曲古抑菌素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特化干預(yù)的體外研究

袁志峰,許國(guó)華,任莉

(1.景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 骨科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 脊柱外科，上海 200003；3.浙江省立同德醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310012)

?

曲古抑菌素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特化干預(yù)的體外研究

袁志峰1,許國(guó)華2,任莉3

(1.景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 骨科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 脊柱外科，上海 200003；3.浙江省立同德醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310012)

目的 探討曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)特化為成骨細(xì)胞的影響。方法 采用全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化大鼠MSCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；選擇第3代MSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，根據(jù)給藥濃度不同分為TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。MTT法觀察各組對(duì)MSCs的增殖作用并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)TSA對(duì)MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中堿性磷酸酶(alkaliphosphatase，ALP)活性的影響；RT-PCR法檢測(cè)TSA對(duì)核心結(jié)合因子α-1(corebinding factor α1，Cbfα1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果 MSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示，各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)相似，與對(duì)照組相比，TSA低劑量組的生長(zhǎng)曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均顯著促進(jìn)MSCs增殖(P<0.05)。與對(duì)照組相比，TSA低劑量組、中劑量組、高劑量組對(duì)MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中的第4、5、6 E均可顯著提高ALP活性(P<0.05)。與空白組相比，TSA各劑量組可以顯著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 TSA可顯著促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特化為成骨細(xì)胞，可能是通過上調(diào)Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

曲古抑菌素；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；核心結(jié)合因子α-1；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1

間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，具有向成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等分化的能力，對(duì)多種疾病具有治療潛能，如骨質(zhì)疏松癥、心肌梗死、神經(jīng)性疾病等[1-2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)是一種有效的特異性組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞分化及增殖過程中[3-4]。本研究擬在采用RT-PCR法檢測(cè)TSA對(duì)核心結(jié)合因子α-1(corebinding factor α1，Cbfα1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-Like growth factor-1，IGF-1)mRNA表達(dá)水平，觀察TSA對(duì)MSCs特化的成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠20只，5周齡，體質(zhì)量100～120 g，動(dòng)物室溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度(45±5)%，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水和進(jìn)食，雌雄不限。由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為：SCXK(桂)2009-0002。

1.2 試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone公司)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗血酸、TSA、鏈霉素青霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(均購(gòu)自Sigma)；PNPP顯色劑、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(均購(gòu)自Wako公司)；聚合酶鏈引物設(shè)計(jì)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(均購(gòu)自TaKaRa公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(購(gòu)自ABI公司)；CO2培養(yǎng)箱(購(gòu)自Shellab公司)；倒置相差顯微鏡(購(gòu)自O(shè)lympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的原代分離、培養(yǎng)、傳代：取5周齡SD大鼠，脫頸椎處死動(dòng)物，75%的酒精浸泡10 min消毒，于超凈工作臺(tái)中分離脛骨及股骨，PBS反復(fù)沖洗3次。切取骨兩端，露出骨髓腔，用含有青霉素及鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)吹打，得到骨髓單細(xì)胞混懸液，1000 r/min低溫快速離心5 min，棄上清。用含有青霉素及鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，以細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的第3天首次換液，以后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細(xì)胞融合為單層細(xì)胞，密度約為80%左右時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，按照1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)[5]。

1.3.2 MSCs形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞培養(yǎng)的每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況并拍照保存。

1.3.3 藥物處理及實(shí)驗(yàn)分組：TSA溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜中，置于-20 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)共分為4組：TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(僅含磷酸鹽緩沖液和二甲基亞砜)。

1.3.4 MSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代MSCs以密度為5×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、CO2飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按上述TSA劑量分別加入各組中每天取1板進(jìn)行MTT檢測(cè)，連續(xù)1周。MTT檢測(cè)時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度值，選擇波長(zhǎng)為492 nm。按照檢測(cè)結(jié)果，以光吸收值為縱坐標(biāo)，以細(xì)胞生長(zhǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 MSCs體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞：MSCs培養(yǎng)到第3代，以1×109個(gè)/L的濃度接種于6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至密度為80%左右時(shí)，各孔加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑：1 mmol/L地塞米松、1 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mmol/L抗血酸，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入誘導(dǎo)液后每3 d換液1次，并設(shè)不加誘導(dǎo)劑的MSCs孔作為對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。

1.3.6 成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：在各組MSCs誘導(dǎo)分化給藥過程的第4、5、6天時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用0.04 g/L的蛋白酶E進(jìn)行消化，并收集細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ALP活性的測(cè)定，測(cè)定時(shí)用的9×10-2mol/L PNPP，其中反應(yīng)液的pH值為10.3，置于37 ℃反應(yīng)30 min，加0.1mol/L NaOH終止液終止反應(yīng)，于400 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 RT-PCR法檢測(cè)TSA對(duì)成骨細(xì)胞Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)水平的影響：MSCs體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后，按上述TSA劑量分組給藥，給藥后共培養(yǎng)5 d進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)。具體步驟：①細(xì)胞中總RNA提取，采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度，選擇A260/A280在1.8～2.0間的樣；②反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有樣的總RNA的濃度調(diào)整至500 mg/L，取2 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所有操作嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒步驟進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?；③PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)，體系為20 μL，包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL；正向引物(10 μmol/L) 0.8 μL；反向引物(10 μmol/L) 0.8 μL；ROX 參比染料(50×) 0.4 μL；cDNA模版2 μL；dH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)的延伸末收集熒光信號(hào)軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本中管家基因和目的基因的準(zhǔn)確含量，采用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所有引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 各引物序列Tab.1 The primer sequence

2 結(jié)果

2.1 MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下可見MSCs為圓形，大小不一，培養(yǎng)24 h后，開始貼壁，呈圓形，梭形，或多角形；5 d后，可見放射狀排列的細(xì)胞群，多為梭形，胞漿豐富，胞核大，核仁清晰。見圖1。

圖1 MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察圖(×1000)Fig.1 MSCs cell morphological observation(×1000)

2.2 MSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)相似，在MSCs接種給藥第1、2天為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期，而3～6 d曲線呈直線上升，則為MSCs的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第7天后曲線上升趨勢(shì)逐漸變得平緩，MSCs增殖速度明顯減慢，進(jìn)入平臺(tái)期。與對(duì)照組相比，TSA低劑量組的生長(zhǎng)曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均有顯著升高M(jìn)SCs生長(zhǎng)曲線的趨勢(shì)，有效增強(qiáng)了MSCs的擴(kuò)增能力(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同組的MSCs生長(zhǎng)曲線*P<0.05，與空白對(duì)照組比較Fig.2 Comparison of growth curve of MSCs in each group*P<0.05，compared with control group

2.3 成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定細(xì)胞活性 與對(duì)照組相比，TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)對(duì)MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中的第4、5、6天均可顯著提高ALP活性(P<0.05)。見表2。

組別TSA濃度4d5d6d空白組—2.218±0.3213.076±0.2223.339±0.105TSA低劑量組0.1μmol/L2.552±0.255*3.181±0.128*3.588±0.133*TSA中劑量組1μmol/L2.887±0.312**3.322±0.125**3.712±0.128**TSA高劑量組10μmol/L3.081±0.343**3.574±0.211**3.978±0.213**

*P<0.05，**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，compared with control group

2.4 RT-PCR法檢測(cè)TSA對(duì)成骨細(xì)胞Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)水平的影響 RT-PCR法檢測(cè)TSA對(duì)成骨細(xì)胞影響，結(jié)果表明，與空白組相比，TSA各劑量組可以顯著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別TSA濃度Cbfα1bFGFIGF-1空白組—2.786±0.3442.776±0.2532.329±0.176TSA低劑量組0.1μmol/L3.187±0.322*3.081±0.229*2.581±0.123*TSA中劑量組1μmol/L3.552±0.275**3.322±0.175**2.752±0.118**TSA高劑量組10μmol/L3.778±0.341**3.573±0.247**2.978±0.242**

*P<0.05，**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，compared with control group

3 討論

MSCs作為成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞，其分化成為成骨細(xì)胞的能力直接影響著骨質(zhì)疏松或者骨折的愈合能力，因此近年來關(guān)于促進(jìn)其分化為成骨細(xì)胞的藥物得到了醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，也是骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。TSA最初作為抗真菌藥物被人們所認(rèn)識(shí)，并很快得到了廣泛的應(yīng)用[6]。但最近研究還發(fā)現(xiàn)TSA是一種有效的、并特異性作用于組蛋白去乙酰化酶，它選擇性抑制Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白去乙?；福珜?duì)Ⅲ類組蛋白去乙?；覆o抑制作用[7-8]。TSA作為組蛋白去乙酰化酶的抑制劑，是通過阻斷組蛋白去乙?；傅淖饔猛?，發(fā)揮其對(duì)去乙?；囊种乒δ?，從而起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活過程的乙酰化與去乙?；瘎?dòng)態(tài)平衡作用[9-10]，目前較多研究將其用于各種腫瘤疾病的治療過程中。近期研究發(fā)現(xiàn)TSA參與到調(diào)節(jié)多種不同的細(xì)胞活動(dòng)中，如細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖[11]。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TSA顯著提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，TSA各劑量可以顯著提高成骨細(xì)胞中Cbfα1、bFGF及IGF-1mRNA的表達(dá)水平，而這些細(xì)胞因子與成骨細(xì)胞分化有著密切的聯(lián)系。Cbfα1為脊椎動(dòng)物成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過與成骨細(xì)胞上的特異順式作用元件結(jié)合從而激活骨鈣素的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)著大多數(shù)關(guān)鍵成骨細(xì)胞基因的表達(dá)水平，控制分化成骨細(xì)胞的成骨速率以及調(diào)節(jié)骨鈣素基因(EK5)表達(dá)，從而在成骨細(xì)胞分化過程中起到至關(guān)重要的作用[12-13]。bFGF通過多種信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞的數(shù)量及其活動(dòng)，對(duì)骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[14]。IGF-1是評(píng)價(jià)治療骨質(zhì)疏松癥藥物的重要指標(biāo)，它可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨基質(zhì)的合成，是骨中含量豐富的細(xì)胞因子。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TSA可顯著促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特化為成骨細(xì)胞，可能是通過上調(diào)Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的，提示TSA可開發(fā)為治療骨質(zhì)疏松癥以及促進(jìn)骨愈合的新藥，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] Svechnikova I,Almqvist PM,Ekstr?m TJ.HDAC inhibitors effectively induce cell type-specific differentiation in human glioblastoma cell lines of different origin[J].Int J Oncol,2008,32(4):821-827.

[2] Wu Y,Zhao RC,Tredget EE.Concise review:bone marrow-derived stem progenitor cells in cutaneous repair and regeneration[J].Stem Cells,2010.28(5):905-915.

參考文獻(xiàn)

[3] Noer A,Lindeman LC,Collas P.Histone H3 modifications associated with differentiation and long-term culture of mesenchymal adipose stem cells[J].Stem Cells Dev,2009.18(5):725-736.

[4] Marsoni SG,Damia G,Camboni G.A work in progress:the clinical development of histone deacetylase inhibitors[J].Epigenetics,2008.3(3):164-171.

[5] 李曉峰，趙勁民，蘇偉，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(10)：1721-1725.

[6] 李方方，鄭改煥，徐酉華，等.靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子siRNA對(duì)K562細(xì)胞凋亡及survivin表達(dá)的影響[J].中華血液學(xué)雜志，2009，30(12)：825-828.

[7] Philippe B,Luc S,Valérie PB,et al.Culture and Use of Mesenchymal Stromal Cells in Phase I and Ⅱ Clinical Trials[J].Stem Cells Int,2010,20(10):503-593.

[8] Li Z,Liu C,Xie Z,et al.Epigenetic dysregulation in mesenchymal stem cell aging and spontaneous differentiation[J].PLoS One,2011,6(6):e20526.

[9] Chen CQ,Chen CS,Chen JJ,et al.Histone deacetylases inhibitor trichostatin A increases the expression of Dleu2/miR-15a/l6-1 via HDAC3 in non-small cell lung cancer[J].Mol Cell Biochem,2013,383(1-2):137-148.

[10] Wang H,Li Q,Chen H.Genistein affects histone modifications on Dickkopf-related protein 1 (DKKl) gene in SW480 human colon cancer cell line[J].PLoS One,2012,7(7):e40955.

[11] Kawano T,Akiyama M,Agawa-Ohta M.et al.Histonedeacetylase inhibitors valproic acid and depsipeptidesenstitize retinoblastoma cells to radiotherapy by increasing H2AX phosphorylation and p53 a-cetylation-phosphorylation[J].Int J Oncol,2010,37(4):787-795.

[12] Gevorgyan A,Sukhu B,Alman BA,et al.Radiation effects and radioprotection in MC3T3-E1 mouse calvarialosteoblasticcells[J].PlastReconstr Surg,2008,122(4):1025-1035.

[13] Hofmann A,Ritz U,Hessmann MH,et al.Cell viability,osteoblast differentiation,and gene expression are altered in human osteoblasts from hypertrophic fracture non-unions[J].Bone,2008,42(29):894-906.

[14] Komaki H,Tanaka T,Chazono M,et al.Repair of segmental bone defects in rabbit tibiae using a complex of beta-tricalciumphosphate,type I collagen,and fibroblast growth factor-2 [J].Biomaterials,2006,27(29): 5118-5126.

(編校：吳茜 王儼儼)

Intervention effects of trichostatin A on specilization of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

YUAN Zhi-feng1,XU Guo-hua2,REN Li3

(1.Department of Orthopedics, The First People’s Hospital of Jingdezhen City, Jingdezhen 333000, China；2 .Department of Spine Surgery, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China; 3. Department of Orthopedics, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

ObjectiveTo explore the intervention effects of trichostatin A (TSA) on specialization of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs).MethodsThe rat MSCs were isolated,cultured and purified by the whole bone marrow adherent method in vitro, with morphological observation. The third generation of MSCs were selected, directional induced to osteoblasts, and divided into the TSA low dose group (0.1 μmol/L), middle dose group (1 μmol/L), the high dose group (10 μmol/L) according to different drug concentrations, seting up blank control group at the same time. MSCs proliferation and cell growth curve of each group were drawn by MMT, the activity of alkaliphosphatase (ALP) was detected, and the levels of corebinding factor α1 (Cbfα1), basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-like growth factors-1 (IGF-1) mRNA were detected by RT-PCR. Results The trend of MSCs growth curves in each groups were similar, compared with control group, the growth curve of TSA low dose group had no significant change, the TSA middle dose and high dose significantly promoted the proliferation of MSCs (P<0.05). Compared with control group, ALP activity of TSA low-, middle- and high-dose group were significantly higher at 4th,5th,6th(P<0.05). The expression levels of Cbfα1, bFGF and IGF-1mRNA were significantly higher than those of control group, respectively (P<0.05).ConclusionTSA can significantly promote the rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblast, which is possibly associated with up-regulation of Cbfα1, bFGF and IGF-1mRNA level.

trichostatin A;MSCs;corebinding factor α1;basic fibroblast growth factor;insulin-like growth factor-1

2011年浙江省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011KYA030)

袁志峰，男，主任醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：骨科臨床及基礎(chǔ)，E-mail：gzf13979850246@163.com。

R34

A

1005-1678(2015)03-0039-03