不同感染途徑HIV患者治療后的耐藥突變及影響因素分析

路新利，康現(xiàn)江，趙宏儒，趙翠英，王偉，白廣義，李巖，陳素良

不同感染途徑HIV患者治療后的耐藥突變及影響因素分析

路新利，康現(xiàn)江，趙宏儒，趙翠英，王偉，白廣義，李巖，陳素良

目的分析河北省不同感染途徑的HIV患者治療后基因突變情況及其相關(guān)影響因素。方法采集正在接受抗病毒治療的HIV患者血漿，采用基因型檢測(cè)法檢測(cè)HIV-1 pol區(qū)突變基因并分析其耐藥性。結(jié)果266例患者中157例發(fā)生了基因突變，耐藥發(fā)生率59.0%。266例患者中高度耐藥發(fā)生率為NVP 65.8%(175/266)、3TC 41.7%(111/266)、FTC 41.7%(111/266)、EFV 30.1%(80/266)、DDI 5.6%(15/266)、D4T 4.1%(11/266)、AZT 3.0%(8/266)、ABC 3.0%(8/266)。經(jīng)血感染的HIV患者耐藥發(fā)生率高于性途徑和母嬰途徑，但χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示這3種途徑之間在NNRTIs編碼區(qū)Y181C、K103N、V108I、K101E等主要突變位點(diǎn)(χ2=4.796，P=0.531)，NRTIs編碼區(qū)M184V/I、M41L、T215F、T215Y(χ2=5.261，P=0.511)，PIs編碼區(qū)A71V/T、L10I、M46L、Q58E(χ2=6.150，P=0.407)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OR值計(jì)算和95%CI分析表明，患者年齡、感染途徑、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、初始治療方案與HIV-1耐藥突變的發(fā)生存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論在HIV治療過程中應(yīng)適時(shí)進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞、病毒載量和耐藥監(jiān)測(cè)，評(píng)估疾病進(jìn)程，使引起耐藥的相關(guān)因素的影響降到最低，并及時(shí)更新治療方案。

HIV；抗病毒藥；突變

河北省自1989年發(fā)現(xiàn)首例艾滋病感染者以來(lái)，經(jīng)過20世紀(jì)90年代局部地區(qū)的疫情暴發(fā)，感染途徑已經(jīng)從單一的傳播模式發(fā)展到目前的血液傳播、性傳播、母嬰傳播共存，以性傳播為主[1]。治療模式開始是自費(fèi)治療，2003年國(guó)家開始執(zhí)行免費(fèi)抗病毒治療后，隨著治療范圍的擴(kuò)大和藥物使用頻率的提高，造成通過這些途經(jīng)感染的患者體內(nèi)HIV-1 RNA基因位點(diǎn)發(fā)生適應(yīng)性變異，產(chǎn)生耐藥毒株，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的臨床和流行病學(xué)問題[2-3]。本研究對(duì)正在參加抗病毒治療的266例患者體內(nèi)HIV-1 RNA pol區(qū)位點(diǎn)突變進(jìn)行分析，以了解河北省轄區(qū)內(nèi)不同感染途徑的HIV患者的耐藥情況和相關(guān)影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 招募河北省內(nèi)正在參加抗病毒治療的艾滋病患者，采集其EDTA抗凝全血10ml，取50μl進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)檢測(cè)，余分離血漿后行病毒載量(VL)檢測(cè)。選取266例病毒載量≥1000拷貝/ml的患者行血漿耐藥基因型檢測(cè)，并調(diào)查個(gè)人基本情況及治療情況。

1.2 CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)和HIV載量測(cè)定 采用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀(FACSCount)和美國(guó)Roche公司COBAS AMPLlCOR自動(dòng)載量?jī)x及其配套試劑盒，分別測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和HIV-1載量。

1.3 HIV-1 RNA提取及耐藥基因型檢測(cè) 采用基因型檢測(cè)法對(duì)病毒載量≥1000拷貝/ml的HIV患者進(jìn)行HIV-1基因型檢測(cè)。提取HIV-1 RNA，通過兩輪聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，PCR陽(yáng)性結(jié)果交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。采用Contig Express軟件做序列拼接處理原始核苷酸序列，參照測(cè)序圖譜進(jìn)行基因序列修訂后，直接進(jìn)入Web站點(diǎn)http://hivdb.stanford.edu進(jìn)行耐藥性分析[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)。

2 結(jié) 果

2.1 HIV-1 RNA位點(diǎn)突變結(jié)果 266例患者中共發(fā)現(xiàn)157例體內(nèi)的HIV-1 RNA產(chǎn)生了針對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTIs)或蛋白酶抑制劑(PIs)的位點(diǎn)突變，耐藥發(fā)生率為59.0%(157/266)。266例患者中高度耐藥發(fā)生率為NVP 65.8%(175/266)、3TC 41.7%(111/266)、FTC 41.7%(111/266)、EFV 30.1%(80/266)、DDI 5.6%(15/266)、D4T 4.1%(11/266)、AZT 3.0%(8/266)、ABC 3.0%(8/266)，具體情況見表1。

表1數(shù)據(jù)顯示，在反轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)，與核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)相關(guān)的突變位點(diǎn)中，HIV-1 RNA pol區(qū)位點(diǎn)184、215、41突變率位居前三，突變頻率依次為41.7%、19.2%、10.2%，其中有3例患者出現(xiàn)了TAMS突變，2例患者出現(xiàn)了Q151M復(fù)合體突變；與非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)相關(guān)的突變位點(diǎn)中，基因突變率在前三位的位點(diǎn)為103、181和108位點(diǎn)，突變頻率依次為22.9%、21.4%、9.0%。在蛋白酶編碼區(qū)，共有54例患者發(fā)生位點(diǎn)突變，包括主要突變V32AV、Q58E、M46IM、M46L和次要突變L10I、A71V/T(表2)。同時(shí)，在發(fā)生突變的各主要位點(diǎn)中，血液途徑感染HIV者發(fā)生基因突變的頻率高于經(jīng)性途徑和母嬰途徑感染的HIV患者，例如在NNRTIs編碼區(qū)，經(jīng)血感染患者Y181C的耐藥突變頻率為11.7%，高于經(jīng)性途徑(8.3%)和母嬰傳播(1.5%)者，具體如表1、表2所示。但χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示這三種途徑之間在NNRTIs編碼區(qū)Y181C、K103N、V108I、K101E等主要突變位點(diǎn)(χ2=4.796，P=0.531)，NRTIs編碼區(qū)M184V/I、M41L、T215F、T215Y(χ2=5.261，P=0.511)，PIs編碼區(qū)A71V/T、L10I、M46L、Q58E(χ2=6.150，P=0.407)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 耐藥相關(guān)影響因素分析 結(jié)果顯示，年齡、治療時(shí)間、感染途徑、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、初始治療方案與HIV-1的耐藥性存在相關(guān)性(P<0.05)，具體情況如表3所示。

表1 HIV-1 RNA反轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)位點(diǎn)突變[例(%)]Tab.1 Locus mutations in HIV-1 RNA reverse transcriptase coding region [n(%)]

表2 HIV-1 RNA蛋白酶編碼區(qū)耐藥突變[例(%)]Tab.2 Tolerance mutations in HIV-1 RNA protease coding regions [n(%)]

表3 HIV患者耐藥相關(guān)影響因素分析Tab.3 Influencing factors related to drug-resistance among HIV/AIDS

3 討 論

本研究顯示，此次檢測(cè)對(duì)象中有59.0%的患者不同程度地對(duì)PIs或RIs產(chǎn)生了耐受性，低于河南的70.8%～72.3%[5-6]，高于Frentz等[7]的同類報(bào)道，且不同感染途徑的HIV患者體內(nèi)HIV-1 RNA位點(diǎn)突變頻率存在差異。HIV-1 RNA pol區(qū)基因位點(diǎn)突變(表1、2)使患者對(duì)治療方案中的所有藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐受性[8-9]，提示我們長(zhǎng)期使用某一種藥物或某一種治療方案易使基因發(fā)生適應(yīng)性突變，造成藥物的治療效果降低。同時(shí)部分患者對(duì)ABC、FTC、NFV、TPV/r、ETR等未使用過的藥物也產(chǎn)生了耐受性，分析原因可能是這些患者感染了傳播性耐藥毒株或者自然變異所致。但是有些位點(diǎn)突變不會(huì)引起耐藥，例如蛋白酶編碼區(qū)的位點(diǎn)71突變頻率高達(dá)15.8%，然而該位點(diǎn)突變與V32AV和L10I一樣沒有引起任何PIs藥效降低或失效，在一些情況下這些位點(diǎn)突變和一些藥物的耐受性密切相關(guān)[10]。

本研究對(duì)血漿中核酸含量大于1000拷貝/ml的病例進(jìn)行耐藥性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同傳播途徑感染HIV的患者體內(nèi)HIV-1 RNA pol區(qū)位點(diǎn)突變頻率存在差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。無(wú)論是蛋白酶編碼區(qū)上46、58、72位點(diǎn)還是反轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)上41、103、181、184等位點(diǎn)，通過血液感染艾滋病的患者發(fā)生耐藥的頻率均大于性傳播和母嬰傳播，這與河北省1989年以來(lái)傳播途徑的變化有關(guān)，2005年以前發(fā)現(xiàn)的感染者主要是經(jīng)血傳播者，這部分患者治療較早，2005年以后經(jīng)性接觸感染者占優(yōu)勢(shì)，經(jīng)血液和母嬰傳播趨勢(shì)下降[1]，參加治療的患者以性接觸者為主，可以推測(cè)血液感染者治療時(shí)間長(zhǎng)是導(dǎo)致耐藥突變率上升的原因，也證明了治療時(shí)間是影響耐藥發(fā)生的主要相關(guān)因素。另外，OR值計(jì)算和95%CI分析也表明其他因素如患者年齡、感染途徑、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、初始治療方案與HIV-1耐藥突變的發(fā)生存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。

本研究結(jié)果提示我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)HIV/AIDS患者的耐藥性監(jiān)測(cè)和檢測(cè)，監(jiān)控耐藥變異情況，使引起耐藥的相關(guān)因素的影響降到最低，并適時(shí)更新治療方案，以獲得較好的療效。

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Drug resistance mutations and their influencing factors in the patients infected with HIV-1 through different routes after antiretroviral therapy

LU Xin-li1, KANG Xian-jiang1*, ZHAO Hong-ru2, ZHAO Cui-ying2, WANG Wei2, BAI Guang-yi2, LI Yan2, CHEN Su-liang2*1College of Life Sciences, Hebei University, Baoding, Heibei 071002, China
2Disease Prevention and Control Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050021, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding authors. KANG Xian-jiang, E-mail: xjkang@hbu.edu.cn; CHEN Su-liang, E-mail: hebeicdc2013@sina.com

s. KANG Xian-jiang, E-mail: xjkang@hbu.edu.cn; CHEN Su-liang, E-mail: hebeicdc2013@sina.com

ObjectiveTo analyze HIV-1 drug resistance mutations and relative factors in the patients infected with HIV-1 through different routes after having

highly active anti-retroviral therapy (HAART) in Hebei province.MethodsPlasma samples were collected from patients who were infected with HIV through different routes. Detection of HIV-1 RNA pol region was carried out by detection of genotype, and HIV drug resistance mutations were analyzed.ResultsAmong 266 patients, 157 developed mutation. The rate of the drug-resistance was 59.0%. Among 266 patients, drug-resistance rates were ranked from high to low as follows:NVP 65.8% (175/266), 3TC 41.7% (111/266), FTC 41.7% (111/266), EFV 30.1% (80/266), DDI 5.6% (15/266), D4T 4.1% (11/266), AZT 3.0% (8/266) and ABC 3.0% (8/266). The drug-resistance rate of blood infection patients was much higher than that of sexual and mother-to-child transmission ones, butχ2-test indicated that the differences in main mutation sites (Y181C, K103N, V108I, K101E in NNRTIS coding region, M184V/I, M41L, T215F, T215Y in NRTIs coding region and A71V/ T, L10I, M46L, Q58E in PIs coding region) were not statistically significant (P>0.05) among the patients infected through three routes. The results ofORvalue and the 95% confidence interval (CI) indicated that age, infection routes, CD4+cell count and initial therapeutic plan had a significant relevance to HIV-1 drug resistance mutation (P<0.05).ConclusionTimely monitor of CD4+cell number, viral load and drug resistance, and evaluation of progression of AIDS, are essential to minimize the influence of related factors on drug resistance, and to renew the therapeutic plan in time during HAART in order to enhance the therapeutic effects.

HIV; antiviral agents; mutation

R512.91

A

0577-7402(2015)07-0591-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.16

2014-12-26；

2015-06-10)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

路新利，博士研究生。主要從事艾滋病的防治工作

071002 河北保定 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(路新利、康現(xiàn)江)；050021 石家莊 河北省疾病預(yù)防控制中心(趙宏儒、趙翠英、王偉、白廣義、李巖、陳素良)

康現(xiàn)江，E-mail：xjkang@hbu.edu.cn；陳素良，E-mail：hebeicdc2013@sina.com