蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量影響因素研究

施新琴　顧寅鈺　郭光等

摘要： 以雙蒸水為溶劑，用反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定蠶蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量，并用該方法測(cè)定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12種不同蟲草菌株栽培的蠶蛹蟲草、不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草以及蠶蛹蟲草不同組織中的蟲草素和腺苷的含量。結(jié)果表明：1-Y菌株的蟲草素和腺苷含量均最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)15.45 mg/g和4.40 mg/g；不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草中蟲草素則以感染而未出草的僵蠶最高；蠶蛹蟲草的僵蠶體對(duì)蟲草素的富集能力高于子座，蠶蛹蟲草的子座對(duì)腺苷的富集能力高于僵蠶體。該結(jié)果可對(duì)探求高蟲草素含量和高腺苷含量的蟲草材料提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蟲草素；腺苷；含量；影響因素；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：S886.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0109-03

Abstract The contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris samples of different qualities， different parts and inoculated with 12 different strains such as 19-3， 17-3， MS， 1-1 and 1-Y were determined by RP-HPLC using double distilled water as solvent. The results indicated that the contents of cordycepin and adenosine in 1-Y were both the highest， and the mass fraction reached 15.45 mg/g and 4.40 mg/g respectively. In Cordyceps militaris of different qualities， the content of cordycepin in silkworm infected but no fruiting were the highest. The enrichment ability of silkworm body to cordycepin was higher than stroma， while that of stroma to adenosine was higher than silkworm body. These results provided theoretical basis for seeking Cordyceps militaris with high cordycepin and adenosine contents.

Key words Cordycepin； Adenosine； Content； Influence factors； RP-HPLC

蠶蛹蟲草（Cordyceps militaris），即以家蠶幼蟲為寄主栽培的蛹蟲草，其蟲草形態(tài)更接近天然蟲草[1]，其所特有蟲草素具有抗腫瘤、抗病毒等方面的作用而引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。腺苷在抗病毒，抗菌，預(yù)防治療腦血栓、腦溢血，抑制血小板積聚，防止血栓形成，消除面斑和抗衰防皺等方面效果較佳[2]。

由于蟲草中蟲草素和腺苷含量均偏低，因此快速、準(zhǔn)確檢測(cè)蟲草中蟲草素和腺苷含量，對(duì)蠶蛹蟲草品質(zhì)鑒定至關(guān)重要，而提供高蟲草素和腺苷含量的蠶蛹蟲草材料對(duì)于蠶蛹蟲草的提純、深加工等開發(fā)、利用具有舉足輕重的作用，但是相關(guān)報(bào)道較少。為此，筆者建立了反相高效液相色譜法，利用19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y等12種不同蛹蟲草菌株栽培蠶蛹蟲草，快速測(cè)定蟲草素和腺苷含量，以探求高蟲草素和腺苷含量的蟲草材料。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

菌株：1-Y、DL-4 、MS、DL-5、DL-2、DL-6、19-3、DL-1，用于測(cè)定不同菌株對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響； JL-3、 JL-9，用于測(cè)定同一菌株接種后出草的蟲草和不出草蠶體蟲草素及腺苷含量比較；MS、19-3、1-Y、17-3和1-1，用于測(cè)定蟲草不同部位中蟲草素和腺苷的含量。

材料：本研究室培育的蠶蛹蟲草樣品，栽培方法見文獻(xiàn)[3～5]，經(jīng)80℃烘干，粉碎，過80目篩后，-20℃冷凍保存待測(cè)。

試劑：蟲草素標(biāo)樣（SIGMA），腺苷（常州大康）；四氫呋喃（色譜純），甲醇（色譜純）；KH2PO4、K2HPO4、乙醇均為分析純，試驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

儀器：高效液相色譜儀（大連依利特）配UV200紫外-可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，WATERS NOVPAK- C18色譜柱 （5 μm×40 cm）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；格蘭仕微波爐；0.2 μm濾膜，25 μL微量進(jìn)樣器。

1.2 方法

1.2.1 蟲草素和腺苷的提取[6]準(zhǔn)確稱取蟲草樣品0.1 g，加入雙蒸水1 mL，渦流1 min，微波中高火提取1 min，靜置得蟲草素、腺苷提取液，過0.2 μm濾膜得待測(cè)液。

1.2.2 測(cè)定方法 采用RP-HPLC法[7]，檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm，流動(dòng)相為四氫呋喃-0.1%甲醇-磷酸鹽緩沖液（1∶2∶97，V/V），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，重復(fù)3次。分析軟件為Echrom98工作站，外標(biāo)法分析計(jì)算。測(cè)試完畢用流動(dòng)相洗色譜柱30 min除去雜質(zhì)，再用3%甲醇平衡30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹蟲草的色譜圖分析

以上述RP-HPLC方法測(cè)定樣品中蟲草素和腺苷的含量，色譜圖（圖1、圖2）顯示目標(biāo)色譜峰分離效果好。精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率等試驗(yàn)結(jié)果均表明該方法穩(wěn)定可靠，是測(cè)定蠶蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量的有效方法。endprint

2.2 不同菌株對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

以1-Y、MS、19-3、DL-1、DL-2、DL-4、DL-5和DL-6共計(jì)8種菌株侵染蠶體培育蠶蛹蟲草，研究不同菌株對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量影響。結(jié)果（表1）表明：菌株直接影響蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷的含量，其中1-Y菌株的蟲草素和腺苷含量均最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)15.45 mg/g和4.40 mg/g。DL-1的蟲草素含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.56 mg/g，DL-6的腺苷含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.84 mg/g。

2.3 不同出草情況對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

同一菌株接種感染后，有的蠶體經(jīng)歷僵化、菌絲旺盛生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)色過程，但最終未能長(zhǎng)出子座，簡(jiǎn)稱為未出草僵蠶體。相反，蠶體經(jīng)歷僵化、菌絲旺盛生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)色過程，最終長(zhǎng)出若干子座的，簡(jiǎn)稱蠶蛹蟲草全株。由表2看出，JL-3和JL-9兩種菌株接種后未出草蠶體中蟲草素含量遠(yuǎn)高于出草的蠶蛹蟲草，是正常出草蠶體的2倍還多；但腺苷的表現(xiàn)規(guī)律性不強(qiáng)，JL-3菌株出草的蟲草全株中含量高于未出草的蠶體，而JL-9菌株出草的蟲草全株中含量低于未出草的蠶體。

2.4 不同部位對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響

為了探討不同部位對(duì)蠶蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量的影響，測(cè)定了19-3、17-3、MS、1-1以及1-Y感染的蠶蛹蟲草。圖3表明蟲草素含量在未出草僵蠶體內(nèi)極高，尤其是MS菌株感染的蟲草素含量達(dá)15.30 mg/g；出草的蠶蛹蟲草中僵蠶體中蟲草素含量高于子座中的，其中1-Y菌株感染的僵蠶含量最高，達(dá)9.44 mg/g，最低的是17-3菌株感染蠶蛹蟲草的子座，僅為0.74 mg/g。圖4表明，蠶蛹蟲草子座中腺苷含量普遍高于僵蠶體中的，其中1-Y菌株感染的蠶蛹蟲草子座中含量最高，達(dá)3.15 mg/g。比較可以看出MS 和1-Y菌株的性狀較佳。

3 討論

用RP-HPLC方法測(cè)定樣品中蟲草素和腺苷的含量，目標(biāo)色譜峰分離效果好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，是測(cè)定各種蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量的有效方法。高蟲草素含量的材料是蠶蛹蟲草的僵蠶體，而高腺苷含量的蟲草材料是蠶蛹蟲草的子座。

蠶蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量受多種因素的影響，如菌株、溫度、濕度和光照等。本研究結(jié)果顯示蠶蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量均隨侵染菌株、蟲草品質(zhì)以及蟲草組織部位的不同而變化。其中出草的蠶蛹蟲草中1-Y菌株感染的蟲草素和腺苷含量最高，不同品質(zhì)的蠶蛹蟲草中蟲草素則以感染而未出草的僵蠶最高，蟲草素的富集部位則為僵蠶體，與孫迎節(jié)等[9]結(jié)論相同，但申鴻等[10]、溫魯?shù)萚8]認(rèn)為蟲草素的富集部位為子座。原因有兩方面，一方面是由于菌株不同，表現(xiàn)不同而影響了結(jié)論；另一方面是出草管理如光照、濕度等對(duì)蟲草素的積累可能也有一定的影響。應(yīng)進(jìn)一步研究明確蟲草素的形成時(shí)期及其它影響蟲草素形成的因素。

參 考 文 獻(xiàn)：

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