一種新型改良硫氧還蛋白融合表達體系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表達

魯一靈，高久香，喬雪，王義鵬，于海寧

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一種新型改良硫氧還蛋白融合表達體系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表達

魯一靈1，高久香1，喬雪1，王義鵬2，于海寧1

1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116024 2 蘇州大學藥學院，江蘇蘇州 215123

魯一靈, 高久香, 喬雪, 等. 一種新型改良硫氧還蛋白融合表達體系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表達. 生物工程學報, 2015, 31(3): 403–410.Lu YL,Gao JX, Qiao X, et al. Construction of novel thioredoxin fusion protein expression system and the production of recombinant Lf-CATH2. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 403–410.

通過改良硫氧還蛋白融合表達體系，原核表達cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位點，并去除pET32α載體的凝血酶序列和S標簽序列，構建優(yōu)化的Lf-CATH2-pET32α-TS載體，于大腸桿菌中表達。產物融合蛋白經凝血酶切割釋放Lf-CATH2，純化后進行抗菌活性檢測。結果表明改良的硫氧還蛋白融合表達體系顯著提高酶切效率達37%，Lf-CATH2在新體系中獲得了可溶性高表達，且保留了抗菌活性。因此該新型硫氧還蛋白融合表達體系，有望為cathelicidin家族及其他陽離子活性肽提供更好的原核表達載體工具。

cathelicidin，Lf-CATH2，硫氧還蛋白融合表達，凝血酶切割

Cathelicidins是一類由生物體基因組編碼的，包括人類在內的大多數脊椎動物所特有的宿主防御肽，由N端信號肽區(qū)域、中間保守cathelin結構域和C端高度特異的成熟肽區(qū)域構成，在動物先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要作 用[1-3]。除了廣譜抗菌活性，cathelicidins還具有其他重要生物學功能，如趨化多種免疫細胞、誘導肥大細胞脫顆粒和組胺釋放、調節(jié)巨噬細胞轉錄、促進傷口愈合、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等[4-7]。Cathelicidins不僅對普通革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌以及病毒具有非常強的抗性，而且對許多臨床耐藥菌株同樣具有作用[8-9]。Cathelicidins由于其特殊的殺菌機理，不易產生耐藥性，且結構簡單，沒有二硫鍵，相比其他家族抗菌肽溶血性和細胞毒性小，因此極具開發(fā)潛力[10-13]。

在前期工作中，從兩棲類的脆皮大頭蛙體內克隆到兩條新型cathelicidin序列，成熟肽分別是Lf-CATH1和Lf-CATH2?；瘜W合成的Lf-CATH2對G+菌、G-菌以及真菌具有很好的廣譜抗菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌，其MIC僅為8.3 μg/mL[14]。為進一步探討Lf-CATH2用于抗感染治療的可行性，構建了新型改良的硫氧還蛋白融合表達系統(tǒng)，提高了酶切效率，實現了在大腸桿菌細胞裂解上清液中高效表達Lf-CATH2。通過鎳柱親和層析純化融合蛋白；使用凝血酶切割釋放Lf-CATH2，對純化后的可溶性Lf-CATH2進行生物學活性鑒定，為以后大量生產及臨床應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞與質粒

表達質粒pET-32α、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3)菌株為本實驗室保存。

1.1.2 引物

引物 (表1) 合成和測序均由生工生物工程(上海) 有限公司完成。

1.1.3 試劑

DNA限制性內切酶 (Ⅰ、RⅠ、Ⅰ、Ⅱ)、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶和DNA marker購自寶生物工程(大連) 有限公司；Protein marker購自全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒、質粒回收試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 購自Merck Serono China公司；小牛凝血酶購自美國Sigma公司；Tris、甘氨酸和聚丙烯酰胺購自Amresco公司；HisTrapTMFF鎳柱購自GE Healthcare公司；其他常用生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 克隆含有凝血酶序列的基因

以基因為模板，使用引物1和2，對Lf-CATH2編碼基因進行PCR擴增。引物1、2分別包含Ⅰ酶切位點和凝血酶位點序列，以及RⅠ酶切位點。PCR反應體系：10×PCR 緩沖液(Mg2+Plus) 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，引物1和2 (20 μmol/L) 各1 μL，模板DNA 1 μL，DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共28個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應結束后，產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的基因，連接T載體轉化測序驗證。

表1 用于Lf-CATH2基因擴增和載體修飾的引物序列

The italic and bold sequence is thrombin site; the underlined sequences are restriction sites, with the name under the sequence; the lowercase sequences are part of-.

1.2.2 Lf-CATH2-pET32α-TS融合表達載體的構建

如圖1所示，使用引物3、4以載體pET32α為模板進行PCR擴增，得到從Ⅰ到Ⅱ，去除了凝血酶和S標簽的pET32α載體小片段，再以Ⅰ和Ⅱ對pET32α雙酶切得到載體大片段。將得到的大小片段分別雙酶切后連接，轉化大腸桿菌DH5α，選取目的陽性克隆測序確定無誤。以Ⅰ和RⅠ酶分別雙酶切上述載體及引物1和2克隆產物，回收、連接、轉化入大腸桿菌DH5α，進行菌落PCR，選取目的陽性克隆，氨芐青霉素半固體LB培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)送樣測序。由此，表達的融合蛋白將僅含有一個凝血酶切割位點。

1.2.3 Lf-CATH2-pET32α-TS融合蛋白的誘導表達與鑒定

將含有重組質粒Lf-CATH2-pET32α-TS的單菌落接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數期，以1∶100接種于相同培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數期，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，誘導4 h，4 ℃離心(5 000 r/min)10 min收集菌體。菌體沉淀(~4.5 g) 溶解于30 mL磷酸鹽緩沖液 (0.1 mol/L，pH 7.4) 中，冰浴超聲破碎30 min，破碎條件為：400 W，破碎5 s，間隔5 s。待菌液由渾濁變清澈透亮時，將懸浮液于4 ℃， 14 000 r/min離心30 min，分別收集上清及沉淀，加1×SDS上樣緩沖溶液混勻，煮沸，離心取上清進行SDS-PAGE檢測融合蛋白表達情況，確定融合蛋白在細胞中的表達部位。

圖1 重組優(yōu)化載體改造圖

1.2.4 Lf-CATH2-pET32α-TS融合蛋白的分離純化

收集1 L經IPTG誘導后的菌液離心，PBS洗滌，重懸，冰浴超聲破碎，離心收集上清溶液，0.22 μm濾膜過濾后加入平衡好的?KTA HPLC System上的HisTrapTMFF鎳柱，流速1 mL/min。用含60 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗脫雜蛋白 (1 mL/min)，至280基線穩(wěn)定后，用含300 mmol/L咪唑的緩沖溶液對融合蛋白進行洗脫、收集。采用Bradford檢測法測定融合蛋白濃度，根據標準曲線，計算1 L菌液中融合蛋白的含量。

1.2.5 Lf-CATH2的釋放和純化

以Tris緩沖液 (pH 8.0)溶解凝血酶，25 ℃切割18 h后，進行SDS-PAGE電泳鑒定。用C18柱 (Hypersil BDS C18, 30×0.46 cm) RP-HPLC純化。以均含有1%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 的去離子水和乙腈，作為流動相線性梯度洗脫 (1 mL/min)，214 nm檢測吸收峰。收集目的蛋白，使用Bradford檢測法測定目的蛋白濃度，保存于?20 ℃中，供活性測定使用。

2 結果

2.1 重組優(yōu)化載體Lf-CATH2-pET32α-TS的構建

測序結果顯示成功構建了去除凝血酶和組氨酸標簽的優(yōu)化載體pET32α-TS。使用引物1、2擴增含有凝血酶和酶切位點的(171 bp)目的基因。將目的基因片段和優(yōu)化載體經Ⅰ和RⅠ雙酶切后連接，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆進行菌落PCR。分別使用引物1、2和3、4進行菌落PCR鑒定，條帶大小與理論值171 bp (圖2，泳道1)、432 bp (不含有凝血酶和組氨酸標簽，圖2，泳道2)吻合。同時篩選陽性克隆菌測序，結果表明重組優(yōu)化載體Lf-CATH2-pET32α-TS被正確構建。

圖2 重組優(yōu)化載體菌落PCR電泳圖

2.2 融合蛋白表達鑒定

SDS-PAGE表明含有Lf-CATH2-pET32α-TS的工程菌經過IPTG誘導后，表達產物在20 kDa附近出現了一條明顯的新條帶，與理論相對分子質量19.3 kDa相符(圖3，泳道2)，未經誘導表達的工程菌，無明顯條帶(圖3，泳道1)。相同條件下誘導未優(yōu)化載體菌Lf-CATH2-pET32α (圖3，泳道3) 和優(yōu)化載體菌Lf-CATH2- pET32α-TS(圖3，泳道4)。前者理論表達蛋白約22kDa，灰度掃描軟件分析顯示其表達量僅約占菌體總蛋白的21.4%，而優(yōu)化載體Lf-CATH2- pET32α-TS表達量約占菌體總蛋白的46.2%，為未優(yōu)化載體的2倍以上，表明含有優(yōu)化質粒的工程菌為高效工程菌。

圖3 不同條件下菌體全蛋白的表達情況

2.3 融合蛋白的純化

收集菌體，破碎離心后分別取細胞裂解上清 (圖4，泳道2)、沉淀 (圖4，泳道3) 進行電泳檢測，顯示融合蛋白大多為可溶性表達(圖4)。1 L含pET32α-Lf-CATH2-TS重組質粒的菌液經IPTG誘導后，收集菌體裂解上清液，通過?KTA HPLC System鎳柱純化融合蛋白，采用Bradford檢測法測定融合蛋白濃度為487.8 mg/L。

2.4 目的蛋白釋放、純化與活性鑒定

凝血酶切割位點位于R與G之間：LVPR-GS，優(yōu)化載體融合蛋白切割后產生大小兩個片段，理論分子量分別為14.4 kDa與4.9 kDa(圖4，泳道4)；未優(yōu)化載體表達融合蛋白切割大小兩片段分別為13.9 kDa和8.0 kDa (圖4，泳道5)。將優(yōu)化和非優(yōu)化酶切釋放蛋白 (圖4，泳道4、5下方箭頭所指條帶) 進行灰度掃描，結果顯示優(yōu)化后凝血酶切割效率提升約37%。

凝血酶切割產物經過?KTA HPLC System鎳柱純化去除切割大片段和未成功切割片段，收集目的產物經RT-HPLC純化，約27 min出現明顯單一吸收峰，如圖5箭頭所示，且在線性洗脫梯度范圍內無明顯雜峰出現，說明RT-HPLC純化所得的目標蛋白純度較高。對純化后的Lf-CATH2進行金黃色葡萄球菌MIC檢測，其值可達8.3 μg/mL。

圖4 重組優(yōu)化載體全蛋白、裂解上清液、包涵體及融合蛋白切割后的SDS-PAGE分析

圖5 RT-HPLC純化目的肽Lf-CATH2

3 討論

抗菌肽由于其自身特點，如帶正電，大多數為線性分子(含有的二硫鍵橋不穩(wěn)定)，自身又是一種天然殺菌劑，極易被宿主體內的酶降解等特性，很大程度上限制了其在宿主菌中的表達[15-17]。而硫氧還蛋白原核表達系統(tǒng)產生的融合蛋白，類似于抗菌肽前體結構，大大增加了抗菌肽的穩(wěn)定性和隱藏了抗菌肽的毒性[15,18-20]。為了高效、低成本制備Lf-CATH2，本實驗選用硫氧還蛋白融合表達系統(tǒng)進行改造，它特別適用于在大腸桿菌中高產量表達可溶性蛋白質，從實驗結果顯示，大部分Lf-CATH2融合蛋白為可溶性表達，使得后續(xù)純化步驟變得簡便。

對于融合表達來說，酶切位點的選擇也至關重要，正確而高效地切割能夠促進多肽正確折疊和二硫鍵的形成[19,21-24]。pET32α載體常應用于陽離子抗菌肽的融合表達，但有數據顯示載體自身攜帶的凝血酶位點和S標簽可能阻礙凝血酶的切割，不利于目的肽的釋放[25]。原因可能是表達體系中的酶切位點受鄰近殘基的影響，或者由于目的肽鏈的聚集使得凝血酶切割位點隱藏，很難與酶接觸，致使切割效率不高，即使兩個凝血酶位點都能暴露出來，對于切割下來的額外片段也會增多，不利于目的蛋白純化[19,26]。因此我們優(yōu)化了pET32α載體，去除了S標簽與凝血酶位點，而在序列前加入凝血酶位點，連接到優(yōu)化載體進行融合表達。誘導表達的融合蛋白在菌體總蛋白中含量高，經過凝血酶切割，鎳柱和RT-HPLC純化后得到的Lf-CATH2仍然顯示較強的抗菌活性。本實驗構建的新型的硫氧還蛋白原核表達系統(tǒng)，有效解決了原始載體酶切效率低下的問題，有望成為cathelicidin家族及其他陽離子抗菌肽的高效原核表達工具。

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(本文責編 郝麗芳)

Construction of novel thioredoxin fusion protein expression system and the production of recombinant Lf-CATH2

Yiling Lu1, Jiuxiang Gao1, Xue Qiao1, Yipeng Wang2, and Haining Yu1

The objective of this study was to construct an improved thioredoxin fusion protein expression system, and express the cathelicidin-derived peptide, Lf-CATH2. The improved fusion vector Lf-CATH2-pET32α-TSwas successfully constructed by firstly deleting the thrombin site and S tag from the pET-32α vector, then inserting the Lf-CATH2 plus a thrombin site instead. Afterwards, Lf-CATH2 was expressed inas fusion protein. After the cleavage by thrombin, Lf-CATH2 was released and subsequently separated using affinity chromatography. The antimicrobial activity of purified Lf-CATH2 was also examined. The improved expression vector significantly increased enzyme cleavage efficiency by 37%, and Lf-CATH2 could be expressed in high yield and maintain the biological activity. This novel thioredoxin fusion protein expression system enables a quick production of high-yield bioactive cationic peptides like cathelicidins.

cathelicidin, Lf-CATH2, thioredoxin fusion protein, thrombin cleavage

April 17, 2014; Accepted:October 27, 2014

Haining Yu. Tel/Fax: +86-411-84708850; E-mail: joannyu@live.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 41206153), Growth Project for Liaoning Distinguished Young Scientists of Colleges and Universities (No. LJQ2013010), Dalian Distinguished Young Scientists Foundation (No. 2013J21DW013).

國家自然科學基金(No. 41206153)，遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃(No. LJQ2013010)，大連市優(yōu)秀青年科技人才基金(No. 2013J21DW013) 資助。