利用家蠶桿狀病毒表達家蠶肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶蛋白

王鑫，李懿，陳慧芳，周小英，謝康，趙萍

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利用家蠶桿狀病毒表達家蠶肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶蛋白

王鑫，李懿，陳慧芳，周小英，謝康，趙萍

家蠶基因組生物學國家重點實驗室西南大學，重慶 400716

王鑫, 李懿, 陳慧芳, 等. 利用家蠶桿狀病毒表達家蠶肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶蛋白. 生物工程學報, 2015, 31(3): 421–430.Wang X, Li Y, Chen HF, et al. Expression of sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from Bombyx mori by baculovirus expression system. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 421–430.

肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶 (Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, Serca) 負責將細胞中多余的Ca2+轉(zhuǎn)運并存儲于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而維持細胞內(nèi)適宜的Ca2+環(huán)境。家蠶Serca創(chuàng)造的細胞內(nèi)及細胞外Ca2+平衡對家蠶正常生命活動的維持具有重要作用。由于Serca分子量較大并具有10次跨膜結構，很難在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達。為了獲得具有生物學活性的重組Serca蛋白，利用pFastBac Dual載體構建了用于表達和的雙元桿狀病毒表達載體，轉(zhuǎn)染細胞后獲得重組病毒，將重組病毒感染細胞后，成功地在細胞中表達了EGFP和Serca。通過熒光觀察及Western blotting分析表明，感染后細胞中Serca和EGFP表達模式一致，從感染后48 h開始表達，在感染后96 h表達量最大。對獲得的重組蛋白進行酶活分析，發(fā)現(xiàn)感染后48 h至120 h的細胞Serca酶活顯著提高。表明具有生物學活性的Serca在此系統(tǒng)中成功獲得表達，為深入研究Serca蛋白的功能奠定了基礎。

家蠶，桿狀病毒，基因表達，雙元表達系統(tǒng)，肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶，酶活

鈣離子(Ca2+) 是細胞中作用最為廣泛的信號之一。在鱗翅目模式昆蟲家蠶的生命周期中，鈣離子參與了其重要的生長、發(fā)育、變態(tài)和生殖過程[1-3]。由于過量的Ca2+會引起細胞毒性[4]，在細胞中Ca2+的含量受到精確調(diào)控。在這個過程中，很多鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白如肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶(Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, Serca) 發(fā)揮著很重要的作用。

Serca定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，利用水解ATP的能量將一個Ca2+轉(zhuǎn)運進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，同時將一個H+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中[5-7]。目前有研究報道，Serca與昆蟲肌肉收縮、心臟節(jié)律及抵御冬季寒冷環(huán)境相關[8-9]。雖然Serca參與昆蟲重要的生命活動，但在家蠶中相關研究卻很少。2012年，張松斗等對家蠶肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶 (BmSerca) 時空表達特征進行了分析，推測BmSerca可能參與了家蠶PBAN信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)途徑中Ca2+的轉(zhuǎn)運[10]。

我們前期分析發(fā)現(xiàn)，BmSerca屬于典型的P型ATP酶，預測的相對分子量為112.7 kDa，具有10個跨膜結構域。由于其具有如此復雜的結構，BmSerca很難在大腸桿菌中進行表達，這也為其功能的研究制造了很多障礙。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)是當今基因工程領域四大表達系統(tǒng)之一，其具有安全性高、易于篩選、具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達外源蛋白的能力[11]。因此，為了獲得具有生物學活性的家蠶Serca重組蛋白，本研究采用了家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)對家蠶Serca進行了表達。首先，我們克隆了增強型綠色熒光蛋白基因和含有6×His-tag的家蠶基因，將其構建進具有雙啟動子的pFastBac Dual載體中，獲得了重組供體質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)座作用構建整合表達和的重組桿狀病毒顆粒，提取Bacmid后轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞系BmN-SWU1，通過觀察EGFP的表達情況判定細胞中病毒顆粒擴增。收集感染后細胞培養(yǎng)基后，感染細胞。感染后每24 h收集細胞，對細胞總蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western blotting分析，結果表明重組Serca表達模式與EGFP相同，在感染后48 h的細胞中開始表達。對感染后的細胞勻漿進行酶活分析，發(fā)現(xiàn)感染后細胞Serca酶活顯著提高。本研究可為家蠶Serca活性形式的獲得及進一步闡明其功能奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞和試劑

供體質(zhì)粒pFastBac Dual及昆蟲細胞培養(yǎng)基TC-100購自Invitrogen公司。用于克隆的菌株Trans1-T1購自北京全式金公司。含有家蠶Bacmid和輔助質(zhì)粒 (pMON7124) 的DH10Bac宿主菌由家蠶基因組生物學國家重點實驗室保存。表達所用細胞系為家蠶基因組生物學國家重點實驗室構建并保存的BmN-SWU1細胞系，此細胞系來源于家蠶卵巢。胎牛血清購自PAA公司。轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司。限制性內(nèi)切酶Ⅰ、ⅠⅠⅠ酶購自寶生物工程有限公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司。引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。細菌培養(yǎng)使用的抗生素及測定酶活所用試劑MOPS、蔗糖、PMSF、苯甲脒、蛋白酶抑制劑、EGTA、MgCl2、KCl、CaCl2、磷酸烯醇式丙酮酸、乳糖脫氫酶、丙酮酸激酶、NADH、TritonX-100、疊氮化鈉及ATP均購自Sigma公司。

1.2 重組供體質(zhì)粒的構建

首先利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物 (表1)，通過PCR分別從本實驗室保存的質(zhì)粒中擴增得到和含有6×His-tag的片段。對擴增得到的片段和片段利用Ⅰ、Ⅰ及Ⅰ、Ⅰ分別進行雙酶切，經(jīng)過切膠純化后通過T4 DNA連接酶依次克隆到pFastBac Dual載體上，獲得含有[P--HSVtk]和[P--sv40]兩個表達框的重組供體質(zhì)粒 (圖1)。

1.3 重組病毒的構建及重組蛋白的表達

病毒載體的構建及重組蛋白Serca的表達過程如圖1所示。首先將重組載體轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細胞，涂布于含有三抗 (50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四環(huán)素、7 μg/mL慶大霉素) 及40 μg/mL IPTG和20 mg/mL X-gal 的LB平板上。37 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取白色菌落擴大培養(yǎng)，進行菌液PCR鑒定。將經(jīng)PCR驗證正確的克隆接種于三抗的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后提取Bacmid。利用脂質(zhì)體介導的方法將Bacmid轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細胞。感染后72 h收集培養(yǎng)基，為P1代病毒粒子，取250 μL P1代病毒粒子加入細胞中，感染72 h，收集P2代病毒粒子，重復直到獲得P3代病毒粒子后，測定病毒滴度 (PFU/mL)。

以PFU及感染復數(shù) (MOI=10) 計算表達所需病毒粒子含量，將適量病毒感染細胞，感染后每24 h通過熒光顯微鏡進行熒光觀察。

表1 本研究所用引物

Underlined letters indicate restriction enzyme digestion sites; the dashed line represents the sequence of 6×His-tag.

圖1 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白流程圖

1.4 SDS-PAGE及Western blotting分析

感染后每24 h收集細胞，利用Buffer A (20 mmol/L MOPS、0.25 mol/L蔗糖、100 μg/mL苯甲脒、0.23 mmol/L PMSF及1倍的蛋白酶抑制劑，pH 7.0) 重懸細胞后用玻璃小研棒將細胞充分裂解。5 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清，利用BCA蛋白定量法對總蛋白進行定量。取5 μg蛋白進行SDS-PAGE，電泳結束后利用考馬斯亮藍對膠塊進行染色。

設計引物時，我們在Serca的N端添加了6×His的序列標簽，因此可以利用Western blotting對重組蛋白的表達情況進行分析。SDS-PAGE后將蛋白通過半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以抗6×His-tag單克隆抗體 (鐘鼎生物) 作為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG (碧云天) 為二抗雜交后利用ECL顯色液進行顯色反應。另外，選取β-Actin作為內(nèi)參。

1.5 重組蛋白的酶活測定

Serca酶活測定方法參考Saborido等[12]的方法，首先以細胞中β-Actin對酶活實驗的蛋白質(zhì)量進行均一化。將含有相同β-Actin蛋白量的勻漿液加入到標準酶活測定溶液 (25 mmol/L MOPS、0.2 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2、5 mmol/L疊氮化鈉、 0.6 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸、2.4 U/mL丙酮酸激酶、10 U/mL乳酸脫氫酶、0.27 mmol/L NADH)中。制備兩管平行實驗體系，其中一管中額外加入20 mmol/L CaCl2、10 mmol/L 疊氮化鈉和0.005% Triton X-100。然后將含有細胞勻漿的溶液于37 ℃孵育5 min。再向其中加入ATP使其終濃度達到4 mmol/L以起始反應。3 min后，每隔 20 s測定溶液340 nm處吸光度值，擬合曲線后計算斜率差，以消光系數(shù)ε=6.22 (mmol/L·cm)–1計算酶活。酶活單位定義為每分鐘1 g組織勻漿水解的ATP的物質(zhì)的量 (μmol/(min·g))。

2 結果與分析

2.1 重組供體質(zhì)粒的構建

為了利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達家蠶Serca，我們首先克隆了和的DNA片段，經(jīng)過測序驗證正確后，將其依次克隆到pFastBac Dual載體上。雙酶切結果表明，和成功連接到了供體質(zhì)粒上 (圖2)。說明我們成功獲得了含有兩個表達框[P--HSVtk]和[P--sv40]的重組供體質(zhì)粒。

2.2 重組Bacmid的獲得

將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細胞后，在輔助質(zhì)粒表達的轉(zhuǎn)座酶的作用下，含有目的基因的片段通過轉(zhuǎn)座作用插入家蠶Bacmid中。通過藍白斑篩選與菌液PCR鑒定，我們成功獲得了含有目的片段的重組Bacmid。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切檢測

2.3 用于表達的重組病毒的獲取

利用含有目的片段的Bacmid轉(zhuǎn)染細胞后，獲得了P1代重組病毒，通過重復感染，擴增出P3代病毒。通過測定P3代病毒的滴度為1.2×108。

2.4 感染后細胞的熒光顯微觀察

通過滴度計算所需的病毒量，將其感染細胞后，每隔24 h對細胞進行熒光顯微觀察，結果如圖3所示。在感染后24 h，熒光觀察視野下，只有很少的細胞發(fā)出綠色熒光，表明此時只有少量細胞開始表達EGFP。隨著感染時間的延長，大量細胞開始發(fā)出綠色熒光。在感染后48 h，約50%的細胞發(fā)出綠色熒光。感染后72 h，表達EGFP的細胞達到約80%。而在感染后96 h和120 h，由于病毒的大量繁殖導致細胞狀態(tài)異常甚至死亡，很多細胞不能貼壁，漂浮在培養(yǎng)基中。這些結果表明，EGFP在感染后的細胞中成功表達，并在感染后72?120 h表達量較大。

2.5 Serca蛋白的表達和檢測

用于表達Serca的啟動子和用于表達EGFP的啟動子均為晚期啟動子，為此，通過熒光觀察，不僅可以判斷病毒感染細胞的全過程，也可以從側(cè)面監(jiān)測重組蛋白的表達情況。因此，我們猜測Serca在細胞中的表達模式可能與EGFP相似。

將野生型病毒感染的細胞及重組病毒感染后24 h、48 h、72 h、96 h和120h的細胞通過離心的方法收集，充分裂解后離心提取上清。首先將蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)感染后的細胞總蛋白與未感染的細胞總蛋白模式上并無太大差異 (圖4)。由于細胞內(nèi)蛋白比較豐富，目的蛋白的表達量較低，因此從膠塊上并不能明顯地看出EGFP和Serca的表達。

圖3 細胞感染后的熒光觀察圖

在我們前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，BmNs-SWU1細胞中含有本底表達的Serca，若直接用Serca的抗體進行Western botting檢測，重組Serca的表達情況不夠明確，故在設計引物時，我們在片段的5′端添加了6×His-tag標簽，因此，可以利用His抗體對目的蛋白進行檢測。Western blotting結果顯示，感染后48 h、72 h、96 h和120 h的細胞總蛋白中在約110 kDa處均檢測到了明顯的單一條帶 (圖4)，分子量大小與預測的Serca的大小相一致，說明家蠶Serca在感染后的細胞中成功地得到了表達。

利用β-Actin蛋白作為內(nèi)參蛋白，我們可以對不同時期表達的Serca蛋白進行粗略的定量分析。通過灰度比較，發(fā)現(xiàn)家蠶Serca在感染后48 h之前開始表達，并且隨著感染時間的延長，其表達量逐漸增加，在96 h的表達量最大。這一表達模式與EGFP的表達模式相似。另外，在感染后120 h的細胞中，重組Serca的含量卻開始下降，這可能與細胞在感染的后期裂解死亡相關。以上的結果說明，我們利用這一雙元表達系統(tǒng)成功地表達了家蠶Serca蛋白。

圖4 重組蛋白的表達檢測

2.6 重組蛋白的酶活分析

參考Saborido等[12]的方法，我們首先利用小鼠肌肉組織勻漿作為陽性對照 (CT)，建立酶活測定體系。對小鼠肌肉勻漿進行酶活分析后，測得其Serca酶活為40.26 μmol/(min·g) (圖5)，所得數(shù)值與Saborido等測得的酶活相似[12]，說明本酶活測定體系可以為后續(xù)研究所使用。

利用這一酶活測定體系，我們對感染后不同時期的細胞進行了裂解，抽提總蛋白并測定其Serca酶活，以野生型病毒感染的細胞作為陰性對照 (WT)。酶活測定結果如圖5所示，感染后24 h細胞內(nèi)酶活與陰性對照相比，酶活差異不大，為0.04 μmol/(min·g)。感染后48 h，由于細胞開始表達Serca重組蛋白，細胞的酶活顯著提高。隨著感染時間的延長，細胞內(nèi)重組蛋白增多，Serca的酶活也增大，到感染后96 h，細胞內(nèi)的Serca酶活達到最大，為0.33 μmol/(min·g)，從另一方面說明此時細胞內(nèi)重組蛋白的表達量最高。而在感染后120 h，細胞內(nèi)Serca的酶活開始下降，這可能是由于感染后120 h細胞中重組蛋白量減少導致的。這一結果表明，我們利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)成功地表達了具有生物學活性的重組Serca蛋白，并且在感染后96 h，表達的重組蛋白量最大，酶活最高。

圖5 重組蛋白的酶活分析

3 討論

作為一種高效表達外源蛋白的真核生物表達系統(tǒng)，桿狀病毒表達系統(tǒng)可以在不用篩選的情況下短時間內(nèi)獲得100%純度的重組病毒，通過病毒感染昆蟲細胞系或者昆蟲幼蟲從而快速獲得大量的基因表達產(chǎn)物[11]，目前已經(jīng)利用此系統(tǒng)成功地表達了上千種功能蛋白[13-15]。

桿狀病毒表達系統(tǒng)的另外一個優(yōu)勢在于可以容納表達較大及結構較為復雜的外源蛋白。利用多元表達載體還可同時表達兩個或者多個外源基因。因此，桿狀病毒表達系統(tǒng)成為了細胞內(nèi)研究P型ATP酶功能的首選系統(tǒng)。近年，研究者利用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了具有生物學活性的鈉鉀ATP酶各亞單位，并對其αβ復合體的結構、功能、裝配、運輸及亞單位進行了功能研究[16-18]。另外，2002年，有研究者利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對P型ATP酶家族的另一成員人類銅轉(zhuǎn)運ATP酶進行了表達及功能特征進行了很好的研究，結果證實了哺乳動物銅轉(zhuǎn)運ATP酶具有P型ATP酶家族成員的催化活性[19]。以上結果均說明桿狀病毒表達系統(tǒng)十分適宜表達分子量較大，具有多次跨膜結構的復雜蛋白。Serca與鈉鉀ATP酶同屬于P型ATP酶，為此，本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)對家蠶進行了表達，獲得了具有生物學活性的重組蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，在細胞感染后48 h，重組蛋白開始表達，在感染后96 h表達量最大。而進一步，在細胞感染后120 h，重組蛋白的含量卻降低了，推測這可能與細胞在感染的后期裂解死亡相關。在NPV感染細胞的極晚期，NPV病毒會利用細胞表達組織蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等一系列的酶使細胞裂解[20]。在本實驗中，可能由于感染后120 h細胞裂解，重組蛋白被釋放到培養(yǎng)基中并快速被各種蛋白酶降解，從而導致在此時期重組蛋白的含量降低。另外，本研究中目的蛋白在此系統(tǒng)中的表達水平較低，只能采用Western blotting才能檢測到目的蛋白，其可能原因在于，首先Serca作為10次跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的復雜蛋白，可能使得細胞表達時重組蛋白的折疊受到壓力，導致表達量較低。其次，本研究未有對感染條件進行摸索，而是直接采用感染復數(shù)MOI為10的病毒感染細胞。2011年有研究者對PRG-1蛋白在家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達進行摸索后發(fā)現(xiàn)，利用不同感染復數(shù)的重組感染細胞后，重組蛋白的表達量差異較大[21]。因此，若要獲得表達量較大的重組蛋白可能還需要對感染的條件進行摸索。

2014年，李國輝等[22]創(chuàng)建了可視化的家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)，利用啟動子控制基因表達，成功地利用EGFP作為標簽，進而可以迅速判定病毒粒子的產(chǎn)生情況。本研究采用類似的方法，利用雙元表達載體，引入基因作為標記基因，成功地構建了同時表達EGFP和Serca的重組病毒。本雙元載體采用的啟動子分別為和多角體基因 () 啟動子，均為BmNPV來源的晚期啟動子[20,23]。P10蛋白比多角體蛋白的表達早幾個小時[24]。由于所使用的啟動子均在病毒感染的同一時期表達，因此本研究中也可以通過觀察啟動子驅(qū)動的的表達情況來判斷病毒繁殖的情況。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，在感染后的細胞中，EGFP和Serca的表達模式一致，因此本研究構建的雙元桿狀病毒表達系統(tǒng)還可利用EGFP的表達來監(jiān)測目的蛋白的表達情況。

本研究成功構建了含有兩個表達框[P--HSVtk]和[P--sv40]的重組供體質(zhì)粒，利用此雙元表達載體在家蠶BmN-SWU1細胞系中成功地表達了具有生物學活性的家蠶肌質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶Serca。同時，本研究對重組Serca蛋白的酶活性進行了初步分析，這對于進一步研究Serca的具體功能奠定了堅實的基礎，也對桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)化和應用研究具有十分重要的意義。

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(本文責編 陳宏宇)

Expression of sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase fromby baculovirus expression system

Xin Wang, Yi Li, Huifang Chen, Xiaoying Zhou, Kang Xie, and Ping Zhao

State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (Serca) is responsible for transporting Ca2+into the endoplasmic reticulum and maintaining a suitable calcium environment in cells. The suitable calcium environment created by BmSerca is vital for the growth and development of silkworm. With a large molecular weight and 10 transmembrane domains, Serca is very difficult to express inexpression system. In order to obtain recombinant Serca with biological activity, pFastBac Dual vector was used to construct a binary baculovirus expression vector for expressingandin cells. After transfection and infection, EGFP and Serca were expressed successfully in BmN-SWU1 cell line. Fluorescent observation revealed that the expression patterns of EGFP and Serca in infected cells were the same. Western blotting analysis showed that the recombinant proteins were about to express in cells 48 h post infection and highly expressed 96 h post infection. Ca2+-ATPase activities assays were used to evaluate the enzyme activities of recombinant Serca and found that the enzyme activities increased significantly after infection. The obtained data showed that this binary baculovirus expression system can be successfully used to express Serca with biological activity. The expression of Serca protein with this system is useful for further research on the function of Serca.

silkworm, baculovirus, gene expression, binary expression system, sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, enzyme activity

June 26, 2014; Accepted:August 15, 2014

Ping Zhao. Tel: +86-23-68250885; E-mail: zhaop@swu.edu.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA100306), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31201853, 31172157).

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2011AA100306)，國家自然科學基金(Nos. 31201853, 31172157) 資助。

2014-09-23

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140347.html