溫針灸預(yù)處理對(duì)不同時(shí)間間隔缺血再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用*

劉衛(wèi)星，虞躍躍

(1.唐山市中醫(yī)院，河北 唐山063000;2.河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山063000)

近年來(lái)，冠心病等缺血性心臟病逐年增加［1］。而再灌注治療是其有效治療方法之一，而缺血再灌注損傷是其嚴(yán)重的并發(fā)癥，是影響治療效果的一個(gè)重要因素。目前，針刺抗心肌缺血已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床與基礎(chǔ)研究［2-3］，證實(shí)了針灸能通過(guò)多種途徑改善冠心病心肌缺血臨床癥狀和體征。本實(shí)驗(yàn)研究旨在觀察溫針灸大鼠內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理后，依據(jù)不同時(shí)間間隔對(duì)大鼠進(jìn)行造模，觀察對(duì)大鼠血清NO、NOS 含量的變化及心肌梗死面積的影響，以觀察溫針灸干預(yù)缺血再灌注時(shí)對(duì)心肌保護(hù)的作用、機(jī)制及不同時(shí)間間隔溫針灸刺激內(nèi)關(guān)對(duì)心肌缺血的影響是否具有明顯的時(shí)間依賴性，為溫針灸治療心肌缺血臨床和理論研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取清潔級(jí)健康Wistar 大鼠60 只，雌雄各半，體重(200 ±20)g，由河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXKll-00-0010。隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組，即:模型組、實(shí)驗(yàn)A 組、實(shí)驗(yàn)B 組、實(shí)驗(yàn)C組，分組每組6 只。常規(guī)飼料喂養(yǎng)7 天，室溫18℃～22℃，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌缺血再灌注動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)［4］造模方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，四肢接上心電圖電極，記錄心電圖，除毛，氣管切開行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，控制呼吸頻率70 ～85 次/min，潮氣量2 ～4.5 ml/100 g。沿胸骨左緣第4 肋間打開胸腔，撕開心包膜暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間找到左冠狀動(dòng)脈，用0 號(hào)縫合線在其下穿過(guò)，打一活結(jié)，缺血30 min后拉開活結(jié)再灌注60 min。缺血的標(biāo)志為:左心室前壁發(fā)紺，心電圖ST 段抬高。再灌注的標(biāo)志為:發(fā)紺區(qū)充血發(fā)紅，抬高的ST 段恢復(fù)正常。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 模型組:行心肌缺血再灌注造模;實(shí)驗(yàn)A 組:先將大鼠仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，取大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，內(nèi)關(guān)穴位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨骨縫間，針刺手法采用0. 35 mm ×25 mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)華佗牌)，應(yīng)用單手進(jìn)針?lè)?，直刺入穴? ～3 mm 后，于針柄處加艾粒灸(每壯含艾絨約0.2 g，蘇州東方艾絨廠)，燃燒時(shí)間約為20 min，操作完畢后0.5 h，行心肌缺血再灌注造模;實(shí)驗(yàn)B 組:操作方法同上，操作完畢后1.5 h，行心肌缺血再灌注造模;實(shí)驗(yàn)C 組:操作方法同上，操作完畢后3 h，行心肌缺血再灌注造模。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 心肌梗死面積［5］造模成功后，于左心室注入3%伊文思藍(lán)1 ml 后取下心臟，剪下左室，確定未缺血與缺血心肌。置-20℃冰箱中冷卻30 min 后，每隔2 mm，從心尖起將心肌平行切成等厚5 片。置入1%TTC 磷酸緩沖液(PH7.4)，37℃水浴10 min。梗死心肌細(xì)胞中因細(xì)胞膜損傷脫氫酶釋放丟失，因而不被染色，正常心肌含有脫氫酶可被染為紅色。梗死面積百分率(%)=左心室組織切片梗死區(qū)面積/左心室組織切片總面積×100%。

1.3.2 血清NO、NOS 含量的測(cè)定［6］再灌注結(jié)束時(shí)快速打開腹腔，暴露腹腔靜脈，取靜脈血5 ml，靜置后4℃5000 r/min 離心15 min，取血清，采用分光光度法測(cè)定NO、NOS 含量，操作方法按試劑盒(南京建成生物功能研究所，產(chǎn)品批號(hào):20130215，20130222)說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)心肌梗死面積的影響

實(shí)驗(yàn)A、B、C 組分別與模型組比較，動(dòng)物心肌梗死均明顯減輕、面積縮小，差異性具有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.01 或P ＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于模型組;實(shí)驗(yàn)A 組分別與實(shí)驗(yàn)組B、C 組比較，心肌梗死均明顯減輕、面積縮小，差異性具有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.01 或P ＜0.05)，實(shí)驗(yàn)A 組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B、C 組;實(shí)驗(yàn)組B 與實(shí)驗(yàn)C 組比較，心肌梗死均明顯減輕、面積縮小，差異性具有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.05)，實(shí)驗(yàn)B 組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)C 組。見表1。

表1 4 組對(duì)心肌缺血再灌注心肌梗死面積比較(±s)

表1 4 組對(duì)心肌缺血再灌注心肌梗死面積比較(±s)

注:與模型組比較，△P ＜0.01，▲P ＜0.05;與實(shí)驗(yàn)A 組比較，* P ＜0.01，○P ＜0.05;與實(shí)驗(yàn)B 組比較，☆P ＜0.05。

組別 n 梗死面積(mm2)梗死率(%)占左心室 占心臟模型組6 448.6 ±61.2 7.6 ±1.2 16.5 ±2.4實(shí)驗(yàn)A 組 6 169.4 ±32.8△ 2.8 ±0.9△ 5.6 ±1.8△實(shí)驗(yàn)B 組 6 245.4 ±56.1△＊ 4.9 ±2.4△○ 9.8 ±4.8△○實(shí)驗(yàn)C 組 6 279.9 ±85.6▲＊☆ 6.9 ±2.1* 13.8 ±4.1*

2.2 對(duì)血清NO、NOS 含量的影響

心肌缺血再灌注模型組血清中NO 含量明顯減少、NOS 活力下降;穴位溫針灸預(yù)處理不同時(shí)間間隔行心肌缺血再灌注造模后，實(shí)驗(yàn)A、B 組NO 含量、NOS活力較心肌缺血再灌注模型組明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)C 組與模型組比較NO、NOS 含量變化不明顯。見表2。

表2 4 組對(duì)心肌缺血再灌注血清NO、NOS 含量比較

3 討論

組織缺血再灌注損傷已在多種器官中得到的證明［7］。本研究從中醫(yī)整體觀念出發(fā)，注重未病先防，既病防變，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中預(yù)先對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行溫針灸處理20 min 后，隨后觀察其抗損傷作用。

溫針灸療法，是指在毫針的留針過(guò)程中，同時(shí)在針柄予艾粒加熱，既能起到針刺促使氣血調(diào)和、通經(jīng)活絡(luò)的作用，又能起到艾灸調(diào)和氣血、舒筋通絡(luò)、解瘀止痛的雙重作用。本實(shí)驗(yàn)以雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴為溫針灸預(yù)處理用穴，溫針灸20 min 后起針，起針后再分別間隔0. 5、1.5、3 h 進(jìn)行心肌缺血再灌注造模，結(jié)果顯示各組NO、NOS 活性差異顯著，間隔0.5 h 可使心肌缺血再灌注后NO 活性顯著增強(qiáng)，間隔1.5 h 作用減弱，而間隔3 h 作用不明顯。這一結(jié)果表明:內(nèi)關(guān)穴穴位溫針刺預(yù)處理具有明顯的抗心肌缺血再灌注損傷作用，且該作用具有明顯的時(shí)間依賴性，與陳氏等的研究結(jié)果一致［8］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫針灸大鼠內(nèi)關(guān)穴后間隔不同的時(shí)間間隔進(jìn)行心肌造模與模型組比較均能減小心肌梗死面積，但尤以0.5 h 實(shí)驗(yàn)A 組(P ＜0.01)、1.5 h 實(shí)驗(yàn)B組(P ＜0.01)明顯，其作用機(jī)制可能與溫針灸可以提高NOS 活性、增加NO 生成、增強(qiáng)過(guò)氧化反應(yīng)、減輕細(xì)胞過(guò)氧化損傷有關(guān)，且降低的程度呈時(shí)間依賴性［9］。

綜上所述，再灌注對(duì)心肌細(xì)胞有損傷作用，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明這種作用具有明顯的時(shí)間依賴性，也就是說(shuō)，在什么時(shí)候介入溫針灸方法將對(duì)抵御隨之而來(lái)的疾病的發(fā)生或減弱疾病對(duì)機(jī)體的損傷程度至關(guān)重要［10］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，溫針灸可以減輕缺血再灌注造成的多種損傷，既可以明顯改善NO、NOS 的活性，減緩組織壞死程度，這與抗自由基損傷有直接關(guān)系。

［1］ Liem DA，Honda HM，Zhang J，et al.Past and present courseof cardioprotection against chemia- reperfusion injury［J］. J Appl Physiol，2007，103:2129-2136

［2］ 袁葉，田岳鳳.針刺對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.針灸臨床雜志，2009，25(5):47-50

［3］ 刁利紅，嚴(yán)潔.針灸治療冠心病心肌缺血臨床研究概況［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24(4):59-61

［4］ 嚴(yán)潔，楊孝芳，易受鄉(xiāng)，等.電針“內(nèi)關(guān)”對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞膜鈉泵活性及其基因表達(dá)的影響［J］. 針刺研究，2007，32(5):296-300

［5］ 李偉，付萍，陳穎麗，等.三羊益心康膠囊對(duì)犬急性心肌缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(10):47-49

［6］ 劉潔，劉芬，王秋靜，等.人參二醇組皂苷對(duì)心肌梗死犬血清一氧化氮、一氧化氮合酶水平的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(4):46-49

［7］ 張江玲，陳杰，王祥瑞，等.電針“內(nèi)關(guān)”穴預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用［J］.針刺研究，2010，35(3):182-187

［8］ 陳澤斌，王華.大鼠穴位針刺預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷作用探討［J］.針刺研究，2003，28(3):165-169

［9］ 陳澤斌，柯暉，鄒鋒.針刺預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷作用及其分子機(jī)制［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(7):1246-1248

［10］ 孔素萍，張昕，譚奇紋.電針“夾脊”穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)針灸，2013，33(6):529-532