通路的抑制劑雷帕霉素［39］等。因?yàn)楸碛^遺傳學(xué)在重編程過(guò)程中的重要作用，生物學(xué)家同樣篩選到了一系列與表觀遺傳學(xué)修飾相關(guān)的化學(xué)小分子，如組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）的抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）和著名抗癌藥物——辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoyla nilide hydroxamic acid，SAHA）［40，41］、組蛋白去甲基化酶LSD1的激活劑反苯環(huán)丙胺［42］等。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上北京大學(xué)鄧宏魁教授成功建立了只添加6種小分子化合物的誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程體系，這一發(fā)現(xiàn)也被認(rèn)為是重編程領(lǐng)域發(fā)展的里程碑事件［43］。鄧教授首先得到了只轉(zhuǎn)入Oct4，同時(shí)添加丙戊酸、GSK3-β信號(hào)通路的抑制劑、TGF-β信號(hào)通路的抑制劑和H3K4 的去甲基化抑制劑強(qiáng)內(nèi)心百樂(lè)明（tranylcypromine）4種小分子誘導(dǎo)出的iPS細(xì)胞［44］。同年，另一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了相似的研究成果［45］。接下來(lái)鄧教授利用轉(zhuǎn)入SKM三因子的小鼠成纖維細(xì)胞篩選能夠替代Oct4的小分子化合物，經(jīng)過(guò)對(duì)上萬(wàn)種小分子進(jìn)行篩選，最終確定弗斯可林（forskolin，F(xiàn)SK）、2-甲基-5-羥色胺（2-Me-5HT）和D4476s能作為Oct4的替代化合物。綜合兩個(gè)工作的成果，鄧教授經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)得到6種小分子，分別為丙戊酸、Repsox、強(qiáng)內(nèi)心百樂(lè)明、佛司可林、DZNep和CHIR-99021。進(jìn)一步的研究表明，僅用其中的4種小分子CHIR-99021、FSK、616452（即Repsox）和DZNep就能完成體細(xì)胞重編程。其中CHIR、FSK和Repsox能夠激活Sall4、Sox2的表達(dá)，而DZNep能激活Oct4的表達(dá)，從而使體細(xì)胞發(fā)生重編程（圖1）。但是目前這種誘導(dǎo)體系仍然存在著誘導(dǎo)效率低（0.05%）、誘導(dǎo)周期長(zhǎng)（6周以上）和誘導(dǎo)出的細(xì)胞多能性較差（雖然這種重編程細(xì)胞能夠形成畸胎瘤和嵌合體小鼠，但是至今沒(méi)有報(bào)道其能夠通過(guò)最為嚴(yán)格的四倍體囊胚互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證其多能性）等問(wèn)題，因而對(duì)化學(xué)小分子iPS技術(shù)的研究還將繼續(xù)下去，相信在不久的將來(lái)一定能夠獲得具有應(yīng)用價(jià)值的小分子iPS細(xì)胞。

圖1 小分子化合物重編程機(jī)制示意圖［43］

2 iPS細(xì)胞的機(jī)制研究

若使得iPS技術(shù)能夠應(yīng)用就必須對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究，之前對(duì)iPS技術(shù)機(jī)制的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)組水平，而現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)水平的研究無(wú)疑是最中心的問(wèn)題，因?yàn)闊o(wú)論轉(zhuǎn)錄組還是蛋白組的改變最終都要?dú)w因于表觀遺傳學(xué)性質(zhì)的改變。本文將主要從我國(guó)科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)的影響重編程過(guò)程中表觀遺傳特征入手對(duì)誘導(dǎo)重編程的機(jī)制進(jìn)行闡述。

2.1 表觀遺傳重編程概述

根據(jù)目前的研究，表觀遺傳修飾主要包括染色體上的DNA的甲基化和羥甲基化修飾、組蛋白變體、組蛋白修飾、核小體重構(gòu)和染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，以及非編碼RNA（又分為microRNA和lncRNA）和RNA的甲基化［46-48］。這些表觀遺傳特征都與iPS技術(shù)息息相關(guān)，細(xì)胞重編程最終反映為體細(xì)胞表觀遺傳學(xué)性質(zhì)改變?yōu)槎嗄苄约?xì)胞的狀態(tài)，即無(wú)論體細(xì)胞在外源的轉(zhuǎn)錄因子、蛋白因子還是化學(xué)小分子刺激下如何轉(zhuǎn)變形態(tài)和性質(zhì)，只要其本身的表觀遺傳特征未變或變化不到位都會(huì)導(dǎo)致這種“多能性細(xì)胞”在外源刺激被撤掉或抑制后迅速喪失多能性；并且外源重編程因子的異常刺激可能會(huì)使細(xì)胞形成錯(cuò)誤的表觀遺傳特征，從而導(dǎo)致細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)換甚至死亡。因此表觀遺傳特征的重編程才是iPS技術(shù)的核心和內(nèi)在機(jī)制。在這一領(lǐng)域，我國(guó)科學(xué)家也同樣作出了突出的貢獻(xiàn)。

2.2 染色質(zhì)重構(gòu)

染色質(zhì)重構(gòu)蛋白是重編程因子起作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，有研究表明重要的胚胎干細(xì)胞特異性染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體BAF中的兩個(gè)組分Smarca4（Brg1）和Smarcc1（BAF155）能夠協(xié)同OSK三因子對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程［49］。這些染色質(zhì)重構(gòu)蛋白一方面增強(qiáng)了Oct4蛋白結(jié)合Sall4、Tcf3和Dppa4基因啟動(dòng)子區(qū)的能力；另一方面增加了Oct4結(jié)合區(qū)域組蛋白H3上4號(hào)賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾（H3K4me3）和組蛋白H3上9號(hào)賴氨酸發(fā)生乙酰化修飾（H3K9ac），而這兩種組蛋白修飾能夠使基因組上該區(qū)域呈現(xiàn)開(kāi)放的狀態(tài)，從而有利于Oct4因子對(duì)其下游基因的調(diào)控［50］。2013年6月，《Cell Stem Cell》雜志上發(fā)表了吉林大學(xué)第一醫(yī)院胡繼繁、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院范先群等研究團(tuán)隊(duì)［51］的研究成果：黏結(jié)蛋白復(fù)合物基因SMC1所支配的染色質(zhì)內(nèi)袢環(huán)（intrachromosomal looping）是細(xì)胞重編程過(guò)程中激活內(nèi)源性多能基因的必要條件，從而揭示了體細(xì)胞重編程誘導(dǎo)多能性一個(gè)新的關(guān)鍵性的表觀遺傳路障。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞與未重編程細(xì)胞中病毒載體表達(dá)的誘導(dǎo)因子結(jié)合靶基因啟動(dòng)子程度一樣，但僅在iPS細(xì)胞中觀察到內(nèi)源性多能基因的表達(dá)。通過(guò)比較Oct4基因位點(diǎn)的局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)有一個(gè)黏結(jié)蛋白復(fù)合物（cohesin complex）介導(dǎo)的染色質(zhì)內(nèi)袢環(huán)存在于一個(gè)下游增強(qiáng)子與基因啟動(dòng)子之間，促使激活了內(nèi)源干性基因。而在未重編程細(xì)胞中則沒(méi)有觀察到這樣的遠(yuǎn)程相互作用。當(dāng)研究人員利用RNAi抑制黏結(jié)蛋白復(fù)合物基因SMC1時(shí)發(fā)現(xiàn)，其可破壞染色質(zhì)內(nèi)相互作用，影響多能性。2014年，王利博士及其同事發(fā)現(xiàn)重要的重編程因子，如Oct4能夠招募染色質(zhì)重構(gòu)ATP酶INO80，而INO80能夠進(jìn)一步穩(wěn)定核小體缺乏區(qū)（nucleosomedepleted regions，NDRs）并招募中介因子（Mediator）和RNA聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）啟動(dòng)基因的表達(dá)。這一工作解釋了一些重編程的主宰轉(zhuǎn)錄因子（master transcription factor）能夠選擇性地抑制分化基因而啟動(dòng)多能性基因的現(xiàn)象［52］。

2.3 DNA主動(dòng)去甲基化

在對(duì)表觀重編程的研究中，我國(guó)科學(xué)家貢獻(xiàn)最大的領(lǐng)域當(dāng)屬DNA主動(dòng)去甲基化領(lǐng)域。相比于組蛋白修飾重建，多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子去甲基化發(fā)生于重編程的末期［53］，而這種低甲基化狀態(tài)對(duì)iPS細(xì)胞的多能性又具有決定性的作用［54］，因此，DNA去甲基化可能是體細(xì)胞重編程過(guò)程中的一個(gè)障礙，只有跨越這一障礙，細(xì)胞才能夠獲得多能性。目前的研究認(rèn)為在重編程過(guò)程中主要存在兩種DNA去甲基化機(jī)制，一類是依賴于DNA復(fù)制的被動(dòng)去甲基化，這種去甲基化過(guò)程相對(duì)緩慢；另一種DNA去甲基化機(jī)制是依賴于激活誘導(dǎo)型胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）［55］或Tet蛋白家族（ten-eleven translocation family）的主動(dòng)去甲基化。主動(dòng)去甲基化機(jī)制能夠快速并特異性地進(jìn)行DNA的去甲基化，因而也更為重要。我們實(shí)驗(yàn)室的研究表明，Tet1可以催化Oct4 R-DMRs區(qū)域的5hmC的產(chǎn)生，促進(jìn)該區(qū)域的DNA去甲基化，進(jìn)而促進(jìn)重編程中Oct4的轉(zhuǎn)錄激活。進(jìn)一步利用Tet1取代Oct4用以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程。在證明TSKM-iPS細(xì)胞完全多能性的同時(shí)，建立了TSKM的二次重編程系統(tǒng)。在這一誘導(dǎo)體系中發(fā)現(xiàn)TSKM誘導(dǎo)的重編程可以被明顯的分為兩個(gè)階段。第一個(gè)階段是從TSKM誘導(dǎo)第0天（TSKM 0D）到第3天（TSKM 3D）。這一階段最重要的變化在于體細(xì)胞特異表觀修飾的解構(gòu)。在這一階段，Tet家族蛋白催化5mC氧化而產(chǎn)生5hmC，并隨后引發(fā)基因組上5mC與5hmC的共同上升。在誘導(dǎo)中間階段基因表達(dá)與5mC和5hmC修飾狀態(tài)的關(guān)系表明，基因組上DNA的甲基化和羥甲基化的修飾改變可能參與推動(dòng)了整體表達(dá)譜的扭轉(zhuǎn)。而誘導(dǎo)的第二個(gè)階段，即TSKM 3D到iPS細(xì)胞建立，細(xì)胞內(nèi)最重要的變化在于ES樣表觀修飾的建立。而在這一階段，基因組上已經(jīng)升高的5mC需要被去除，而5hmC有的繼續(xù)上升，有的則會(huì)回落，最終形成類似于ES細(xì)胞的修飾模式（圖2）。

圖2 Tet1參與的細(xì)胞重編程過(guò)程與機(jī)制［16］

基因組水平的綜合分析表明，DNA的甲基化與羥甲基化參與了基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)和整個(gè)表達(dá)譜的改變。5mC的氧化不僅參與了重編程中的多能性基因激活，更可能在ES細(xì)胞中的活性調(diào)節(jié)區(qū)域去甲基化與表觀修飾重塑中具有重要作用。隨后徐國(guó)良課題組［56］得到了Tet蛋白家族的Tet1、Tet2和Tet3及Tdg基因敲除的小鼠成纖維細(xì)胞，并試圖對(duì)其進(jìn)行重編程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種喪失了主動(dòng)去甲基化能力的細(xì)胞無(wú)法啟動(dòng)MET過(guò)程，因而造成了細(xì)胞重編程的失敗。進(jìn)一步的研究表明，Tet或TDG的缺失主要影響了microRNA-200基因家族啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化而導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入MET過(guò)程。

2.4 組蛋白變體研究

華人科學(xué)家Xiao等［57］發(fā)現(xiàn)組蛋白變體H2A.X的分布與iPS細(xì)胞的多能性關(guān)系密切，分化能力出眾的iPS細(xì)胞中H2A.X在染色質(zhì)上呈現(xiàn)出相對(duì)集中且規(guī)則的分布，而在多能性較差的iPS細(xì)胞中則呈現(xiàn)散亂無(wú)規(guī)則的分布特點(diǎn)。這項(xiàng)研究也為評(píng)價(jià)iPS細(xì)胞的質(zhì)量提供了一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 H3K9me3的研究

裴端卿課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)H3K9的甲基化是小鼠體細(xì)胞重編程的主要障礙之一，裴教授課題組在進(jìn)行重編程實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一類外形、增殖等方面酷似多能性細(xì)胞但卻沒(méi)有相應(yīng)的基因表達(dá)譜改變和干細(xì)胞表觀遺傳特性建立的細(xì)胞，這類細(xì)胞被稱為前iPS（pre-iPSC）細(xì)胞。通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，H3K9甲基化的存留是產(chǎn)生這種重編程不完全細(xì)胞的原因。通過(guò)激活維生素C依賴的H3K9去甲基化酶能夠?qū)⑦@些pre-iPS細(xì)胞幾乎全部轉(zhuǎn)化為真正的iPS細(xì)胞［58］。

在iPS技術(shù)高速發(fā)展的當(dāng)下，只有不斷加深對(duì)其內(nèi)在機(jī)制的認(rèn)識(shí)才能更好地指導(dǎo)人們不斷優(yōu)化iPS的誘導(dǎo)體系，相信在不久的將來(lái)，人們終將得到符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方式并盡快服務(wù)于臨床診斷和治療。

3 展望

在iPS技術(shù)蓬勃發(fā)展的今天，再生醫(yī)學(xué)的大門漸漸開(kāi)啟，尤其是2014年，科學(xué)界在iPS技術(shù)應(yīng)用的研究領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。日本理化所（RIKEN）發(fā)育生物學(xué)中心的眼科學(xué)家高橋雅代（Masayo Takahashi）為一位罹患退行性眼病的日本患者實(shí)施了世界首例基于iPS技術(shù)的細(xì)胞移植手術(shù)。他們利用一名70多歲的老年黃斑變性女患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生了iPS細(xì)胞，并將其定向分化得到了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，然后用外科手術(shù)的方式將其移植到該患者的受損視網(wǎng)膜區(qū)域，從而達(dá)到治療的目的。另外，來(lái)自波士頓兒童醫(yī)院的研究人員將8種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠成熟血細(xì)胞并獲得了性質(zhì)類似造血干細(xì)胞的細(xì)胞群，研究人員將這些細(xì)胞命名為誘導(dǎo)造血干細(xì)胞（Induced hematopoietic stem cells，iHSCs），這種細(xì)胞能夠分化成血液系統(tǒng)的所有細(xì)胞類型［59］。這無(wú)疑為治療白血病等惡性血液疾病提出了新的思路。另一項(xiàng)振奮人心的消息來(lái)自愛(ài)丁堡大學(xué)，科學(xué)家們將體外培養(yǎng)的細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)成功得到了具有完全功能的胸腺，胸腺是T細(xì)胞的成熟場(chǎng)所，對(duì)獲得性免疫具有非常重要的作用，研究人員也希望運(yùn)用這種技術(shù)造福于那些嚴(yán)重免疫缺陷的患者。這一成果標(biāo)志著體外培養(yǎng)替代性器官的重大突破。最近，我國(guó)科學(xué)家也在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了重要突破，2014年2月《Cell Stem Cell》雜志發(fā)表了我國(guó)兩個(gè)課題組在建立高效制備功能成熟人類肝臟細(xì)胞方法上的突破性進(jìn)展。鄧宏魁課題組［60］通過(guò)將肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的命運(yùn)決定因子與功能性成熟相關(guān)的因子轉(zhuǎn)入人類的成纖維細(xì)胞，獲得了人類誘導(dǎo)性肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞（hiHepCs），這種細(xì)胞能夠在發(fā)生嚴(yán)重肝損傷的小鼠體內(nèi)高效重建肝功能，并能夠通過(guò)藥物代謝測(cè)試。而中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的惠利健課題組［61］則通過(guò)在人類的成纖維細(xì)胞中高表達(dá)3個(gè)特異的肝臟轉(zhuǎn)錄因子，同樣獲得了可增殖的、功能成熟的hiHepCs。這兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的成果將極大地促進(jìn)針對(duì)肝臟疾病患者的肝細(xì)胞替代治療。這些振奮人心的成果一經(jīng)發(fā)表立即引起了全世界生命科學(xué)工作者的關(guān)注，但是應(yīng)該指出的是對(duì)iPS技術(shù)的安全性和療效的擔(dān)憂仍然存在，iPS要真正走上應(yīng)用的道路還有很多工作要做。

最近出現(xiàn)的CRISPR/Cas9基因組修飾系統(tǒng)［62］因其高效性被認(rèn)為可以用于進(jìn)行基因治療，尤其對(duì)于那些由基因突變?cè)斐傻膰?yán)重血液系統(tǒng)疾病，如β地中海貧血癥、鐮刀型細(xì)胞貧血癥等?？梢越Y(jié)合iPS技術(shù)建立患者的iPS細(xì)胞系或造血干細(xì)胞系，再運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)修復(fù)其基因組序列，從而得到具有治療價(jià)值的造細(xì)胞系，再將這種細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)得到的相應(yīng)組織或器官移植到患者體內(nèi)從而達(dá)到治療遺傳病的目的。相信iPS技術(shù)能夠通過(guò)不斷結(jié)合新的技術(shù)得到長(zhǎng)足的發(fā)展并最終造福于人類。

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The Progress of Induced Pluripotent Stem Cells Research in China

Xu Kai Chen Xia Gao Shaorong
（School of Life Sciences and Technology，Tongji University，Shanghai 200092）

The research on somatic cell reprogramming can trace back to 1930s when Hans Spemann firstly proposed the concept of embryos induction. 30 years later, John Gurdon successfully obtained cloned Xenopus laevis through somatic cell nuclear transfer（SCNT）. Finally in 1996, the first cloned sheep Dolly was created through SCNT. This achievement clearly demonstrated that the mammalian somatic cell fates can be reprogrammed to totipotent state by SCNT. However, SCNT technology faced with both ethics issues and therapeutic application challenges. It is until the year of 2006 when Yamanaka group built up the iPS（induced pluripotent stem cells, iPS cells）technology which can bypass the ethical problems. Subsequently, the iPS technology has become the most popular research topic in stem cell field. In this particular research field, the scientists in China has made great contributions especially in the optimization iPS technology, mechanism studies and the application of iPS technology in translational medical research. In this review, the major progresses made by our countries’ scientists in iPS field are summarized.

induced pluripotent stem cell；reprogramming；epigenetics reprogramming；mechanism；clinical application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.006

2015-01-03

許鍇，男，碩士研究生，研究方向：干細(xì)胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：xukai_0925@163.com

陳霞，女，碩士研究生，研究方向：干細(xì)胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：chenxia_925@163.com

高紹榮，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：gaoshaorong@#edu.cn