轉(zhuǎn)化生長因子-β1對(duì)大鼠心房、心室成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響

劉發(fā)金，肖驊，唐雪嬌，張磊

論 著

轉(zhuǎn)化生長因子-β1對(duì)大鼠心房、心室成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響

劉發(fā)金，肖驊，唐雪嬌，張磊

目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對(duì)大鼠心房、心室成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的不同影響，并探討其可能的分子機(jī)制。方法用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠原代心房、心室成纖維細(xì)胞，經(jīng)SABC免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定細(xì)胞，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①應(yīng)用羥脯氨酸消化法觀察不同濃度TGF-β1(0、5、10ng/ml)及不同作用時(shí)間(6、12、24、48h)對(duì)心房、心室成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量的影響。②用篩選的TGF-β1最佳干預(yù)濃度及作用時(shí)間分別刺激心房、心室成纖維細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)鑒定肌成纖維細(xì)胞后，采用羥脯氨酸法比較兩種細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)二者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)，Western blotting檢測(cè)二者Smad2/3、p-Smad2/3及Smad7蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果TGF-β1對(duì)大鼠心房、心室成纖維細(xì)胞均具有促進(jìn)膠原蛋白合成的作用，當(dāng)TGF-β1刺激條件為5ng/ml、24h時(shí)作用最強(qiáng)。用上述條件TGF-β1刺激心房、心室成纖維細(xì)胞，與對(duì)照組相比，心房成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，p-Smad2/3表達(dá)增加，Smad7表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組相比，兩組Smad2/3的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，p-Smad2/3的表達(dá)明顯升高，Smad7的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論TGF-β1能誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，可引起細(xì)胞膠原代謝異常，而且心房成纖維細(xì)胞中膠原代謝異常表現(xiàn)較心室成纖維細(xì)胞明顯，其機(jī)制可能與TGF-β1/SMAD信號(hào)通路相關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長因子β1；心房顫動(dòng)；膠原；Smads蛋白質(zhì)類

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常，結(jié)構(gòu)重構(gòu)被認(rèn)為是AF的發(fā)生和維持基礎(chǔ)，而心房纖維化是最主要的結(jié)構(gòu)重構(gòu)改變[1-3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)已被證實(shí)可誘發(fā)心肌細(xì)胞肥厚和心肌纖維化[4]，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)為表型標(biāo)志的肌成纖維細(xì)胞[5]。而肌成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如collagenⅠ、Ⅲ、纖連蛋白及彈性蛋白等促進(jìn)心肌纖維化[6]。研究發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)TGF-β1的轉(zhuǎn)基因小鼠，其心房的選擇性纖維化和AF易損性均增加[7-8]。本研究探索成纖維細(xì)胞在心臟基質(zhì)重構(gòu)及心房選擇性纖維化中的作用，并探索可能參與這一過程的Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，以期為AF抗纖維化治療的探索提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級(jí)2周齡SD大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重60～80g，雌雄不限。主要試劑：DMEM-F12(1:1)培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，重組人TGF-β1(美國Peprotech公司)，兔抗波形蛋白抗體(美國Proteintech公司)，兔抗Smad2、Smad3、p-Smad2(phospho S467)、p-Smad3 (phospho S423+S425)、Smad7抗體(美國Abcam公司)，兔抗α-SMA抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Abbkine公司)，羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成公司)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，蛋白裂解試劑盒、蛋白測(cè)定試劑盒(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 取SD大鼠2只，在無菌條件下開胸取心臟置于培養(yǎng)皿中，分離心臟及大血管等結(jié)締組織，采用4℃ 0.01mol/L PBS清洗分離的心房及心室組織，并將心房、心室組織剪成約1mm3大小種于6孔板中，5%CO2、37℃孵育約2～4h后加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3d換液一次，實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)的第3～5代細(xì)胞。采用波形蛋白免疫組化染色鑒定心肌成纖維細(xì)胞。中性樹膠封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察胞質(zhì)染色是否呈棕黃色并進(jìn)行純度計(jì)算。

1.2.2 篩選構(gòu)建心肌纖維化細(xì)胞模型的最佳條件

取第3代生長良好的心房、心室成纖維細(xì)胞，用20%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至80%～90%，換用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h。①篩選TGF-β1最佳刺激濃度，將心房、心室成纖維細(xì)胞分為3組：對(duì)照組(加入DMEM培養(yǎng)基干預(yù)24h)和5、10ng/ ml TGF-β1刺激組(分別加入終濃度為5、10ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基干預(yù)24h)。羥脯氨酸法檢測(cè)細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量。②用篩選出的最佳濃度的TGF-β1刺激心房、心室成纖維細(xì)胞不同時(shí)間，篩選最佳刺激時(shí)間，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及TGF-β1刺激組，分別加入DMEM及終濃度為5ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基干預(yù)6、12、24、48h，同樣用羥脯氨酸法檢測(cè)細(xì)胞上清液內(nèi)羥脯氨酸含量。

1.2.3 TGF-β1誘導(dǎo)心房、心室成纖維細(xì)胞膠原蛋白的差異表達(dá) 將心房、心室成纖維細(xì)胞分為4組。①心室成纖維細(xì)胞對(duì)照組：加入DMEM培養(yǎng)基作用24h；②心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組：加入終濃度為5ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基刺激24h；③心房成纖維細(xì)胞對(duì)照組：加入DMEM培養(yǎng)基作用24h；④心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組：加入終濃度為5ng/ ml TGF-β1培養(yǎng)基刺激24h。采用羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒、RT-PCR檢測(cè)膠原蛋白的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)α-SMA、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 和Smad7蛋白的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液羥脯氨酸含量檢測(cè) 采用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量，按操作說明書操作，最后在550nm處測(cè)各管吸光度(A)值。羥脯氨酸含量=(測(cè)定A值－空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值－空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá) 用RNA提取試劑(RNAiso plus)提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)不同引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列為：Ⅰ型膠原蛋白，上游5'-CGAGTATGGAAGCGAAGGT-3'，下游5'-CCACAAGCGTGCTGTAGGT-3'，產(chǎn)物長度230bp；Ⅲ型膠原蛋白，上游5'-CCACCCTGAACTC AAGAGC-3'，下游5'-TGAACTGAAAGCCACCATT-3'，產(chǎn)物長度212bp；β-actin，上游5'-AGATGACCCAGA TCATGTTTGA-3'，下游5'-TTGGCATAGAGGTCTT TA-3'，產(chǎn)物長度535bp。反應(yīng)體系25μl，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s、42℃(Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白)/58℃(β-actin)退火45s、72℃ 1min，循環(huán)35次；72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后，采用Quantity One系統(tǒng)分析電泳條帶的光密度值。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白的表達(dá) RIPA蛋白裂解液收集各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉后，加入1:1000稀釋的兔抗α-SMA、兔抗Smad2、兔抗Smad3、兔抗p-Smad2、兔抗p-Smad3和兔抗Smad7抗體，4℃過夜后，TBST洗膜3次，再加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，洗膜，DAB顯色，拍照。Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用Tukey檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 心臟成纖維細(xì)胞光鏡圖(×200)Fig.1 Morphology of cardiac fibroblasts under light microscope (×200)A, C. Atrial fibroblasts growth 3, 7 days; B, D. Ventricular fibroblasts growth 3, 7 days

圖2 原代成纖維細(xì)胞的鑒定(SABC ×200)Fig.2 Identification of the cardiac fibroblasts (SABC ×200)A. Atrial fibroblasts; B. Ventricular fibroblasts

圖3 不同濃度TGF-β1刺激心臟成纖維細(xì)胞后羥脯氨酸的表達(dá)Fig.3 Expression of hydroxyproline in cardiac fibroblasts induced by different concentration of TGF-β1A. Atrial fibroblasts; B. Ventricular fibroblasts; (1)P<0.05 compared with control group (0ng/ml)

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

2.1.1 倒置顯微鏡下成纖維細(xì)胞的觀察結(jié)果 成纖維細(xì)胞可于組織塊貼壁后24h開始長出，貼壁3d后細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞質(zhì)透明，中央有卵圓核，胞質(zhì)向外伸出突起，放射狀或蝸旋狀生長(圖1A、B)。第7～9天后組織塊間的細(xì)胞相互匯合、連接成片，甚至出現(xiàn)重疊生長(圖1C、D)。

2.1.2 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的鑒定 心肌細(xì)胞增殖能力低，故組織貼塊法培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞混雜生長。波形蛋白免疫組化染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，幾乎所有細(xì)胞的胞質(zhì)均呈棕黃色，蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，陽性率>99%(圖2)。

2.2 篩選TGF-β1刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞的最佳條件 刺激心房、心室成纖維細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量均明顯增加，濃度為5ng/ml時(shí)羥脯氨酸含量最高，說明TGF-β1能促進(jìn)大鼠心房、心室成纖維細(xì)胞分泌膠原，5ng/ml為最佳刺激濃度(圖3)。

TGF-β1刺激心房成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量較對(duì)照組明顯增加，刺激24h時(shí)細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量達(dá)到峰值(P<0.01，圖4A)，而TGF-β1促進(jìn)心室成纖維細(xì)胞羥脯氨酸的合成作用呈時(shí)間依賴性，但24h組與48h組羥脯氨酸的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)心房、心室成纖維細(xì)胞膠原蛋白的差異表達(dá)

2.3.1 心房、心室成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)變化 從上述實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果，將誘導(dǎo)條件TGF-β1(5ng/ml，24h)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與心房、心室成纖維細(xì)胞對(duì)照組相比，心房、心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組中α-SMA蛋白的表達(dá)均明顯增加(P<0.01)；與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組比較，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組α-SMA蛋白的表達(dá)升高(P<0.05，圖5)，提示心房成纖維細(xì)胞可能更易分化為肌成纖維細(xì)胞。

圖4 TGF-β1刺激心臟成纖維細(xì)胞不同時(shí)間羥脯氨酸的表達(dá)Fig. 4 Expression of hydroxyproline in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1at different time pointsA. Atrial fibroblasts; B. Ventricular fibroblasts. (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with control group (0ng/ml TGF-β1)

圖5 TGF-β1干預(yù)的各組成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)(Western blotting)Fig.5 Protein expression of α-SMA in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1in each group (Western blotting)1. Control group (ventricular fibroblasts); 2. TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts); 3. Control group (atrial fibroblasts); 4. TGF-β1stimulation group (atrial fibroblasts). (1)P<0.01 compared with control group; (2)P<0.05 compared with TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts)

2.3.2 心房、心室成纖維細(xì)胞中羥脯氨酸的差異表達(dá) 與心室成纖維細(xì)胞對(duì)照組(0.53±0.09)相比，心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組的羥脯氨酸表達(dá)量增加(0.74±0.10，P<0.05)，與心房成纖維細(xì)胞對(duì)照組(0.55±0.10)比較，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組羥脯氨酸的表達(dá)明顯增加(0.89±0.15，P<0.01)；與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組相比，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組的羥脯氨酸表達(dá)明顯升高(P<0.01)，提示TGF-β1促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的作用可能較心室成纖維細(xì)胞更強(qiáng)。

2.3.3 心房、心室成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的差異表達(dá) 與對(duì)照組相比，僅心房成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組相比，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01，圖6)。提示TGF-β1促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的作用較心室成纖維細(xì)胞更強(qiáng)。

2.3.4 心房、心室成纖維細(xì)胞Smad2/3、p-Smad2/3 和Smad7蛋白的差異表達(dá) 與對(duì)照組相比，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組p-Smad2/3表達(dá)明顯增加，Smad7表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組無明顯變化；與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組比較，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組p-Smad2/3表達(dá)明顯升高(P<0.01)，Smad7表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而Smad2/3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。結(jié)果提示，p-Smad2/3及Smad7可能參與了心房成纖維細(xì)胞對(duì)TGF-β1易感性。

3 討 論

AF是臨床上最常見的一種心律失常，隨年齡增長其發(fā)病率逐漸增加[9]。目前，雖然藥物和導(dǎo)管消融治療可使AF得到一定程度的控制，但藥物治療轉(zhuǎn)復(fù)率低，導(dǎo)管消融治療僅能用于部分患者[10]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)重構(gòu)是AF發(fā)生和發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，心房纖維化能顯著影響AF導(dǎo)管消融的療效[11]。針對(duì)AF心房重構(gòu)的抗重塑治療已引起人們的關(guān)注[12]。

圖6 TGF-β1干預(yù)后各組成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)(RT-PCR)Fig.6 mRNA expression of type Ⅰand Ⅲ collagen in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1in each group (RT-PCR)M. Marker; 1. Control group (ventricular fibroblasts); 2. TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts); 3. Control group (atrial fibroblasts); 4. TGF-β1stimulation group (atrial fibroblasts). (1)P<0.01 compared with control group; (2)P<0.01 compared with TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts)

圖7 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7蛋白的水平Fig.7 Western blotting analysis of the protein expression of Smad2/3, p-Smad2/3 and Smad7 in cardiac fibroblasts1. Control group (ventricular fibroblasts); 2. TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts); 3. Control group (atrial fibroblasts); 4. TGF-β1stimulation group (atrial fibroblasts). (1)P<0.01 compared with control group; (2)P<0.01 compared with TGF-β1stimulation group (ventricular fibroblasts)

AF的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與AF關(guān)系密切，心肌纖維化是最主要的結(jié)構(gòu)重構(gòu)改變。心肌纖維化是膠原合成與分解代謝失衡的結(jié)果[13]，特征是ECM蛋白的過度沉積，如Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，纖連蛋白等[14]。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是ECM產(chǎn)生的主要來源，可經(jīng)TGF-β1刺激后增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[15-16]。肌成纖維細(xì)胞合成ECM的能力顯著高于成纖維細(xì)胞，且可分泌多種促纖維化細(xì)胞因子?？梢姡衫w維細(xì)胞在心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

本研究通過觀察不同濃度TGF-β1作用不同時(shí)間對(duì)心房、心室成纖維細(xì)胞羥脯氨酸合成的影響，篩選出TGF-β1刺激濃度5ng/ml、作用24h對(duì)成纖維細(xì)胞的作用較強(qiáng)。TGF-β1是一種關(guān)鍵的致纖維化因子，是加速心房纖維化的主要因素之一[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，在風(fēng)濕性心臟病繼發(fā)的慢性AF患者中，TGF-β1的表達(dá)明顯上升[19]。原發(fā)性高血壓尤其是伴有靶器官損害的患者血清內(nèi)亦可見TGF-β1的明顯升高[20]。TGF-β1可以從4個(gè)獨(dú)立但同時(shí)進(jìn)行的途徑啟動(dòng)纖維化：①直接刺激ECM蛋白的合成；②通過減少蛋白酶表達(dá)，增加蛋白酶抑制劑的合成抑制基質(zhì)蛋白的降解；③調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞整合素的表達(dá)，從而提高細(xì)胞基質(zhì)之間相互作用；④通過自動(dòng)感應(yīng)顯著放大其生物作用[21]。TGF-β1因可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM而在體外實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，目前實(shí)驗(yàn)研究中TGF-β1的使用濃度多集中在5～10ng/ml，可見，篩選體外實(shí)驗(yàn)中TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的最佳條件，可以更好地建立心肌纖維化模型，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

本研究通過外源性添加TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞分化，在心房、心室成纖維細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)到α-SMA蛋白表達(dá)增加，表明TGF-β1能成功誘導(dǎo)心房、心室成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)，與心室成纖維細(xì)胞比較，α-SMA的表達(dá)在心房成纖維細(xì)胞內(nèi)顯著增加，提示心房成纖維細(xì)胞較心室成纖維細(xì)胞可能更易分化為肌成纖維細(xì)胞。心肌間質(zhì)膠原網(wǎng)絡(luò)主要是由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的Ⅰ、Ⅲ型膠原組成，其中Ⅰ型膠原約占總數(shù)的80%～85%，Ⅲ型膠原約占12%[22-23]，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，可以了解心臟成纖維細(xì)胞分泌的總膠原的表達(dá)情況，也可以間接反映Ⅰ、Ⅲ型膠原的蛋白水平。因此，用羥脯氨酸測(cè)試盒、RT-PCR對(duì)兩種細(xì)胞膠原蛋白的mRNA水平及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，同樣觀察到Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)在心房成纖維細(xì)胞內(nèi)增加更明顯。提示TGF-β1促進(jìn)膠原合成與分泌的能力在心房、心室成纖維細(xì)胞間存在差異，推測(cè)可能與心房成纖維細(xì)胞更易轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞有關(guān)。

TGF-β1/SMAD被認(rèn)為是AF結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)鍵信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的AF主要與p-Smad2和Smad7的改變有關(guān)。本研究用Western blotting檢測(cè)心房、心室成纖維細(xì)胞Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，僅心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組p-Smad2/3表達(dá)明顯增加，Smad7表達(dá)明顯下降；而Smad2/3的表達(dá)在心房、心室成纖維細(xì)胞中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與心室成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組比較，心房成纖維細(xì)胞TGF-β1刺激組p-Smad2/3的表達(dá)明顯增加，Smad7的表達(dá)明顯下降。我們發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以選擇性刺激心房成纖維細(xì)胞α-SMA，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，同時(shí)也選擇性影響心房成纖維細(xì)胞p-Smad2/3、Smad7的蛋白表達(dá)，提示p-Smad2/3及Smad7可能是TGF-β1選擇性促心房成纖維細(xì)胞合成α-SMA、膠原蛋白的重要信號(hào)分子，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將利用基因工程的方法進(jìn)一步予以證實(shí)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1構(gòu)建的心肌纖維化體外刺激模型中，心房成纖維細(xì)胞可能較心室成纖維細(xì)胞更易轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，繼而產(chǎn)生大量膠原蛋白參與細(xì)胞間質(zhì)重構(gòu)，提示心房成纖維細(xì)胞可能對(duì)TGF-β1的敏感性更強(qiáng)，這也許是心房纖維化易損性較高的原因，其機(jī)制可能與TGF-β1/SMAD信號(hào)通路有關(guān)。本研究有利于更好的理解AF的發(fā)病機(jī)理，也為探索中斷心房這種特異性反應(yīng)的干預(yù)治療措施提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Effect of TGF-β1on the expression of collagen in rat atrial and ventricular fibroblasts

LIU Fa-jin, XIAO Hua*, TANG Xue-jiao, ZHANG Lei
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: xiaohua197408@163.com

, E-mail: xiaohua197408@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81300140)

ObjectiveTo observe the effect of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) on the expression of collagen in rat atrial and ventricular fibroblasts, and to investigate its specific molecular mechanisms.MethodsTissue explant attachment was used to culture fibroblasts obtained from the atrium and ventricle of rat heart, and they were identified with SABC immunocytochemical staining, and then the following experiments were carried out. (1) Hydroxyproline digestion was performed to study the effects of TGF-β1, within different concentrations (0, 5, 10ng/ml) and different action time (6, 12, 24, 48h) on the content of hydroxyproline in rat's atrial and ventricular fibroblasts. (2) Rat's atrial and ventricular fibroblasts were stimulated with TGF-β1in optimal concentration and action time, the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) was determined with Western blotting, and the expressions of typeⅠand Ⅲ collagen mRNA were evaluated with reverse-transcription PCR. The contents of hydroxyproline in the respective cells were measured with hydroxyproline determination. Western blotting was used to measure the protein expression of Smad2/3, p-Smad2/3 and Smad7.Results(1) TGF-β1was shown to stimulate the collagen synthesis in rat's atrial and ventricular fibroblasts, and the optimal stimulus was TGF-β1concentration 5ng/ml with action time of 24h. (2) After being stimulated by optimal stimulation effect of TGF-β1, the expression of typeⅠand Ⅲ collagen and p-Smad2/3 increased, while that of Smad7 decreased significantly only in atrial fibroblasts (P<0.05), but not in ventricular fibroblasts. No statistical difference was found in the expression of Smad2/3 between the atrial and ventricular fibroblasts after being stimulated by TGF-β1under optimal stimulating conditions.ConclusionTGF-β1can induce dysbolism of collagen of cardiac fibroblasts with abnormal expression of cytoskeletal protein, which may occur more obviously in rat's atrial fibroblasts than in ventricular fibroblasts, and its mechanism may be related with TGF-β1/SMAD pathway.

transforming growth factor beta 1; atrial fibrillation; collagen; Smad proteins

R541.75

A

0577-7402(2015)07-0540-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.06

2015-03-12；

2015-05-29)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81300140)

劉發(fā)金，碩士研究生。主要從事心房顫動(dòng)機(jī)制的研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科(劉發(fā)金、肖驊、唐雪嬌、張磊)

肖驊，E-mail：xiaohua197408@163.com