基于DNA自組裝過(guò)程的納米結(jié)構(gòu)研究

俞洋李江張釗樊春海

（1.上?？萍脊芾砀刹繉W(xué)院電子信息系，上海 201800；2.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 201800；3. 丹麥奧胡斯大學(xué)化學(xué)系，奧胡斯 8000）

基于DNA自組裝過(guò)程的納米結(jié)構(gòu)研究

俞洋1李江2張釗3樊春海2

（1.上海科技管理干部學(xué)院電子信息系，上海 201800；2.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 201800；3. 丹麥奧胡斯大學(xué)化學(xué)系，奧胡斯 8000）

基于DNA自組裝的納米結(jié)構(gòu)在近年來(lái)取得了巨大的發(fā)展?；仡櫫薉NA納米結(jié)構(gòu)的原理和發(fā)展歷程，介紹了DNA納米結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)在生物檢測(cè)、納米反應(yīng)器、可控排布、納米機(jī)器人和藥物遞送領(lǐng)域的新進(jìn)展和應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對(duì)DNA納米技術(shù)的未來(lái)進(jìn)行了展望。

DNA折紙；納米機(jī)器；納米藥物

DNA作為遺傳物質(zhì)是生命體得以延續(xù)與傳承的重要組成部分，有趣的是，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，研究者也逐漸認(rèn)識(shí)到DNA也是一種典型的納米材料。它的雙螺旋直徑約為2 nm，螺距為3.4-3.6 nm，而每個(gè)堿基的長(zhǎng)度約為0.34 nm［1］。雙鏈DNA是一個(gè)剛性的高分子材料，其回轉(zhuǎn)長(zhǎng)度達(dá)50 nm；而單鏈DNA則具有較大的靈活性。特別是DNA具有出色的可編碼性，可以根據(jù)堿基配對(duì)原則進(jìn)行比較精確的設(shè)計(jì)。這些特征使我們可以構(gòu)造出變化多樣的納米結(jié)構(gòu)［2］。紐約大學(xué)的Nadrian Seeman教授在20世紀(jì)80-90年代就提出可以用DNA分子組裝出納米圖形，并引領(lǐng)了整個(gè)DNA納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展［3］。

DNA納米技術(shù)在近20年來(lái)得到了迅猛的發(fā)展［4，5］。構(gòu)造自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)有兩種主要方法，包括Seeman課題組發(fā)展的瓦塊（tile）自組裝［6，7］和Paul Rothemund博士發(fā)明的DNA折紙術(shù)（DNA origami）［8］。本文將主要回顧DNA自組裝納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、制造及應(yīng)用。

1 DNA自組裝納米技術(shù)簡(jiǎn)介

構(gòu)造自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)主要有兩大類方法。1998年，Seeman課題組發(fā)展了瓦塊（tile）自組裝，使我們可以在原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM）下看到了DNA構(gòu)造的二維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)［6，7］。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，利用瓦塊自組裝可以構(gòu)造出豐富多彩的納米結(jié)構(gòu)，包括一維線性排列［9］、二維平面網(wǎng)格、可尋址陣列、納米纖維、三維多面體乃至三維晶體［10］等。但是，這種類型的結(jié)構(gòu)也存在一些不足。例如，它們的組裝依賴多條DNA鏈間的精確互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)各鏈的化學(xué)計(jì)量比和熱力學(xué)性質(zhì)要求較嚴(yán)格，組裝過(guò)程相對(duì)繁瑣費(fèi)時(shí)；而且，由于受到瓦塊單元的限制，它們的最終結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度也是很有限的。

2006年，加州理工學(xué)院的Paul Rothemund博士發(fā)明了DNA折紙術(shù)（DNA origami），這一里程碑式的技術(shù)使制作復(fù)雜DNA自組裝結(jié)構(gòu)的能力得到極大提升［8］。DNA折紙術(shù)本質(zhì)上是一種成核自組裝（Nucleation assembly），這不同于瓦塊自組裝的層次自組裝（Hierarchical assembly）。其整個(gè)組裝過(guò)程是圍繞若干成核點(diǎn)（或稱成核鏈）一次進(jìn)行而不分步的。DNA成核自組裝的思想由來(lái)已久，然而當(dāng)Rothemund基于這一思想，提出、設(shè)計(jì)、并實(shí)現(xiàn)了DNA折紙術(shù)［8］，研究者馬上發(fā)現(xiàn)DNA折紙術(shù)生成圖形的復(fù)雜度較瓦塊自組裝至少提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且其編碼便捷、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速，因而受到了極大的關(guān)注。所謂“DNA折紙術(shù)”，就是把一根長(zhǎng)的DNA單鏈像折一張紙一樣，綁定并鋪展成某個(gè)特定形狀。事實(shí)上，“折紙”并非很恰切的比喻，這種技術(shù)更為類似織毛衣的過(guò)程（圖1-A）。Rothemund使用的這根“毛線”（即成核長(zhǎng)鏈）是M13mp18噬菌體的單鏈DNA，有7 249個(gè)堿基。Rothemund將這條成核鏈稱為骨架鏈（Scaffold），而用來(lái)綁定骨架鏈的互補(bǔ)短鏈則稱為訂書(shū)釘鏈（Staple）。Rothemund設(shè)計(jì)的訂書(shū)釘鏈大多數(shù)為32個(gè)堿基，以8個(gè)堿基為一個(gè)單元。整個(gè)骨架鏈為200多條訂書(shū)釘鏈完全互補(bǔ)為雙鏈，從而凝固成剛性的結(jié)構(gòu)。DNA折紙術(shù)產(chǎn)生的圖形復(fù)雜度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了以前的絕大多數(shù)DNA自組裝結(jié)構(gòu)。其像素點(diǎn)數(shù)目較之前的瓦塊自組裝至少高10倍；單個(gè)折紙術(shù)圖形分子量為4.7 MDa，超越了自然界最復(fù)雜的自組裝機(jī)器——真核生物核糖體（4.2 MDa）；而且折紙術(shù)可以一次產(chǎn)生500億個(gè)拷貝的圖形。

Rothemund在這篇里程碑論文中展示的圖形均為對(duì)稱結(jié)構(gòu)（圖1-B）。隨后，上海交通大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所的研究人員用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了第一個(gè)非對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即中國(guó)地圖模擬圖［11］（圖1-C），丹麥奧胡斯大學(xué)則設(shè)計(jì)出了尾部可以活動(dòng)的海豚形狀（奧胡斯大學(xué)的校徽，圖1-D）［12］。2009年，多個(gè)課題組接連報(bào)道了三維DNA折紙術(shù)方面進(jìn)展。Andersen等折出了一個(gè)六面體的空心盒子，而且其中一個(gè)面還能通過(guò)鏈置換反應(yīng)人為控制開(kāi)閉（圖1-E）［13］；Ke等［14］也用DNA折紙術(shù)得到了一個(gè)立體結(jié)構(gòu)——空心四面體（圖1-F）。Kuzuya等［15］根據(jù)前者得到了一個(gè)空心立方體，而且通過(guò)選擇性加入跨面訂書(shū)釘鏈，可以控制立方體的整體構(gòu)型。哈佛大學(xué)的William Shih小組在提出了“蜂窩褶狀模型”（Honeycomb-pleated），構(gòu)造了諸多三維圖形，包括塊狀巨石（多面體）、方形螺帽（有孔三維）、橋式結(jié)構(gòu)（細(xì)線連接）、細(xì)頸瓶（同向嵌套結(jié)構(gòu)）、插槽交叉（垂直向嵌套結(jié)構(gòu)）、堆積交叉（垂直向堆積結(jié)構(gòu)）等（圖1-G）［16］。他們通過(guò)控制交叉處的間距，進(jìn)一步制造出整體扭曲或彎折的三維圖形［17］。顏灝的研究組［18］更是展示了精美的曲面三維納米花瓶結(jié)構(gòu)（圖1-H）。

2012年，哈佛大學(xué)的殷鵬與Shih教授的研究組發(fā)表了一種類似于瓦塊組裝技術(shù)的DNA“積木”組裝技術(shù)［19］。這種技術(shù)以DNA單鏈為“積木”，每個(gè)積木上不同區(qū)域的序列可以與另外的“積木”上的對(duì)應(yīng)序列互補(bǔ)雜交。并且，由于DNA螺旋轉(zhuǎn)角的確定性，這樣的單鏈積木在組裝之后的構(gòu)型也是確定的。這樣，在經(jīng)過(guò)精心的序列設(shè)計(jì)之后，研究者們可以像組裝樂(lè)高積木一樣將這些DNA單鏈組裝為各種三維幾何體，包括三維的英文字母等有著復(fù)雜表面的立體結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)了這一技術(shù)在幾何構(gòu)型上的幾乎無(wú)限的可能。這一方法不再需要多鏈組裝的結(jié)構(gòu)單元，每一條DNA單鏈即是一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，最終結(jié)構(gòu)可由一步退火完成；同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)也是一種“去中心化”的結(jié)構(gòu)，不再受到DNA折紙術(shù)中骨架鏈的長(zhǎng)度和序列限制，在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上更為自由。

2 DNA納米技術(shù)的應(yīng)用

DNA納米技術(shù)不僅可以產(chǎn)生漂亮的圖形，而且還在很多領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。例如，Shih課題組［20］將DNA折紙術(shù)形成的納米管作為介質(zhì)，可以在用核磁共振（NMR）測(cè)定膜蛋白結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生積極作用。Steinhauer等［21］基于熒光標(biāo)記的DNA折紙圖形發(fā)展出用于校準(zhǔn)超分辨率顯微鏡的工具尺。Rothemund與IBM公司合作將DNA折紙術(shù)與光刻技術(shù)結(jié)合起來(lái)，可以將折紙圖形定向固定在宏觀基底上，實(shí)現(xiàn)了在宏觀上對(duì)電子器件的納米級(jí)精確排布［22，23］。DNA折紙術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是所有位點(diǎn)都可以在其產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)上直接尋址，因而可以作為納米尺度可控排布的理想模板。以下將重點(diǎn)介紹基于這種可控排布的若干應(yīng)用。

圖1 DNA折紙術(shù)的研究進(jìn)展

2.1 生物分子檢測(cè)

生物分子的檢測(cè)對(duì)于疾病早期診斷、食品安全乃至反恐方面都有著重要的意義。然而，常規(guī)方法難以實(shí)現(xiàn)在納米尺度的生物檢測(cè)。DNA折紙術(shù)則提供了一種可以在納米尺度操控生物分子識(shí)別的新方法。2008年，Ke等［24］開(kāi)發(fā)了DNA折紙芯片，通過(guò)V字形探針的設(shè)計(jì)方式，能夠在AFM下直接檢測(cè)到核酸雜交結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小RNA的靈敏檢測(cè)（圖2-A）［25］。Zhang等［26］以DNA中國(guó)地圖模擬圖為基底，制備了新型的無(wú)標(biāo)記折紙芯片。這種芯片由于本身是非對(duì)稱圖形，所以無(wú)需添加“索引”。

核酸適配體（Aptamer）是一類利用指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得的能夠與靶分子特異結(jié)合的短單鏈寡核苷酸配體。由于aptamer本身也是核酸構(gòu)成的，所以在DNA自組裝結(jié)構(gòu)中應(yīng)用非常方便。顏灝課題組用核酸適配體實(shí)現(xiàn)了多種蛋白在同一個(gè)DNA折紙模板上特異性可編碼排布［27］。Rinker等［28］則通過(guò)控制核酸適配體的間距離，實(shí)現(xiàn)了高親和力的多價(jià)結(jié)合（Multivalent binding）。Lin等［29］把DNA基底上的核酸適配體用于檢測(cè)，可以通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè)溶液中的特異蛋白。之后他們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制造成DNA結(jié)構(gòu)熒光顏色的變化，并用調(diào)色的辦法來(lái)形成多種顏色作為條形碼，從而一次檢驗(yàn)多種蛋白［30］。他們還嘗試用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大，成功使檢測(cè)靈敏度提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)［31］。2009年，樊春海研究組［32］構(gòu)建了載帶有針對(duì)不同靶標(biāo)分子的核酸適配體的DNA四面體“邏輯門”探針（圖2-B），當(dāng)檢測(cè)樣本中出現(xiàn)一種或多種靶標(biāo)分子時(shí)，四面體的構(gòu)象會(huì)因?yàn)楹怂徇m配體的構(gòu)型變化而發(fā)生相應(yīng)變化，從而產(chǎn)生不同的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescent resonance energr transfer，F(xiàn)RET）效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)相當(dāng)于與門、或門、與非門等邏輯門的邏輯判定。并且，該邏輯門檢測(cè)策略還可用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)分子的檢測(cè)。

2.2 DNA納米機(jī)器人

發(fā)展可以在納米尺度運(yùn)動(dòng)的機(jī)器人是納米技術(shù)的目標(biāo)之一。DNA折紙術(shù)同樣提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)用于納米機(jī)器人的研究。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，已有多種動(dòng)態(tài)DNA納米機(jī)器被相繼報(bào)道［33，34］。它們還可采用金屬離子［35］、質(zhì)子［36，37］、DNA鏈或酶反應(yīng)［38-40］驅(qū)動(dòng)。例如，Gu等［41］把兩種DNA納米結(jié)構(gòu)元件插入帶兩個(gè)卡槽的DNA折紙圖形中，于是兩個(gè)元件就有4種可能的狀態(tài)組合。他們?cè)O(shè)計(jì)出在每種組合下兩個(gè)器件都能共同捕獲一個(gè)特異的識(shí)別分子，從而用AFM確認(rèn)了這個(gè)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)的正常工作（圖2-C）。之后，Gu等［42］在一個(gè)階梯狀折紙基底上依次放3個(gè)卡槽，并設(shè)計(jì)了一個(gè)三臂四足的機(jī)器人。機(jī)器人在基底上運(yùn)動(dòng)，行進(jìn)過(guò)程中通過(guò)判斷3個(gè)卡槽的狀態(tài)來(lái)決定是否接納對(duì)應(yīng)的貨物。他們用3種納米金粒子作為貨物，并在透視電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM）下觀察納米金的排布形狀，結(jié)果顯示能特異的得到8種貨物組合的任意一種（圖2-D）。這樣就形成了一個(gè)迷你的納米組裝生產(chǎn)線。DNA納米機(jī)器人中的另一個(gè)經(jīng)典工作是一種在折紙圖形表面行走的分子蜘蛛［43］。該“蜘蛛”的模型是由Pei等［44］開(kāi)發(fā)出來(lái)，它的“身子”是一個(gè)四價(jià)鏈霉親和素，三只腳的序列包含一段核酶，核酶對(duì)雜交基底的切割是“蜘蛛”行進(jìn)的關(guān)鍵。研究者在折紙術(shù)上構(gòu)造了一系列連續(xù)的路徑，然后用AFM來(lái)捕捉“蜘蛛”的移動(dòng)，這可以說(shuō)是一個(gè)真正意義上的分子機(jī)器人［45］。

2.3 DNA納米反應(yīng)器

化學(xué)反應(yīng)的速率在很大程度上取決于溶液中分子的碰撞幾率。因此，如果能夠?qū)蓚€(gè)分子或基團(tuán)的空間位置拉近，形成一種反應(yīng)中心或活性域，那么就可以極大提高化學(xué)反應(yīng)的效率。用DNA納米結(jié)構(gòu)作為模板來(lái)組織引導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)（DNA-directed/ templated reaction），從而構(gòu)建納米生物反應(yīng)器，是一個(gè)新興的研究方向［46-48］。

丹麥奧胡斯大學(xué)CDNA中心的Gothelf組開(kāi)發(fā)了一種稱為線型DNA模塊（linear/tripoidal oligonucleotide functionalized modules，LOM） 或 三 岔 型NDA模 塊（tripoidal olgonucleotide functinalized module，TOM）。LOM的核心是一段3苯環(huán)串聯(lián)［49］（也可以5苯環(huán)［50］）的有機(jī)結(jié)構(gòu)，兩端兩個(gè)苯環(huán)上面各有一個(gè)半salen的結(jié)構(gòu)域，此外還各連有一條DNA單鏈。如果把每個(gè)LOM看做一個(gè)構(gòu)件，那么構(gòu)件間就通過(guò)兩側(cè)的DNA鏈互補(bǔ)連接，形成一維線性產(chǎn)物。由于設(shè)計(jì)的互補(bǔ)鏈修飾位置是相反的，所以在該產(chǎn)物中，兩個(gè)半salen結(jié)構(gòu)域恰好“頂在一起”，此時(shí)當(dāng)加入錳鹽和乙二胺，將發(fā)生metal-salen反應(yīng)，使得瓦塊間不僅依靠DNA雜交相連，而且苯環(huán)部分也“粘”在了一起。研究發(fā)現(xiàn)，此時(shí)即使把DNA鏈切斷（通過(guò)引入二硫鍵），線性結(jié)構(gòu)依然牢固［51］。這樣，整個(gè)過(guò)程就相當(dāng)于借助DNA的配對(duì)來(lái)誘使其他有機(jī)結(jié)構(gòu)的聚合，而且由于苯環(huán)骨架和metalsalen配合物都是共面的，這為將來(lái)制造納米線路提供了新的思路［52］。TOM與LOM原理相同，只不過(guò)TOM是個(gè)三臂結(jié)構(gòu)，能夠形成更復(fù)雜的二維組裝產(chǎn)物［53］。另外，核心的metal-salen反應(yīng)也可以替換為酸性環(huán)境的還原胺化反應(yīng)（Reductive amination，產(chǎn)物為Tetrahydrosalen），產(chǎn)物甚至更穩(wěn)定［54］。除了LOM/TOM模塊，該小組最近還用DNA雙鏈［55］或4螺旋束tile（4HB）［56］來(lái)控制有機(jī)棒（Organic rods）的耦合，其距離已精確到雙螺旋內(nèi)的兩條單鏈。

以色列希伯來(lái)大學(xué)的Willner課題組在金電極上伸出單鏈DNA作為模板，然后在中間和末端的兩個(gè)位置分別結(jié)合連有不同反應(yīng)基團(tuán)的兩條DNA。不同的基團(tuán)排列順序、不同的基團(tuán)與電極間距離，導(dǎo)致了電流強(qiáng)度的改變，據(jù)此檢測(cè)和驗(yàn)證結(jié)果。參與的反應(yīng)包括葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）-二茂鐵、GOx-MP11（微過(guò)氧化物酶-11）等生物電催化反應(yīng)［57］，CdS納米顆粒-relay（類似“繼電器”作用的分子）、光敏劑（Ru2+）-relay等光電化學(xué)反應(yīng)［58］，熒光基團(tuán)與QD的FRET反應(yīng)［59］等。有的還通過(guò)加入酶等實(shí)現(xiàn)了可逆反應(yīng)［59］。他們的另一個(gè)工作是用DNA自組裝得到特定的結(jié)構(gòu)，然后在相鄰孔洞內(nèi)修飾不同輔酶（實(shí)際使用兩套輔酶對(duì)，分別是GOx-HRP和GDH-NAD+）。由于輔酶對(duì)離得很近，所以能夠形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)效率比沒(méi)有DNA模板時(shí)高出很多，說(shuō)明DNA網(wǎng)格確實(shí)起著拉近距離的作用（圖2-E）［60］。他們又把這套體系移植到DNA納米線上，納米線是先由4條DNA組成圓形結(jié)構(gòu)，然后借助可卡因分子組裝而成。相鄰tile上分別修飾GOx和HRP，其反應(yīng)效率比沒(méi)有DNA模板或可卡因時(shí)高6倍以上［61］。

在Gothelf與樊春海研究小組的合作研究中［62］，他們則用DNA折紙結(jié)構(gòu)作為模板固定GOx與HRP。這一結(jié)構(gòu)不但能精確控制兩種酶分子之間的距離，還能在展開(kāi)的二維平面與卷曲的三維管狀結(jié)構(gòu)之間變換（圖2-F）。研究結(jié)果表明，這樣的結(jié)構(gòu)變化能明顯影響到雙酶系統(tǒng)反應(yīng)的效率。當(dāng)酶分子被卷入DNA納米管結(jié)構(gòu)內(nèi)部后，反應(yīng)效率明顯增強(qiáng)。研究者們認(rèn)為這是對(duì)自然界細(xì)胞內(nèi)部受限空間內(nèi)發(fā)生的生化反應(yīng)的一種模擬，在這樣的限域空間內(nèi)，酶分子與反應(yīng)各組分的局域濃度較高，因此，盡管其在宏觀尺度上的平均濃度很低，但也能獲得較高的反應(yīng)效率。根據(jù)這樣的機(jī)制和策略，人們可以更好地效法自然界設(shè)計(jì)和構(gòu)建高效的納米生物反應(yīng)器。

2.4 無(wú)機(jī)納米材料可控排布

DNA納米結(jié)構(gòu)具有精確可控的優(yōu)勢(shì)，然而DNA本身缺乏明顯的光電效應(yīng)，因而難以在光學(xué)或電子學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮作用。幸運(yùn)的是，DNA納米結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)具有光電效應(yīng)的無(wú)機(jī)納米粒子的精確排布，從而制備出具有可控光電性質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)。

2.4.1 納米金粒子 納米金粒子（Au nanoparticle）在水中形成的分散系俗稱膠體金，金顆?？膳c氨基發(fā)生非共價(jià)的靜電吸附而牢固結(jié)合，與巰基之間形成很強(qiáng)的Au-S鍵，后者也是最常用的納米金與DNA的結(jié)合方式。2004年，Seeman小組率先用雜交法實(shí)現(xiàn)了納米金的條紋排列［63］，之后他們又完成了兩種大小納米金的有序交叉排列［64］。利用類似的方法，Hung等［23］和Gerdon等［65］想在“已特異吸附在固相表面的折紙圖形”上進(jìn)一步修飾納米金時(shí)，Ding等［66］和Pal等［67］在DNA折紙三角形上線性排列納米金。Sharma等［68］則把硫醇修飾的DNA改為用酯化的硫辛酸修飾，從而與金的結(jié)合由一個(gè)硫鍵變?yōu)榱藘蓚€(gè)硫鍵，進(jìn)而顯著提高了這種方法的產(chǎn)率。他們?cè)谡奂埿g(shù)矩形的兩個(gè)位置特異的連接了兩個(gè)金球，效率高達(dá)90%以上。

除了可以在DNA模板上排布金球，還能實(shí)現(xiàn)在DNA上生長(zhǎng)金球。Stearns等利用無(wú)機(jī)結(jié)合肽（Inorganic binding peptides，IBPs）對(duì)金離子的成核作用，先用雜交法把IBP連接到納米管上，再加入AuCl4使成核，最終也得到了納米金顆粒的一維排布［69］。納米金不但能被DNA排布，有時(shí)候它還會(huì)反作用于自組裝圖形。2009年，Sharma等［70］在DX lattice中修飾納米金，由于所使用的金球直徑大于DNA結(jié)構(gòu)上金球連接位點(diǎn)的平面距離，于是金球的斥力使得平面array卷曲成納米管狀，且通過(guò)控制金球大小可以控制得到的納米管構(gòu)型（圖2-G）。

圖2 DNA納米結(jié)構(gòu)的代表性應(yīng)用

2.4.2 碳納米管 碳納米管（Carbon nanotubes）是由一層或多層石墨按照一定方式卷曲而成的具有管狀結(jié)構(gòu)的納米材料。自從1991年日本科學(xué)家Sumio Iijima發(fā)現(xiàn)碳納米管以來(lái)［71］，碳納米管以其優(yōu)異的熱學(xué)、力學(xué)以及光電特性［72］受到了多個(gè)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注［73，74］，并實(shí)現(xiàn)了多種應(yīng)用［75，76］。對(duì)于特定的碳納米管，控制其屬性甚至功能化的關(guān)鍵，在于對(duì)其進(jìn)行特定的組裝與排布。用DNA來(lái)識(shí)別、篩選、組裝、排列碳納米管，需要解決把DNA與CNT連接起來(lái)的問(wèn)題。2002年，Dwyer等［77］發(fā)明了在DNA末端修飾氨基，再與碳納米管末端連接的方法［78］。他還據(jù)此提出了用DNA排布碳納米管的通用思路、設(shè)計(jì)和算法。碳納米管除了末端可以修飾DNA，其側(cè)壁也是很好的結(jié)合部位。例如，Han和Deng等［79］在碳納米管上纏繞了修飾有硫醇的DNA，然后加入不同大小的納米金，使金一維排列在碳納米管上。

2009年，Maune等［80］在一個(gè)連有tile長(zhǎng)帶的折紙矩形上特異交叉排布了兩根碳納米管。他們先用保護(hù)鏈把碳納米管上用于雜交的序列局部封閉，然后與帶有探針的矩形DNA折紙混合，可以使碳納米管結(jié)合在折紙基底上。他們發(fā)現(xiàn)用這種方法可以產(chǎn)生具有場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）特性的器件。這種用DNA排布碳納米管來(lái)制作納米電路的方法盡管目前效率不高，但其精確性和并行性卻是傳統(tǒng)光刻技術(shù)所不能比擬的。

2.5 藥物遞送

眾所周知，在當(dāng)今人類面對(duì)癌癥等多種重大疑難疾病的挑戰(zhàn)時(shí)，傳統(tǒng)的藥物存在著諸多亟需克服的缺點(diǎn)，而新藥的開(kāi)發(fā)又代價(jià)高昂。為了改善這些既有藥物的性能，發(fā)展合適的藥物遞送系統(tǒng)就成為了當(dāng)前生物醫(yī)藥領(lǐng)域的迫切需求和研究熱點(diǎn)。近幾十年來(lái)，隨著納米技術(shù)的興起，多種納米材料都被用于藥物遞送的研究，如陽(yáng)離子脂質(zhì)體、聚合物、各種金屬納米顆粒、碳納米管等。但是，這類載體通常存在不容忽視的安全問(wèn)題，如細(xì)胞毒性和臟器累積毒性等。而DNA納米結(jié)構(gòu)作為近年來(lái)興起的一類新型的納米材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有著其它材料不可比擬的優(yōu)勢(shì)：（1）DNA本身作為生命的遺傳物質(zhì)材料普遍存在于生物體內(nèi)，而外源DNA在生物體內(nèi)則可被降解利用，因此幾乎沒(méi)有生物相容性、細(xì)胞毒性和累積毒性的問(wèn)題。（2）DNA分子合成和化學(xué)修飾技術(shù)已經(jīng)較為成熟和商業(yè)化，便于我們?cè)贒NA納米結(jié)構(gòu)上進(jìn)行各種功能化修飾，從而拓展DNA納米結(jié)構(gòu)的功能，并且能在同一個(gè)結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)多種功能的組合。作為藥物載體，這樣的特點(diǎn)有利于實(shí)現(xiàn)藥物靶向、多藥物協(xié)同載運(yùn)和藥物控制釋放等功能。（3）更重要的是，由于DNA基于堿基互補(bǔ)配對(duì)帶來(lái)的精確性和可編程性，我們可以對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的外形、尺寸、價(jià)態(tài)等性狀進(jìn)行精確調(diào)控，獲得高度定制化和有序化的“智能”載體，最終實(shí)現(xiàn)診療一體化的“納米醫(yī)生”。

但是，DNA納米結(jié)構(gòu)用作藥物載體還有一大關(guān)鍵問(wèn)題，帶負(fù)電荷的DNA分子在形成納米結(jié)構(gòu)之后，能否穿過(guò)同樣帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。在常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染核酸分子的操作中，我們通常需要帶正電荷的轉(zhuǎn)染試劑（主要是陽(yáng)離子脂質(zhì)體聚合物）幫助外源核酸分子被細(xì)胞攝取。但是，2011年，Turberfield團(tuán)隊(duì)［81］和樊春海研究組［82］都觀察到，納米DNA四面體結(jié)構(gòu)可在不需要借助任何特異配體或轉(zhuǎn)染試劑的情況下被活細(xì)胞攝取。Sleiman團(tuán)隊(duì)［83］也報(bào)道了滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）組裝的管狀DNA納米結(jié)構(gòu)有較高的細(xì)胞攝取率。這些研究表明，與非結(jié)構(gòu)化的線性核酸分子不同，有一定剛性和密實(shí)度的DNA納米結(jié)構(gòu)本身可被細(xì)胞主動(dòng)攝取。樊春海研究組對(duì)熒光標(biāo)記的DNA四面體為研究對(duì)象進(jìn)行了單顆粒追蹤，觀察了它被哺乳細(xì)胞攝取的過(guò)程，說(shuō)明了該類型DNA納米結(jié)構(gòu)可以通過(guò)能量依賴的細(xì)胞主動(dòng)攝取進(jìn)入細(xì)胞［84］。這些研究結(jié)果為DNA納米結(jié)構(gòu)直接作為藥物遞送載體的可能性提供了支持。以下介紹DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物遞送領(lǐng)域的一些應(yīng)用。

2.5.1 小分子藥物遞送 小分子藥物，尤其是像阿霉素、順鉑、紫杉醇這樣的腫瘤治療藥物，通常對(duì)機(jī)體正常組織和細(xì)胞也有很高的毒性，副作用極強(qiáng)。并且，反復(fù)使用這類藥物容易使目標(biāo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR），降低藥物的治療效果。因此，發(fā)展這類針對(duì)小分子藥物的藥物遞送系統(tǒng)，改善這類藥物的缺陷就顯得很有意義。例如，阿霉素就是這類藥物中的一個(gè)典型代表，它可以通過(guò)嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)抑制其復(fù)制和表達(dá)，因此對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷效果。然而，它的選擇性較差，有明顯的毒副作用，也容易因?yàn)榧?xì)胞的耐藥性而失去效果。值得注意的是，由于阿霉素具有可嵌入DNA雙鏈的特性，DNA納米結(jié)構(gòu)就顯得尤其適合用于阿霉素轉(zhuǎn)運(yùn)。在這一研究方向，丁寶全教授的研究組已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展［85，86］，他們利用DNA折紙結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿霉素分子的高效裝載（圖3-A）。研究表明，DNA折紙結(jié)構(gòu)可以將阿霉素分子釋放到具有耐藥性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而殺死那些在同等濃度條件下游離阿霉素分子無(wú)法殺死的腫瘤細(xì)胞。并且，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這些載帶阿霉素的DNA折紙結(jié)構(gòu)可以通過(guò)腫瘤的“穿透性與滯留性增強(qiáng)”（EPR）效應(yīng)聚集在小鼠的腫瘤部位，從而有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。而Hogberg團(tuán)隊(duì)［87］則研究了不同扭轉(zhuǎn)角度的DNA折紙結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)阿霉素到3種不同的乳腺癌細(xì)胞系中的效果。他們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)DNA結(jié)構(gòu)的扭轉(zhuǎn)角度可以調(diào)節(jié)藥物的載帶量及藥物的釋放動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)可預(yù)定義的藥物釋放。

2.5.2 核酸分子遞送 與小分子藥物相比，核酸分子藥物，如CpG（“胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤”）核酸、反義核酸（如反義DNA、小干擾RNA、微小RNA等）、核酸適配體（Aptamer）等，因其較高的選擇性和較低的副作用，顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景。這些核酸藥物的傳統(tǒng)遞送策略包括對(duì)核酸分子進(jìn)行化學(xué)修飾、利用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑幫助其進(jìn)入細(xì)胞等。近年來(lái)，用DNA納米結(jié)構(gòu)來(lái)載帶核酸分子也了吸引研究者們的關(guān)注。因?yàn)?，載體與載荷都是核酸分子，它們之間只需要通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)就可以很便利地進(jìn)行雜交連接，這就省卻了將載體和載荷分子進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)的麻煩。與通過(guò)非共價(jià)吸附載帶藥物的方式相比，這樣的連接又可以對(duì)核酸藥物分子的空間排布進(jìn)行更精確的控制，使其作用更具確定性。例如，研究發(fā)現(xiàn)，未甲基化的“胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤”（CpG）序列的寡核苷酸可被哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞識(shí)別并激活免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此可以作為一種有效的免疫激活藥物或疫苗佐劑用于各種免疫相關(guān)疾?。ò▊魅炯膊?、癌癥等）的治療。然而，在生理?xiàng)l件下，天然的CpG寡核苷酸會(huì)很容易被核酸酶降解，也很難直接進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到目標(biāo)位置發(fā)揮作用。因此，近年來(lái)，研究者們報(bào)道了多種利用DNA納米結(jié)構(gòu)載帶CpG寡核苷酸的策略。這其中包括：Nishikawa等采用的Y-形［88］、X-形等“多足形”DNA結(jié)構(gòu)［89］和以這些結(jié)構(gòu)為單元組裝的更大尺度的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)［90］乃至水凝膠結(jié)構(gòu)［88］，樊春海研究組［82］和顏灝研究組［91］相繼報(bào)道的DNA四面體結(jié)構(gòu)（圖3-B），以及更大尺度的基于DNA折紙術(shù)的納米管［92］、納米帶［93］等結(jié)構(gòu)。這些研究工作的結(jié)論表明，與游離的CpG核酸分子相比，引入DNA納米結(jié)構(gòu)之后，CpG核酸的穩(wěn)定性普遍增加了，免疫細(xì)胞對(duì)于CpG核酸的攝取效率顯著提高了，對(duì)于細(xì)胞的免疫激活能力也大大增強(qiáng)了。這種性能改變與DNA納米結(jié)構(gòu)帶來(lái)的尺寸變化相關(guān)。因此，DNA納米結(jié)構(gòu)對(duì)于CpG核酸而言無(wú)疑是一種較為理想的載體。此外，DNA納米載體在載帶CpG核酸的同時(shí)還可以共載運(yùn)其它的藥物分子，如疫苗［91］（圖3-C）和阿霉素［88］，發(fā)揮CpG免疫佐劑的功能來(lái)強(qiáng)化其它藥物的效力，獲得了比單獨(dú)使用這些藥物更好的效果，為多藥物共遞送和聯(lián)合治療提供了借鑒。

另外一類引起廣泛重視的核酸藥物是小干擾RNA（siRNA），這類RNA分子可以有選擇性且高效率地沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，即RNA干擾（RNAi）作用，因此在基因治療領(lǐng)域被寄予厚望。但是，未經(jīng)化學(xué)修飾的RNA分子同樣存在極易被降解、體內(nèi)半衰期很短，難以進(jìn)入細(xì)胞等難題。2012年，來(lái)自哈佛醫(yī)學(xué)院的Anderson教授等研究者們成功地將DNA四面體作為載體載帶siRNA進(jìn)入小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞當(dāng)中，并實(shí)現(xiàn)了靶向基因的沉默（圖3-D）。在他們的策略當(dāng)中，siRNA通過(guò)序列互補(bǔ)雜交連接到四面體側(cè)面伸出的DNA手臂鏈上，其誘導(dǎo)RNA干擾的效果依然不受影響，說(shuō)明了DNA納米結(jié)構(gòu)用于siRNA載帶的可行性。

2.5.3 “智能化”藥物遞送 除了起到保護(hù)并幫助藥物分子到達(dá)靶位點(diǎn)的作用之外，理想的藥物遞送載體還應(yīng)該更加“智能化”，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物靶向遞送并根據(jù)環(huán)境因素或外部刺激控制藥物釋放，最終成為“診斷-治療一體化”的“納米醫(yī)生”。近年來(lái)，DNA自組裝納米結(jié)構(gòu)在這一領(lǐng)域也逐漸嶄露頭角。

載體的主動(dòng)靶向性，通常是通過(guò)在載體上偶聯(lián)適當(dāng)?shù)呐潴w，如多肽、抗體、核酸適體等實(shí)現(xiàn)的。這些配體能與靶細(xì)胞內(nèi)部或表面的一些高表達(dá)的受體結(jié)合，從而使得載體在該細(xì)胞處有選擇性地富集并發(fā)揮作用。因?yàn)镈NA納米結(jié)構(gòu)的高度可編程性和可尋址性，DNA納米結(jié)構(gòu)可以精確控制靶向配體在其結(jié)構(gòu)上的空間排布、朝向和密度等參數(shù)，因此尤其適合用于靶向性載藥的研究。在DNA四面體用于siRNA遞送的研究工作中［94］，研究者們引入了葉酸分子作為靶向配體，因?yàn)槿~酸受體在許多癌細(xì)胞系中都是過(guò)量表達(dá)的。研究結(jié)果表明，這些葉酸修飾的DNA載體展現(xiàn)出很強(qiáng)的靶向效應(yīng)，能夠有選擇性地在腫瘤中富集并產(chǎn)生基因沉默效果；而未修飾葉酸分子或者葉酸分子朝向不合適的載體則不能發(fā)揮預(yù)期的效果。譚蔚弘教授的研究組［95，96］則利用帶有核酸適配體序列的DNA納米自組裝結(jié)構(gòu)載運(yùn)阿霉素或反義核酸，使藥物獲得了針對(duì)特定的白血病細(xì)胞株的靶向性（圖3-E）。

圖3 DNA納米自組裝結(jié)構(gòu)在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用研究

另一方面，依賴單一的受體-配體相互作用帶來(lái)的靶向性，其選擇性往往是不足的，這就需要引入多個(gè)判定條件增加靶向的可靠性。于是，“邏輯門”對(duì)多個(gè)條件進(jìn)行判定的原理就可以被研究者們用到靶向可控的藥物釋放上，這就是“智能藥物”的思路。而DNA納米結(jié)構(gòu)的眾多優(yōu)點(diǎn)也為構(gòu)造這樣的智能遞送系統(tǒng)提供了可能。2012年，Church研究組［97］的研究者們利用一種可開(kāi)合的DNA納米匣子實(shí)現(xiàn)了由邏輯門控制的藥物載體。這個(gè)匣子由兩個(gè)包含了不同核酸適配體的“鎖扣”控制，只有當(dāng)環(huán)境中這兩種核酸適配體所針對(duì)的靶標(biāo)分子——相當(dāng)于兩把鑰匙——同時(shí)存在并觸發(fā)核酸適配體的構(gòu)型變化時(shí)，兩個(gè)鎖扣才能打開(kāi)，從而使匣子內(nèi)部的載荷分子得以暴露在外（圖3-F）。這樣，研究者們獲得了一種由邏輯“與”門控制的，只有當(dāng)兩種條件同時(shí)滿足時(shí)才能觸發(fā)藥物分子釋放的智能藥物載體。這種開(kāi)合自如的出眾特色得益于DNA納米結(jié)構(gòu)的精確可控性，這一成果展示了DNA納米結(jié)構(gòu)在智能化藥物領(lǐng)域的巨大潛力。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上可見(jiàn)，DNA納米技術(shù)在近20年間獲得了飛躍式的發(fā)展。從技術(shù)演進(jìn)趨勢(shì)來(lái)看，基于DNA自組裝人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)已經(jīng)從簡(jiǎn)單的一維或無(wú)定型結(jié)構(gòu)發(fā)展到了精確可定義的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，從靜態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)展到了可控的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，研究者們也從最初單純的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)逐漸向功能探索方向深入。在對(duì)于DNA納米結(jié)構(gòu)的功能研究上，從對(duì)其它材料或分子的空間排布的控制，到納米反應(yīng)器的構(gòu)建，再到智能化的分子診斷和藥物遞送，DNA納米技術(shù)也走過(guò)了一條優(yōu)美的發(fā)展路徑。目前，DNA納米技術(shù)的廣泛應(yīng)用還面臨一些挑戰(zhàn)。例如，DNA大規(guī)模合成的成本仍然偏高，組裝復(fù)雜DNA納米結(jié)構(gòu)的純度和產(chǎn)率還有待提高［98］。但是，我們認(rèn)為，憑借化學(xué)合成技術(shù)和生物技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，DNA微陣列合成術(shù)［99］和細(xì)胞內(nèi)的DNA生物合成［100］這樣的手段可以為DNA納米結(jié)構(gòu)的組裝提供新的方法，改進(jìn)后的電泳［101］、超速離心［102］和高效液相色譜等手段［103］也可以用于優(yōu)化DNA納米結(jié)構(gòu)的產(chǎn)率，更加精巧、復(fù)雜、智能化的DNA納米結(jié)構(gòu)還將層出不窮。并且為克服這些挑戰(zhàn)付出的努力也是值得的，因?yàn)镈NA納米結(jié)構(gòu)的尺度正好處于生物大分子相互作用產(chǎn)生復(fù)雜生命活動(dòng)的尺度范圍內(nèi)，在可以預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，我們相信DNA納米技術(shù)本身也還將更加緊密地與生物醫(yī)學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)相互交叉結(jié)合，使人們通過(guò)對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)更加深入地介入到生命活動(dòng)最基本的層級(jí)當(dāng)中，從而幫助人們更加深刻地理解生命活動(dòng)的機(jī)制。

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Advances on Self-Assembled DNA Nanostructures

Yu Yang1Li Jiang2Zhang Zhao3Fan Chunhai2
（1. Department of Electronic Information，Shanghai Institute of Scientific Management，Shanghai 201800；2. Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201800；3. Department of Chemistry，Aarhus University，Aarhus 8000，Denmark）

Studies on self-assembled DNA nanostructures have achieved great progress in recent decades. In this article, we introduced the general principles of DNA nanostructures and the history of their development. Their features and advantages are also summarized. Their applications in biosensing, nanoreactors, nanoscale spatial arrangement, nanorobots, and drug delivery have been reviewed. The future of DNA nanotechnology has also been prospected.

DNA origami；nanomachine；nanodrug

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.011

2015-02-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（B050902）

俞洋，女，碩士，研究方向：DNA計(jì)算及DNA納米技術(shù)；E-mail：daizy1111@hotmail.com

樊春海，男，博士，研究方向：生物傳感、生物成像及DNA納米技術(shù)；E-mail：fchh@sinap.ac.cn