牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰蓋鬼傘中的組合表達(dá)

尤琳烽，楊海星，林俊芳,2，柳永，葉志偉，郭麗瓊,2，辛燕花

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牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰蓋鬼傘中的組合表達(dá)

尤琳烽1，楊海星1，林俊芳1,2，柳永3，葉志偉1，郭麗瓊1,2，辛燕花1

1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州 510640 3 浙江省農(nóng)科院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021

尤琳烽, 楊海星, 林俊芳, 等. 牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰蓋鬼傘中的組合表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 375–383.You LF, Yang HX, Lin JF, et al. Combinational expression of geranylgeranyl diphosphate synthase and taxadiene synthase in Coprinopsis cinerea. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 375–383.

紫杉二烯是紫杉醇合成途徑中的前體物質(zhì)。紫杉醇是紅豆杉的一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種重要的新型抗癌藥物。然而，紫杉醇在植物中含量低且難提取，限制了高效應(yīng)用。利用基因工程手段，借助擔(dān)子菌類(lèi)真菌灰蓋鬼傘具有的內(nèi)源類(lèi)異戊二烯合成途徑，構(gòu)建含有牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP) 合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表達(dá)載體pBgGGTS和獨(dú)立表達(dá)盒表達(dá)載體pBgGGgTS，并分別轉(zhuǎn)入灰蓋鬼傘LT2菌株中，經(jīng)過(guò)選擇性篩選、PCR鑒定、Southern blotting雜交驗(yàn)證，分別獲得了5株融合表達(dá)的灰蓋鬼傘工程菌和5株獨(dú)立表達(dá)盒的灰蓋鬼傘工程菌株。各隨機(jī)挑選了1株工程菌株，分別提取菌絲體和發(fā)酵液分析。GC-MS分析表明，兩種工程菌株與原出發(fā)菌株的菌絲提取物無(wú)明顯差異峰，而與出發(fā)菌株的發(fā)酵液提取物相比，兩種轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘的發(fā)酵液中均出現(xiàn)了明顯的差異峰，采用GC-MS特征質(zhì)量離子分析方法判定為紫杉二烯，分別為44 ng/L (轉(zhuǎn)化pBgGGgTS) 和30 ng/L (轉(zhuǎn)化pBgGGTS)。結(jié)果表明，通過(guò)在灰蓋鬼傘融合基因或各自獨(dú)立表達(dá)的形式共表達(dá)和基因，可以生物合成紫杉二烯。

灰蓋鬼傘，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶，紫杉二烯合酶，紫杉二烯，組合生物合成

紫杉醇是紅豆杉spp. 產(chǎn)生的一種具有顯著抗癌功效的二萜類(lèi)生物堿，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌等治療中。但紫杉醇的自然來(lái)源匱乏，對(duì)其應(yīng)用和研究造成了嚴(yán)重的影響。目前，紫杉醇的來(lái)源主要依靠化學(xué)半合成和植物細(xì)胞培養(yǎng)。二者均存在產(chǎn)量低、產(chǎn)率不穩(wěn)定的問(wèn)題。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紫杉醇的生物合成也成為了關(guān)注的熱點(diǎn)。

至今，紫杉醇生物合成途徑大部分得到解析，編碼參與合成酶的基因得到解析[1]。其中，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP) 是所有二萜類(lèi)化合物的共同前體，它的生物合成是由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS) 催化，將15碳的法尼基焦磷酸(FPP) 和5碳的異戊烯基焦磷酸(IPP) 縮合生成20碳的GGPP。紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS) 定位于質(zhì)體，催化GGPP環(huán)化成紫杉烷類(lèi)化合物獨(dú)特的骨架結(jié)構(gòu)紫杉二烯(Taxa-4(5),11(12)-diene)，這一步反應(yīng)是紫杉醇生物合成途徑中的限速步驟。

隨著紫杉醇生物合成過(guò)程逐步明確，研究者嘗試在不同的生物體系里組合表達(dá)紫杉醇生物合成過(guò)程[2-3]。比較典型的是在大腸桿菌里構(gòu)建了紫杉醇生物合成途徑前幾步，通過(guò)多元模塊化代謝途徑，過(guò)量表達(dá)限速基因和抑制副產(chǎn)物途徑的手段，Ajikumar等[4]創(chuàng)造性地在分批式發(fā)酵罐中得到1.02 g/L的紫杉二烯。但由于大腸桿菌在組合表達(dá)較多基因時(shí)存在能量代謝障礙、表達(dá)質(zhì)粒缺乏足夠的兼容性、沒(méi)有完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、大量異源基因的表達(dá)和中間代謝產(chǎn)物均對(duì)細(xì)胞有毒害作用等問(wèn)題，使其應(yīng)用受到局限[5]。

以高等的真核生物作為合成萜類(lèi)物質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)逐漸得到研究者的重視[5-6]。釀酒酵母具有內(nèi)源類(lèi)異戊二烯代謝途徑，可為萜類(lèi)生物合成提供豐富的前體物質(zhì)。通過(guò)對(duì)其上下游途徑的多個(gè)基因表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化和對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，實(shí)現(xiàn)了紫杉醇前體物質(zhì)的組合生物合成[5,7-8]。也有不少研究者選擇進(jìn)化地位上更有優(yōu)勢(shì)的藻類(lèi)[9]、擬南芥[10]、煙草[11]、番茄[12]、人參[13]等表達(dá)紫杉醇合酶基因。因?yàn)樗鼈兙哂写竽c桿菌和釀酒酵母一樣的基因操作的簡(jiǎn)便性，和哺乳細(xì)胞一樣對(duì)產(chǎn)物的更復(fù)雜的折疊和翻譯后修飾。更重要的是，它們本身含有的合成次生代謝產(chǎn)物的酶系更加發(fā)達(dá)，擁有豐富的萜類(lèi)物質(zhì)，如類(lèi)胡蘿卜素、赤霉素、質(zhì)體醌和多種維生素，為生產(chǎn)更多紫杉醇及其中間產(chǎn)物提供了較為完善的代謝池。

灰蓋鬼傘是擔(dān)子菌類(lèi)的模式真菌，它在兩周的生活史內(nèi)任何一個(gè)時(shí)期都能被突變和遺傳轉(zhuǎn)化，常被用在真菌多細(xì)胞發(fā)育的研究[14-15]。另外，灰蓋鬼傘遺傳操作較簡(jiǎn)便，本實(shí)驗(yàn)室也將其用于表達(dá)功能蛋白[16-17]。灰蓋鬼傘的全基因組得到測(cè)序并注解，遺傳背景清晰，并分離得到了大量的細(xì)胞色素P450氧化還原酶，這些酶往往參與了萜類(lèi)物質(zhì)生物合成。其中，灰蓋鬼傘的幾種倍半萜合成酶，能催化FPP生成相應(yīng)的倍半萜[18]。而且，從灰蓋鬼傘中分離得到了多種具有生物活性的倍半萜及其衍生物[19-20]。這些都表明灰蓋鬼傘具有紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因中的組合表達(dá)的萜類(lèi)代謝池。

灰蓋鬼傘能夠通過(guò)內(nèi)源類(lèi)異戊二烯合成途徑合成GGPP，但是水平較低，限制了紫杉二烯的合成量，因此提高細(xì)胞內(nèi)GGPP供給是增加紫杉二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵。本研究在已經(jīng)成功表達(dá)來(lái)源于短葉紅豆杉的紫杉二烯合酶基因的基礎(chǔ)上[21-22]，采用不同的組合表達(dá)策略，進(jìn)一步調(diào)控灰蓋鬼傘類(lèi)異戊二烯生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因() 和紫杉二烯合酶基因() 的組合表達(dá)，得到了目標(biāo)產(chǎn)物紫杉二烯，為紫杉醇的生物合成提供了新的嘗試途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型灰蓋鬼傘LT2和營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)質(zhì)粒pCc1001，由英國(guó)牛津大學(xué)Casselton LA教授贈(zèng)送，本實(shí)驗(yàn)室保存。雙基因表達(dá)載體pBgGGTS和pBgGGgTS，均含有香菇小片段啟動(dòng)子和潮霉素抗性基因()，分別設(shè)置牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(，GenBank登錄號(hào)JQ029687) 和紫杉二烯合酶基因(，GenBank登錄號(hào)U48796，美國(guó)華盛頓州立大學(xué)Rodney Croteau教授贈(zèng)送) 以融合蛋白和獨(dú)立表達(dá)盒兩種形式，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，表達(dá)質(zhì)粒圖譜如圖1。其中，在pBgGGgTS中，和是分別以獨(dú)立表達(dá)盒存在，而pBgGGTS中則構(gòu)建了和的雙基因融合表達(dá)盒。

1.2 試劑

T載體和T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Ex聚合酶、RⅠ，d Ⅲ和Ⅰ等限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR引物和Southern blotting雜交探針合成及序列測(cè)定由上海捷瑞生物工程有限公司完成；雜交試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所；正十九烷購(gòu)自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化

將上述兩種含有紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的重組質(zhì)粒分別和含有色氨酸恢復(fù)基因的輔助質(zhì)粒pCc1001，利用PEG介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株LT2，菌株通過(guò)溶壁酶酶解去壁制備原生質(zhì)體，重組質(zhì)粒在PEG介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCc1001后的缺陷型菌株能夠在無(wú)色氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷性固體平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

1.4 PCR和Southern blotting雜交鑒定

提取灰蓋鬼傘原種及兩種擬轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，分別以?xún)蓪?duì)特異引物對(duì)GGPPSJDF/ GGPPSJDR、TSJDF/TSJDR進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定(表1)。

Southern雜交鑒定采用地高辛熒光標(biāo)記法，探針的引物同樣采用上述兩對(duì)引物，以篩選出真實(shí)的陽(yáng)性灰蓋鬼傘工程菌株。

1.5 轉(zhuǎn)基因菌株的產(chǎn)物鑒定

根據(jù)報(bào)道對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提取和檢測(cè)[4,23]。收集培養(yǎng)好的菌絲并冷凍干燥，液氮研磨后加入10 mL正己烷，室溫振蕩20 min，5 000 r/min離心1 min，取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入1 mL正己烷溶解。發(fā)酵液過(guò)濾去除菌絲后冷凍干燥，再參照菌絲體的處理方式添加正己烷萃取并溶解。上機(jī)前均用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒

表1 本研究所用的引物

產(chǎn)物檢測(cè)采用Agilent 7890/5975C-GC/MSD，色譜柱：DB-1ms (30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。載氣：氦氣，流速1 mL/min；電離模式：EI，能量70 eV；離子源溫度250 ℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM) 模式。升溫程序按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[21]，進(jìn)樣溫度250 ℃，初始溫度100 ℃，保留1 min，每分鐘升高8 ℃，加熱到300 ℃，保留2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 灰蓋鬼傘的遺傳轉(zhuǎn)化

收集培養(yǎng)一周的粉孢子，30 ℃酶解得到原生質(zhì)體。利用PEG介導(dǎo)的方法，將色氨酸營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)型質(zhì)粒pCc1001分別與構(gòu)建的表達(dá)載體pBgGGTS、pBgGGgTS共轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘原生質(zhì)體，經(jīng)過(guò)不含色氨酸的再生培養(yǎng)基得到擬轉(zhuǎn)化子(圖2)。

2.2 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

隨機(jī)挑取兩種載體轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘獲得的潛在轉(zhuǎn)化子各13個(gè)，并分別轉(zhuǎn)接至最小培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。以小量法提取的菌絲基因組DNA為模板，分別以特異引物對(duì)GGPPSJDF/ GGPPSJDR和TSJDF/TSJDR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(帶有基因和基因的質(zhì)粒為模板) 和陰性對(duì)照(灰蓋鬼傘原種LT2基因組DNA為模板)。

結(jié)果如圖3所示。轉(zhuǎn)化pBgGGTS質(zhì)粒的5株工程菌株(2、3、4、10和11號(hào))，同時(shí)整合了和兩個(gè)基因；以pBgGGgTS質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得6株工程菌株(2、3、6、8、11、12和13號(hào))。在挑取的26個(gè)兩種潛在轉(zhuǎn)化子中，同時(shí)整合、和基因的共轉(zhuǎn)化率分別為38%和53%。

圖2 灰蓋鬼傘擬轉(zhuǎn)化子在再生培養(yǎng)基平板上的生長(zhǎng)情況

圖3 灰蓋鬼傘兩種擬轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 灰蓋鬼傘轉(zhuǎn)化子的Southern blotting雜交

2.3 轉(zhuǎn)化子的Southern blotting雜交鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果，提取整合pBgGGTS質(zhì)粒的5個(gè)轉(zhuǎn)化子和整合pBgGGgTS質(zhì)粒的5個(gè)轉(zhuǎn)化子，以及灰蓋鬼傘原種共11株的基因組DNA進(jìn)行Southern blotting雜交分析。通過(guò)酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜、分別與地高辛標(biāo)記的目的基因和探針雜交，雜交膜中出現(xiàn)明顯信號(hào)條帶 (圖4)，表明和分別整合到這些轉(zhuǎn)化子的基因組上，該結(jié)果與PCR鑒定一致，進(jìn)一步證明兩種策略下的目標(biāo)基因均已經(jīng)穩(wěn)定整合進(jìn)轉(zhuǎn)化子染色體上。

2.4 轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘的GC-MS分析

分別對(duì)轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌絲體和發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物經(jīng)過(guò)提取進(jìn)行GC-MS分析。分別轉(zhuǎn)化pBgGGTS和pBgGGgTS的兩種工程菌株與出發(fā)菌株相比，菌絲體提取物沒(méi)有明顯差異峰(圖未展示)。但與未轉(zhuǎn)化的灰蓋鬼傘發(fā)酵液相比，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌株的發(fā)酵液提取的化合物中，在保留時(shí)間16.762 min處，均出現(xiàn)了差異峰(圖5)，它的分子離子峰和基峰與紫杉二烯的標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致[23]；紫杉二烯的分子離子峰和基峰分別為/272 [M+]和/122(C9H44)，特征碎片離子峰為/107[122-15(CH3)]，121，123[C環(huán)片段] (圖6)。以正十九烷為內(nèi)標(biāo)，轉(zhuǎn)化pBgGGgTS和pBgGGTS的工程菌株紫杉二烯的含量分別為44 ng/L和30 ng/L。就紫杉二烯的產(chǎn)量而言，和基因以獨(dú)立表達(dá)盒形式略高于融合基因形式。

圖5 GC-MS分析灰蓋鬼傘對(duì)照菌株和工程菌株

圖6 新產(chǎn)生的峰裂解碎片離子圖

3 討論

灰蓋鬼傘的全基因組分析表明擁有豐富的內(nèi)源萜類(lèi)合成途徑，具有生物合成紫杉二烯的潛力。本研究在灰蓋鬼傘中引入紫杉醇生物合成的前兩個(gè)關(guān)鍵酶基因，即和，不論采用融合還是各自獨(dú)立表達(dá)，均都能耦合反應(yīng)，生成紫杉二烯。兩種策略下得到的轉(zhuǎn)基因工程菌株，Southern blotting雜交鑒定表明，兩個(gè)外源基因均能穩(wěn)定地整合到基因組上。GC-MS分析表明，兩種工程菌株與出發(fā)菌株的菌絲提取物對(duì)照并無(wú)差異峰。兩種工程菌株的發(fā)酵液與對(duì)照相比，出現(xiàn)了紫杉二烯的差異峰。和獨(dú)立表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的紫杉二烯為44 ng/L，略高于以融合基因表達(dá)的30 ng/L。這表明，灰蓋鬼傘具備組合生物合成紫杉二烯的能力，并可以進(jìn)一步研究以提高產(chǎn)量。

以紫杉二烯的產(chǎn)量而言，灰蓋鬼傘相比大腸桿菌(1.02 g/L)[4]和小立碗蘚(0.05%鮮重)[9]都較低，和擬南芥(~24.64 ng/g DW)[10]、人參(5.9 μg/g DW)[13]等相差不大。一方面，相對(duì)單個(gè)基因操作，灰蓋鬼傘更適合多個(gè)基因協(xié)同表達(dá)調(diào)控，尤其是基于代謝網(wǎng)絡(luò)的模塊化和全局調(diào)控，可以極大地提高紫杉二烯的產(chǎn)量。另外，一些反向遺傳學(xué)技術(shù)如RNAi和基因敲除等技術(shù)已經(jīng)在灰蓋鬼傘中有了初步應(yīng)用，可以通過(guò)抑制或敲除掉其代謝途徑中與紫杉二烯合成競(jìng)爭(zhēng)底物的旁路基因來(lái)提高紫杉二烯的表達(dá)量。

以合成生物學(xué)的視角來(lái)看，灰蓋鬼傘本身具有豐富的萜類(lèi)代謝池、精細(xì)的調(diào)控機(jī)制和復(fù)雜的細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，可極大地拓展元件庫(kù)和模塊庫(kù)。相比其他平臺(tái)生物，還需要進(jìn)一步研究以提高紫杉二烯的產(chǎn)量。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Combinational expression of geranylgeranyl diphosphate synthase and taxadiene synthase in

Linfeng You1, Haixing Yang1, Junfang Lin1, 2, Yong Liu3, Zhiwei Ye1, 2, Liqiong Guo1, 2, and Yanhua Xin1

1,,510640,,2,,510640,,3,,310021,,

Taxa-4(5),11(12)-diene is the precursor for paclitaxel biosynthesis. The diterpenoid paclitaxel (marketed as Taxol), a plant secondary metabolite isolated from yew, is an effective drug widely used in the treatment of numerous cancers. However, further application of taxol has been restricted due to its low yield in plants and the difficulties in extraction. To increase the intact isoprene flux, we constructed the fusion gene plasmid pBgGGTS and individual cassette plasmid pBgGGgTS to enhance the expression levels of geranylgeranyl diphosphate synthase gene () and a taxadiene synthase gene () in. These two plasmids were separately transformed into.LT2 strain, resulting in several putative transformants. Putative transformants were determined by PCR technique, indicating that 5 out of 13 putative transformants transformed by pBgGGTS and 6 out of 13 putative transformants transformed by pBgGGgTS, respectively. Additionally, the Southern blotting analysis of these 10 transformants confirmed that bothandgene were stably integrated into the genome of.. Crude extracts from each of the transformants were analyzed. There is no difference in the mycelium extracts among the wild-type LT2 and two types of transformants. However, analysis of culture filtrates indicated that an additional GC peak was found at the retention time of 16.762 min which was absent in the wild type control. The mass fragmentation pattern of this peak had the same diagnostic ions with taxa-4(5),11(12)-diene. According to peak area, the amounts of taxa-4(5),11(12)-diene in each fermented broth were 44 ng/L (transformed with pBgGGgTS) and 30 ng/L (transformed with pBgGGTS), respectively. In conclusion, co-expression of theandgene could increase the taxadiene production in..

, geranylgeranyl diphosphate synthase, taxadiene synthase, taxa-4(5),11(12)-diene, combinatorial biosynthesis

July 9, 2014; Accepted: October 11, 2014

Liqiong Guo. Tel: +86-20-85285382; Fax: +86-20-85280270; E-mail: guolq@scau.edu.cn

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