溫通法對(duì)脊髓全橫斷大鼠CGRP 和行為學(xué)的影響*

李淑敏，何冠蘅，阮經(jīng)文△，曾園山，李志玲

(1.廣東省工傷康復(fù)醫(yī)院，廣東 廣州510440;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510080;3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510080)

脊髓損傷后的康復(fù)是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，伴隨這一過程的治療投入也是巨大的，但結(jié)果差強(qiáng)人意，絕大部分患者最終還是需要在輪椅上度過后半生。正因如此，脊髓損傷后的治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。醫(yī)務(wù)人員和科研工作者也曾經(jīng)尋求多種諸如手術(shù)、藥物、功能鍛煉等手段來對(duì)抗脊髓損傷，但療效有限。即使在追求突破的今天，人們嘗試了被認(rèn)為最有前途的干細(xì)胞移植治療，從目前有限的臨床實(shí)驗(yàn)來看，其臨床療效與實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果依然相去甚遠(yuǎn)，且仍有許多相關(guān)問題有待解決。而在這樣的背景下，挖掘傳統(tǒng)療法在脊髓損傷治療中的優(yōu)勢(shì)就顯得非常必要。作為傳統(tǒng)針灸療法中“針”的部分的針刺療法，在脊髓損傷的臨床治療中已被廣泛應(yīng)用［1-2］。而另一重要組成部分的“灸”法，在這一領(lǐng)域似乎已被遺忘，極少人對(duì)其進(jìn)行科學(xué)、深入的研究?；诖?，筆者探索性地對(duì)艾條灸治療脊髓損傷進(jìn)行了初步的基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD(Sprague-Dawley)雌性成年大鼠15 只(200 ～250 g)，隨機(jī)編號(hào)為1 ～15，采用EXCEL 編程生成隨機(jī)數(shù)，隨機(jī)數(shù)由大到小分配到3 組中，其所對(duì)應(yīng)的大鼠即被隨機(jī)分為3 組。①正常對(duì)照組(normal group):不損傷，不治療;②脊髓損傷組(SCI group):脊髓全橫斷術(shù)后不做任何治療;③艾條灸組(GV-M group):自SCI術(shù)后第7 天起，采用艾條灸督脈治療3 天。各組存活時(shí)間均為10 天。

1.2 全橫斷脊髓損傷大鼠模型的建立

造模方法參考文獻(xiàn)［3-4］:成年雌性SD 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg ～30 mg/kg)進(jìn)行麻醉，切開皮膚，暴露T10段脊髓。剪開硬脊膜，快速全橫斷脊髓。充分止血，以明膠海綿覆蓋橫斷處，逐層縫合。術(shù)后每日肌注青霉素50000 U/kg，人工排尿，3次/日，至取材或恢復(fù)自主排尿功能。

1.3 治療方法

取穴:取距離SCI 段上下端兩個(gè)椎體的棘突間隙(T7和T11棘突下方，相當(dāng)于督脈至陽(yáng)和脊中兩穴)。操作:點(diǎn)燃艾條，對(duì)準(zhǔn)應(yīng)灸部位，采用溫和灸法于距皮膚3 cm 處進(jìn)行熏灸，每穴每次10 min，每天1 次，療程為3 天。

1.4 脊髓取材

各組動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)第10 天行BBB 評(píng)分后處死，置于冰盒上，撬開椎板，暴露脊髓，迅速取出T8～12脊髓節(jié)段(含損傷區(qū))置于-70℃下保存。取T9～11脊髓節(jié)段用于Western blot 檢測(cè)，T8與T12用于免疫熒光檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)方法

免疫熒光檢測(cè)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)在損傷脊髓鄰近節(jié)段的表達(dá)和分布:冰凍切片，丙酮固定，加1:10 正常山羊血清孵育，加一抗過夜，加入熒光二抗，甘油封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。觀察各組脊髓背角CGRP 陽(yáng)性染色區(qū)面積變化。

CGRP 分布示意圖如圖1 所示，其在脊髓橫斷面中背角的分布如圖2 所示。

圖1 CGRP 分布示意圖

圖2 CGRP 在脊髓背角的分布

Western Blot 檢測(cè)損傷脊髓組織及鄰近節(jié)段CGRP 的含量:聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入一抗、二抗，進(jìn)行顯色反應(yīng)，暗室內(nèi)曝光。

行為學(xué)評(píng)分:參照大鼠SCI 后功能評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(Basso，Beattie，Bresnahan，簡(jiǎn)稱BBB 評(píng)分法)［5］，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組脊髓背角CGRP 陽(yáng)性染色區(qū)面積觀察比較

從圖3 中可以直觀的看出，SCI 組CGRP 陽(yáng)性染色區(qū)面積，與對(duì)照組、艾條灸組比較明顯減小，艾條灸組與對(duì)照組CGRP 陽(yáng)性染色區(qū)面積相近。

圖3 各組脊髓背角CGRP 陽(yáng)性染色區(qū)面積

2.2 CGRP 含量的變化

與艾條灸組、對(duì)照組相比，SCI 組的CGRP 條帶變得明顯窄小，其相對(duì)灰度值的比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與對(duì)照組相比，艾條灸組CGRP 條帶的寬度無明顯變化，其相對(duì)灰度值比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖4。

圖4 各組脊髓背角CGRP 條帶及灰度值的比較

2.3 行為學(xué)改變

術(shù)前各組BBB 評(píng)分均為21 分。SCI 組和艾條灸組術(shù)后評(píng)分均為0 分，術(shù)后第10 天結(jié)果如圖5 所示，兩組評(píng)分較術(shù)后均有所增加，且艾條灸組評(píng)分增幅較大，但兩組評(píng)分之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖5 脊髓損傷組與艾條灸組BBB 評(píng)分比較

3 討論

針刺治療疾病，非常強(qiáng)調(diào)針下的得氣，這在《靈樞·九針十二原》中早有記載:“刺之要，氣至而有效”，“刺之而氣不至，無問其數(shù)”，清楚地表明“氣至”是針刺取效的關(guān)鍵。而脊髓損傷的患者，其病灶平面以下的感覺基本消失，隨之消失的還有患者對(duì)針刺的感應(yīng)，即在這些部位針刺患者無酸、麻、重、脹的感覺，即沒有得氣感，從而導(dǎo)致毫針治病“氣至則有效”的基本要求難以達(dá)到。這可能是目前針刺治療截癱病人療效差的主要原因，其具體緣由值得進(jìn)一步探討。與此相反，艾灸治療疾病，鮮有強(qiáng)調(diào)艾灸的操作必須得氣的記載和要求，從古至今，多數(shù)觀點(diǎn)均認(rèn)為艾灸療效的關(guān)鍵在于溫?zé)嵝?yīng)［6］，而所謂“溫?zé)嵝?yīng)”就是通過艾灸燃燒時(shí)的熱過程影響患者機(jī)體的生物效應(yīng)，比如艾灸對(duì)機(jī)體熱休克蛋白的影響［7-8］，以及艾灸時(shí)的紅外線輻射，不但為機(jī)體細(xì)胞代謝、免疫功能提供必要的能量，也為能量缺乏的病態(tài)細(xì)胞提供活化能［9］。

眾所周知，能量過程是生命系統(tǒng)中的基本過程，而熱是能量過程的重要表現(xiàn)形式，生命現(xiàn)象的各個(gè)層次無不包含熱效應(yīng)［10］。脊髓損傷后的康復(fù)需要更多的能量補(bǔ)給，熱效應(yīng)就是提供此種能量的方式之一。艾灸熱作為一種特殊的熱能介入方式，燃燒時(shí)除了能夠直接給局部施加熱能外，還產(chǎn)生一種十分有效并適宜于機(jī)體的遠(yuǎn)、近紅外線。一方面，遠(yuǎn)紅外線能直接作用于人體的表淺部位，利用物理傳導(dǎo)方式擴(kuò)散熱量;另一方面，波長(zhǎng)短、能量強(qiáng)的近紅外線，可穿透組織深達(dá)10 mm左右，這些熱能通過毛細(xì)血管網(wǎng)和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)傳到更廣泛的部位，為人體所吸收［11-12］，從而發(fā)揮灸法的熱效應(yīng)，為機(jī)體提供能量，也為脊髓損傷后神經(jīng)再生所需能量提供了保證。

CGRP 作為一種新型的神經(jīng)肽，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷可引起CGRP 表達(dá)明顯下調(diào)，且在1 個(gè)月內(nèi)，CGRP 水平?jīng)]有恢復(fù)［13］。另外，CGRP 能促進(jìn)SCI 后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［14］，對(duì)神經(jīng)元的可塑性也起著重要作用［15］。所以，在損傷早期CGRP 的表達(dá)情況可以作為評(píng)定脊髓修復(fù)再生的一個(gè)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:通過短暫的3 天艾條灸治療，艾條灸組大鼠的CGRP 的表達(dá)明顯高于單純脊髓損傷組(P ＜0.05)，而接近正常對(duì)照組(P ＞0.05)，可能就是通過灸法的能量補(bǔ)給機(jī)制，促進(jìn)了CGRP 的合成。雖然CGRP 主要由神經(jīng)細(xì)胞合成，但也有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮自身也能合成［16］。因此，盡管某些平面的神經(jīng)受損，但血管網(wǎng)絡(luò)保存完好，在獲得灸能的補(bǔ)充后，能迅速合成因脊髓損傷而減少的CGRP，并通過毛細(xì)血管網(wǎng)和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)對(duì)灸能進(jìn)行區(qū)域廣泛的傳導(dǎo)，跨過損傷區(qū)，傳導(dǎo)到損傷平面以上的神經(jīng)，使正常神經(jīng)細(xì)胞迅速合成CGRP，從而能在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)CGRP 的表達(dá)，并接近正常范圍。當(dāng)然，灸法對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用是多靶點(diǎn)、多途徑的，其對(duì)脊髓損傷的治療除了CGRP之外，應(yīng)該還存在許多其它的途徑和靶點(diǎn)，有待今后繼續(xù)探索。本實(shí)驗(yàn)的另一結(jié)果:艾條灸組與單純脊髓損傷組之間BBB 評(píng)分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，這可能與治療時(shí)間較短有關(guān)。而且，盡管兩組的行為學(xué)評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但艾條灸組評(píng)分還是表現(xiàn)出優(yōu)于單純脊髓損傷組的趨勢(shì)，值得今后延長(zhǎng)治療時(shí)間再進(jìn)行觀察。本次實(shí)驗(yàn)總體結(jié)果提示，溫通法治療脊髓損傷是有效的，值得推廣和深入研究。

從中醫(yī)角度來看，脊髓損傷的實(shí)質(zhì)是督脈損傷，其所表現(xiàn)的截癱或四肢癱瘓，以肢體痿廢不動(dòng)為主，常伴有手足不溫、背冷、畏風(fēng)等陽(yáng)虛之癥，這些癥狀在陰陽(yáng)屬性中屬于陰證范疇，為灸法的適應(yīng)癥。加上平面以下針感消失，影響針刺效果。《醫(yī)學(xué)入門·針灸》云:“藥之不及，針之不到，必須灸之?！庇纱丝梢?，無論在現(xiàn)代基礎(chǔ)研究還是傳統(tǒng)中醫(yī)理論下，溫通法都是值得在脊髓損傷的治療中推廣和應(yīng)用的。

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