人卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)分化模型的建立

俞曉麗，王寧，馬洋洋，萬(wàn)千惠，秦明鳴，王華巖

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人卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)分化模型的建立

俞曉麗1,2，王寧1，馬洋洋1，萬(wàn)千惠1，秦明鳴1，王華巖1

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100 2 寧夏醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004

俞曉麗, 王寧, 馬洋洋, 等. 人卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)分化模型的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 394–402.Yu XL, Wang N, Ma YY, et al. Generation of human oocyte-like cell differentiation in vivo. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 394–402.

干細(xì)胞通過誘導(dǎo)培養(yǎng)，在體外能夠分化為卵母細(xì)胞樣細(xì)胞 (Oocyte-like cell，OLC)，將其置于體內(nèi)環(huán)境能夠有效地改善OLC的質(zhì)量和發(fā)育能力。通過檢測(cè)豬卵泡液中激素和Bmp 15蛋白的含量，選取了中等卵泡的卵泡液對(duì)人羊水干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，10 d后，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，早期生殖細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)高表達(dá)生殖基因和重新甲基化轉(zhuǎn)移酶基因。將這些細(xì)胞團(tuán)用豬卵泡膜包裹后形成移植物，移植到小鼠腎被膜下。1個(gè)月后取出移植物，發(fā)現(xiàn)移植物內(nèi)的細(xì)胞在形態(tài)上，不僅與正常的卵母細(xì)胞極為相似，而且還表達(dá)生殖細(xì)胞和卵母細(xì)胞特異標(biāo)記基因 (和)。證明技術(shù)體系能夠有效改善OLC的形成和發(fā)育能力。

人羊水干細(xì)胞，卵母細(xì)胞樣細(xì)胞，骨形成蛋白15，卵泡液，分化

哺乳動(dòng)物雌性生殖細(xì)胞在胎兒發(fā)育早期，僅能產(chǎn)生一定數(shù)目的卵母細(xì)胞，出生后這些有限的卵母細(xì)胞隨著年齡的增加逐漸減少。2003年，Hubner等[1]將小鼠胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cell，ESC) 在體外通過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生出卵母細(xì)胞樣細(xì)胞 (Oocyte-like cell，OLC)，甚至形成孤雌胚胎。同年，Toyooka等[2]證實(shí)將Vasa陽(yáng)性的ESCs細(xì)胞與性腺細(xì)胞共同移植到睪丸被膜下，6?8周后發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的ESC細(xì)胞參與形成了睪丸曲精小管和成熟精子。這些研究證實(shí)ESC細(xì)胞在體外誘導(dǎo)條件下，能夠分化為生殖細(xì)胞。之后，成體干細(xì)胞向卵母細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究也取得了進(jìn)展。2006年，Dyce等[3]采用在培養(yǎng)基中添加豬卵泡液 (Porcine follicle fluid，pFF) 的方法，將豬皮膚干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為OLC細(xì)胞，這些OLC細(xì)胞在體外具備自發(fā)分化為孤雌胚胎的能力。其他研究小組，也證實(shí)了不同來源的干細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)能夠分化為卵母細(xì)胞[4-7]。盡管如此，這些體外分化的卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育能力仍然存在諸多不足：包括胞質(zhì)不勻、透明帶結(jié)構(gòu)不完整、難以實(shí)現(xiàn)減數(shù)分裂等[8-10]。

近期的研究結(jié)果表明，小鼠胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外分化為早期雌性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞后，通過與生殖腺體細(xì)胞重組并移植到去除卵母細(xì)胞的卵泡中，可以正常發(fā)育為具有受精能力的卵母細(xì)胞。而且，這些細(xì)胞具有生殖系嵌合能力[11]。這些結(jié)果表明，體內(nèi)環(huán)境對(duì)體外誘導(dǎo)的雌性生殖樣細(xì)胞進(jìn)一步分化為卵母細(xì)胞起著不可替代的作用。體外注射一定劑量的白消安，能夠暫時(shí)性地抑制小鼠生殖細(xì)胞的發(fā)生，但對(duì)原始生殖細(xì)胞影響較小。同時(shí)，還能引起雌激素水平下降、動(dòng)情期減少等生理現(xiàn)象。而撤去該藥物后，即可恢復(fù)正常的卵母細(xì)胞發(fā)生能力[12-14]。因此，通過體外注射白消安，可以建立小鼠生殖細(xì)胞退化模型，從而為進(jìn)一步研究生殖細(xì)胞的形成和分化奠定基礎(chǔ)。本研究室在前期研究中證明，人羊水干細(xì)胞 (Human amniotic fluid stem cell，hAFSC) 在含有pFF的培養(yǎng)條件下，能夠定向誘導(dǎo)分化為OLC細(xì)胞，但是，獲得的人OLC細(xì)胞發(fā)育仍然不完全[7]。因此，本研究擬探索通過腎被膜移植實(shí)驗(yàn)，將體外誘導(dǎo) 10 d的hAFSC細(xì)胞包被在豬卵泡膜內(nèi)，然后移植到小鼠腎被膜下，擬尋找出適合于雌性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為卵母細(xì)胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pBMP15-EGFP和人羊水干細(xì)胞系hAFSC-070607株由陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保存。人卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 (Cumulus oocyte complexes，COCs) 由陜西婦幼保健院提供。豬卵巢收集于陜西萬(wàn)盛肉類加工有限公司屠宰場(chǎng)。ICR品系小鼠購(gòu)自陜西省西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。用于移植實(shí)驗(yàn)的小鼠年齡均在10?20周齡。

1.2 試劑和耗材

總RNA提取試劑盒、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、多聚賴氨酸處理載玻片等常規(guī)試劑，均購(gòu)自天根生化科技公司；DNA marker購(gòu)自BioLabs公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶均購(gòu)自Thermo公司；Opti-MEM、α-MEM和M199培養(yǎng)基均購(gòu)自Life technology公司；促卵泡激素 (FSH)、孕馬血清促性腺激素 (PMSG)、人絨毛膜促性腺激素 (HCG) 均購(gòu)自Sigma公司；非必需氨基酸 (NEAA)、β-巰基乙醇 (β-ME)、Lipofectamine 2 000、胎牛血清 (FBS)、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 均購(gòu)自Gibco公司。兔抗Bmp15抗體和羊抗兔Cy3二抗均購(gòu)自Abcam公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 豬卵泡液的收集

從屠宰場(chǎng)收集豬卵巢，32?38 ℃保存在含有青、鏈霉素的生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞，用加青霉素、鏈霉素的生理鹽水沖洗卵巢3?5次，分別從小卵泡 (<3 mm)，中等卵泡 (3?6 mm) 和大卵泡 (>6 mm) 中抽取卵泡液 (圖1A和B，箭頭所示)，置于15 mL離心管中，2 000 r/min離心 10 min，收集上清液，65 ℃滅活30 min后，分別用0.45 μm和0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾兩次。分裝 (5 mL/支) 后貯存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Western blotting檢測(cè)Bmp15蛋白表達(dá)

將卵泡液離心取上清，稀釋5倍后，以3∶1加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃處理5 min，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，然后通過半干法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素 (Nitrocellulose，NC) 膜上。NC膜用10%脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h，用TBS-T清洗2遍，將NC膜置于含兔抗Bmp15抗體的TBS-T液中4 ℃孵育過夜。用TBS-T清洗3遍，再將NC膜置于含羊抗兔Cy3二抗TBS-T中37 ℃孵育1 h。用TBS-T清洗3遍，通過ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影曝光。

1.3.3 放射免疫分析法檢測(cè)pFF中激素含量

隨機(jī)抽取3?6 mm和>6 mm卵泡中的卵泡液各3份，離心后收集上清，采用放射免疫分析方法檢測(cè)樣本中激素的含量 (由楊凌示范區(qū)醫(yī)院檢測(cè)中心完成)。

1.3.4 體外誘導(dǎo)產(chǎn)生OLC細(xì)胞

體外誘導(dǎo)產(chǎn)生OLC細(xì)胞的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法見本研究室發(fā)表的文章[7]，簡(jiǎn)述如下：將第10代的hAFSCs-070607，用0.05%胰酶消化成單細(xì)胞后，制成1×104/mL的單細(xì)胞懸液，分別按照1×104/6孔板和1×103/12孔板的細(xì)胞量接種，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，待12 h細(xì)胞貼壁后，更換為生殖細(xì)胞培養(yǎng)基 (含5% pFF)，培養(yǎng)約10 d后，收集上清中的細(xì)胞集落置于卵母細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約7 d左右，每?jī)商旄鼡Q1次培養(yǎng)基，隨時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并及時(shí)拍照。

1.3.5 生殖細(xì)胞特異性基因的檢測(cè)

分別收集未誘導(dǎo)組 (0 d)、體外誘導(dǎo)組 (10 d) 和體內(nèi)誘導(dǎo)組 (4周) 的細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR方法鑒定以上3組來源細(xì)胞中生殖細(xì)胞特異基因的表達(dá)情況，所有引物見表1。

表1 PCR引物

1.3.6 檢測(cè)基因的表達(dá)情況

人的pBMP15-EGFP報(bào)告載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[15]。將該報(bào)告載體經(jīng)脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)10 d的hAFSCs。轉(zhuǎn)染前用5% FBS的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，取0.8 μg pBMP15-EGFP與 50 μL無(wú)血清稀釋液Opti-MEM混合，2 μL脂質(zhì)體與50 μL Opti-MEM混合；5 min后，將上述兩種混合物混合 (總體積100 μL)，加入含有適量新鮮培養(yǎng)液的細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，4?6 h后更換含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染24 h后，用熒光顯微鏡觀察EGFP陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.7 建立小鼠生殖細(xì)胞發(fā)生缺損模型

取體重大于15 g的ICR雌性小鼠，白消安按40 mg/kg的劑量腹腔注射，建立小鼠雌性生殖細(xì)胞退化模型。正常飼養(yǎng)1個(gè)月后，用于生殖細(xì)胞體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)

豬卵泡膜生物材料的制備：從豬卵巢上剝離出8 mm左右的卵泡，在體視顯微鏡下用玻璃針將其刺破，擠壓出卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，并用PBS沖洗，將細(xì)胞及膜碎片等全部沖洗干凈，得到僅由卵泡膜組成的空囊。用4%的多聚甲醛將其于室溫固定30 min，反復(fù)沖洗若干次后，放入含有PBS的離心管中備用 (保證無(wú)菌操作)。

細(xì)胞包被：用0.05%的胰酶將誘導(dǎo)10 d的hAFSC細(xì)胞消化成單細(xì)胞，PBS洗滌兩次后，離心去除上清，用口吸管將細(xì)胞移入已準(zhǔn)備好的卵泡膜中，然后用酒精燈加熱的鑷子將卵泡膜的口封住，將其移入PBS中備用。

腎背囊移植：將備用小鼠用4%戊巴比妥鈉液腹腔注射進(jìn)行麻醉，劑量為50 mg/kg。將小鼠取右側(cè)臥位，切開左背側(cè)部皮膚至腹膜暴露腎臟，用紗布保護(hù)腎臟并起固定作用，用眼科鑷夾起腎包膜，將移植物塞入腎被膜下，并將腎臟復(fù)位，分層縫合切口，對(duì)小鼠保溫復(fù)蘇后正常飼養(yǎng)。

1.3.9 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

術(shù)后1個(gè)月，將移植物取出，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用常規(guī)方法制作2 μm石蠟切片，并進(jìn)行免疫熒光染色。經(jīng)5% BSA室溫封閉30 min；加入兔抗Bmp15一抗，4 ℃過夜；PBS洗3×5 min；然后用羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗片3次，5 min；加入DAPI染核1 min；PBS洗片3次，5 min；最后用中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 豬卵泡液的測(cè)定

收集不同直徑卵泡內(nèi)的卵泡液 (圖1A和1B)，采用Western blotting的方法檢測(cè)卵泡液中Bmp15蛋白的含量，結(jié)果如圖1C和1D所示，3?6 mm卵泡中的Bmp15蛋白表達(dá)量要略高于<3 mm和>6 mm卵泡。

通過放射免疫分析，檢測(cè)3?6 mm和> 6 mm卵泡中生殖激素的水平 (表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌的雌二醇含量在3?6 mm卵泡中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于>6 mm卵泡 (排卵高峰期E2的范圍在100?500 pg/mL)，說明該時(shí)期的卵巢正處于排卵高峰期。促卵泡素 (FSH)和促黃體生成素 (LH) 皆由腦垂體產(chǎn)生，從檢測(cè)結(jié)果可知，3?6 mm卵泡中的卵母細(xì)胞處于卵泡期 (FSH: 3.5?10 mIU/mL) 和>6 mm卵泡中的卵母細(xì)胞處于排卵期 (FSH: 5.7?22.3 mIU/mL)；而這兩種類型卵泡的LH的含量均在卵泡期的正常范圍內(nèi) (6.9?166 mIU/mL)；垂體泌乳素 (PRL) 和睪酮 (P) 的含量則在成年個(gè)體的正常范圍內(nèi)，分別為5?120mIU/mL和5?1 460 ng/d。

圖1 豬卵泡液的收集及Bmp15蛋白的檢測(cè)和灰度值分析

2.2 體外誘導(dǎo)OLC細(xì)胞的形成

將第10代hAFSC-070607 (圖2A) 進(jìn)行生殖細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)。當(dāng)誘導(dǎo)10 d后，細(xì)胞由成纖維樣單層逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形細(xì)胞，部分細(xì)胞呈現(xiàn)集落樣成長(zhǎng) (圖2B)。誘導(dǎo)20 d時(shí)，形成了類似原始生殖細(xì)胞組成的細(xì)胞集落 (圖2C)，而且部分集落樣結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)懸浮于培養(yǎng)液中。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞集落表達(dá)的水平與正常的COCs相當(dāng)。重新甲基化轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)檢測(cè)顯示，hAFSC向生殖細(xì)胞定向誘導(dǎo)過程中發(fā)生了去甲基化又重新甲基化的過程，該基因的表達(dá)量在細(xì)胞集落中顯著高于COCs (圖2D)。通過HⅠ和Ⅰ對(duì)pBMP15-EGFP啟動(dòng)子報(bào)告載體的質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切鑒定，確認(rèn)載體攜帶報(bào)告片段 (圖2E)。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將pBMP15-EGFP報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到誘導(dǎo)10 d的hAFSC中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圓形細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。表明該圓形細(xì)胞是誘導(dǎo)分化后獲得的OLC細(xì)胞 (圖2F)。

表2 卵泡液中生殖激素的含量

圖2 誘導(dǎo)OLC細(xì)胞的形成

2.3 OLC細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育

為了驗(yàn)證誘導(dǎo)后hAFSC細(xì)胞在體內(nèi)是否具備卵子發(fā)生的能力，將誘導(dǎo)10 d的hAFSC包裹在豬卵泡膜里形成移植物 (圖3A)，將其移植到小鼠腎背膜下 (圖3B)。1個(gè)月后取出，發(fā)現(xiàn)移植物的體積有所增大 (圖3C，箭頭所示)。將其部分移植物取出培養(yǎng)，經(jīng)DAPI染色后，發(fā)現(xiàn)有部分細(xì)胞已發(fā)生凋亡，只有少數(shù)類似卵母的細(xì)胞具有較大的細(xì)胞核，但沒有明顯的透明帶 (圖3D，箭頭所示)。同時(shí)，將剩余移植物固定后，經(jīng)切片染色后，發(fā)現(xiàn)有卵母細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白Bmp15的表達(dá)。結(jié)果顯示，移植物內(nèi)存在OLC細(xì)胞 (圖3E)。

2.4 OLC細(xì)胞的分子檢測(cè)

對(duì)體內(nèi)外產(chǎn)生的生殖細(xì)胞進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，未誘導(dǎo)組hAFSC細(xì)胞 (0 d)，除了表達(dá)多能性相關(guān)的基因和之外，還表達(dá)部分早期的生殖細(xì)胞的基因：、和，包括卵母細(xì)胞特異的基因。體外誘導(dǎo)10 d組 (10 d) 和體內(nèi)移植發(fā)育4周組 (4 weeks) 的細(xì)胞除了表達(dá)以上基因外，還表達(dá)生殖細(xì)胞特異標(biāo)記基因和(圖4)。

圖3 OLC細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育

圖4 RT-PCR檢測(cè)生殖細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

雌性生殖細(xì)胞的產(chǎn)生是發(fā)育生物學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一，尤其是人類的生殖細(xì)胞。在之前的報(bào)道中，雖然已經(jīng)初步掌握了從人羊水干細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生雌性生殖細(xì)胞的方法，但仍然有許多研究難點(diǎn)未突破[7]。通過本研究，解決了以下幾個(gè)問題：首先，通過對(duì)pFF的進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，由卵母細(xì)胞分泌的Bmp15蛋白在卵泡液中的含量很高，尤其是在3?6 mm的卵泡中。該蛋白不僅在早期卵泡的生長(zhǎng)、分化和排卵過程中發(fā)揮著重要作用，而且還能有效抑制黃體化[16]。通過激素水平的檢測(cè)證明，雖然FSH等激素的含量在3?6 mm和>6 mm的卵泡中的含量相當(dāng) (睪酮T除外)，3?6 mm的卵泡中的E2水平遠(yuǎn)高于>6 mm的卵泡，而E2在促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)和成熟發(fā)揮著極為重要的作用[17]。

其次，通過對(duì)hAFSC細(xì)胞的誘導(dǎo)，不僅發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，而且，通過基因的表達(dá)模式表明，在誘導(dǎo)過程中，hAFSC細(xì)胞首先經(jīng)歷了分化過程 (0?10 d)；誘導(dǎo)后期，由生殖細(xì)胞組成的細(xì)胞集落出現(xiàn)時(shí)，該基因的表達(dá)顯著上調(diào)，證實(shí)基因在生殖細(xì)胞形成的過程中的重要性[18]。在早期生殖細(xì)胞形成過程中，重新甲基化酶基因不僅影響著卵母細(xì)胞的形成，敲除該基因?qū)ε咛サ陌l(fā)育也是致命的[19-20]。對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行測(cè)定時(shí)，同樣呈現(xiàn)高表達(dá)，表明在誘導(dǎo)生殖細(xì)胞形成過程中基因組發(fā)生了重新甲基化過程。同時(shí)，通過報(bào)告載體，證明在誘導(dǎo)第10天，早期雌性生殖細(xì)胞已形成。證實(shí)該階段的雌性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可以用于體內(nèi)移植。

再次，通過體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，我們得出以下結(jié)論：第一，豬卵泡膜可以作為包裹細(xì)胞的生物膜材料，這種由卵泡內(nèi)膜細(xì)胞基質(zhì)組成的囊狀膜，不僅可以容納被誘導(dǎo)的細(xì)胞，而且移植后能保持良好的通透性，使細(xì)胞與體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行有效交換；第二，在移植前后，通過對(duì)移植物體積的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)移植物的體積略有增大。說明誘導(dǎo)后的hAFSC細(xì)胞在該環(huán)境下，具備一定的增殖能力。證明雌性生殖細(xì)胞退化模型對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的正常發(fā)育影響較小。同時(shí)，移植物中卵母細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，說明在該模型中，誘導(dǎo)后的hAFSC細(xì)胞具備一定的卵母細(xì)胞發(fā)生能力。有研究證明，該模型有利于被移植細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育[21]；第三，通過對(duì)體內(nèi)移植細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在OLC細(xì)胞中有的表達(dá)。與相比，其組織特異性更強(qiáng)，只能在卵泡發(fā)育各階段中卵母細(xì)胞中表達(dá)。過表達(dá)該基因能促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)[22]，而且，基因的激活與OLC細(xì)胞的形成密切相 關(guān)[15]。基因在人卵母細(xì)胞的整個(gè)發(fā)育階段表達(dá)，在有絲分裂和減數(shù)分裂階段，nanos3蛋白與染色體DNA共定位。降低該蛋白的表達(dá)不僅導(dǎo)致生殖細(xì)胞數(shù)目的減少，而且影響其他生殖細(xì)胞基因的表達(dá)和減數(shù)分裂的啟動(dòng)[23]。因此，該基因?qū)ι臣?xì)胞的形成起著十分重要的作用。本研究中經(jīng)體內(nèi)移植得到的OLC細(xì)胞表達(dá)該基因，進(jìn)一步證實(shí)了其生殖細(xì)胞的屬性。

綜上所述，本研究證明人羊水干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，具有分化為OLC細(xì)胞的潛能。通過小鼠腎背囊移植實(shí)驗(yàn)，初步形成了雌性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育與分化為卵母細(xì)胞的新方法。為進(jìn)一步研究人雌性生殖細(xì)胞的形成與分化奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Generation of human oocyte-like cell differentiation

Xiaoli Yu1,2, Ning Wang1, Yangyang Ma1, Qianhui Wan1, Mingming Qin1, and Huayan Wang1

1,,,712100,,2,,,,,750004,,

Oocyte-like cells (OLC) can be generated by stem cells after the induction and differentiation, and maturated when transplantedto improve the development potential. Human amniotic fluid stem cells (hAFSC) were cultured for 10 days in porcine follicle fluid (pFF) that was extracted from the medium follicle with high levels of hormones and Bmp 15 protein. After the induction, the cell aggregates showed the germ cell-like cells and produced the germ cell marker, and triggered epigenetic changes with high expression of methylation transferase gene. The cell aggregates were packaged into porcine theca folliculi to form grafts, which were then transplanted into mouse renal capsule. After one month of transplantation, the morphology of OLC from a graft was not only similar to oocytes, but also expressed the germ cells markers (,,,,,,, and). The results demonstrate that thedifferentiation model was useful for OLC development.

human amniotic fluid stem cell, oocyte-like cell, Bmp15, follicle fluid, differentiation

June 6, 2014; Accepted:October 28, 2014

Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31371505), Scientific Research Project of Ningxia Medical University (XT201412).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31371505)，寧夏醫(yī)科大學(xué)校級(jí)項(xiàng)目 (XT201412) 資助。

2015-01-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150113.1353.001.html