拉帕替尼誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡觀察

屠彥紅，李娜，高士秀，肖鶴，宋若會(huì)

拉帕替尼誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡觀察

屠彥紅，李娜，高士秀，肖鶴，宋若會(huì)

目的探討拉帕替尼對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法采用CCK-8法檢測(cè)拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響，PI染色后以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)分子Cyclin D1、P21和P53的mRNA表達(dá)水平，Western blotting檢測(cè)Cyclin D1、P21、P53及凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1和Bax的表達(dá)，利用Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3/7酶活性。結(jié)果拉帕替尼呈劑量依賴性地抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Cyclin D1并上調(diào)P21、P53 mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)Mcl-1和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)caspase-3/7激活。結(jié)論拉帕替尼可有效抑制人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)其凋亡，可作為治療鼻咽癌的潛在藥物。

拉帕替尼；鼻咽腫瘤；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。盡管鼻咽癌的治療和早期診斷已取得顯著進(jìn)展，但Ⅲ期和Ⅳ期患者的預(yù)后依然很差，局部區(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的兩大主因[1]。因此，尋找新的對(duì)鼻咽癌安全有效的治療藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)同屬于表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體家族。其中，EGFR與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌等均伴隨EGFR的過(guò)表達(dá)。此外，在大約30%的乳腺癌和卵巢癌患者體內(nèi)檢測(cè)到HER2基因增高或過(guò)表達(dá)。近年研究證實(shí)，超過(guò)30%的鼻咽癌患者體內(nèi)HER2過(guò)表達(dá)，且與預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快相關(guān)[2-3]。拉帕替尼(lapatinib)是一類口服的雙靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑，同時(shí)作用于EGFR和HER2兩個(gè)靶點(diǎn)[4]，目前在臨床上與卡培他濱(capecitabine)合并用于治療經(jīng)一線藥物治療失敗的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌[5]，但在鼻咽癌中的研究尚處于起步，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z，研究拉帕替尼對(duì)該細(xì)胞系增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 細(xì)胞系CNE-2Z購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。拉帕替尼購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；化合物儲(chǔ)存液用DMSO配制，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋，使DMSO終濃度不超過(guò)0.05%；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；碘化丙啶(PI)、RNAase購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；Annexin V-FITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；Z-VAD-FMK、Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；抗Cyclin D1、P21、P53、Mcl-1和Bax等單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司；GAPDH抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶顯色底物ECL購(gòu)自Cell Signaling公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；DNM-9602G型酶標(biāo)儀購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司；微孔板熒光檢測(cè)儀(Wallac Victor)購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer公司；定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將CNE-2Z細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代1次。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，加新鮮含10%血清培養(yǎng)液180μl，對(duì)照組加入含0.05% DMSO的培養(yǎng)液20μl，藥物處理組加入不同濃度的拉帕替尼溶液各20μl，使終濃度分別為1.56、3.13、6.25、12.5、25、50及100μmol/L，其中DMSO含量不超過(guò)0.05%。同時(shí)設(shè)立調(diào)零組(無(wú)細(xì)胞組)，加入200μl培養(yǎng)液。培養(yǎng)48h后加入10μl CCK-8孵育2h，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm處讀取吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=[(A藥物處理組－A調(diào)零組)/ (A對(duì)照組－A調(diào)零組)]×100%。繪制劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×105/ml密度接種于6孔板中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5、25μmol/L，空白對(duì)照組給予等體積的DMSO。培養(yǎng)24h后，離心收集細(xì)胞(500g×5min)，70%冰乙醇4℃固定過(guò)夜，細(xì)胞離心棄上清，PBS溶液洗滌2次，加入100μl(1mg/ml) RNase A酶，37℃處理30min，PI(100μg/ml)染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Annexin V/PI雙標(biāo)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理同1.4。培養(yǎng)48h后，離心收集單細(xì)胞懸液(500g×5min)，PBS洗滌1次，每個(gè)樣品中加入100μl Annexin V-FITC，室溫孵育15min，加入400μl PI(50μg/ml)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 Caspase-3/7活性檢測(cè) Caspase-3/7活性檢測(cè)按Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入100μl含Z-DEVD-羅丹明110的caspase-3/7緩沖液，培養(yǎng)板置室溫避光反應(yīng)2h，用微孔板熒光檢測(cè)儀測(cè)定在激發(fā)光波長(zhǎng)485nm、發(fā)射光波長(zhǎng)535nm處的熒光值。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)分子mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞，以2×105/ml密度接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5μmol/L，空白對(duì)照組加入相同含量的DMSO。24h后離心收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用分光光度法測(cè)濃度，按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，各目的基因及內(nèi)參基因GAPDH的引物見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，收集熒光，39個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。采用比較循環(huán)閾值法(2–ΔΔCt)分析各組中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Tab.1 Primers used in real-time quantitative PCR

1.8 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞，以2×105/ml密度接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5μmol/L，空白對(duì)照組加入相同含量DMSO。24h后離心收集細(xì)胞，加入裂解緩沖液冰浴15min，4℃ 12 000×g離心10min后取上清測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃下變性7min。每份樣品取20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h后加入一抗4℃過(guò)夜。TBST洗脫3次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，TBST洗脫3次，每次10min?；瘜W(xué)發(fā)光劑ECL孵育顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察，CNE-2Z細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為多角形或短梭形。經(jīng)拉帕替尼處理后，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞質(zhì)透亮度下降，部分細(xì)胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。上述變化隨著拉帕替尼作用濃度的增加而加重(圖1)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的拉帕替尼處理CNE-2Z細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用，拉帕替尼濃度越高，其增殖抑制效應(yīng)越強(qiáng)，呈明顯的劑量依賴性(圖2)。48h的IC50為13.96±1.05μmol/L。

圖1 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞形態(tài)的影響(比例尺=400μm)Fig.1 Effect of lapatinib on the morphology of CNE-2Z cells (bar=400μm)

圖2 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of lapatinib on the proliferation of CNE-2Z cells

2.2 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(6.25～25μmol/L)的拉帕替尼作用于CNE-2Z細(xì)胞24h后，G0/G1期細(xì)胞比例均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，S期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)，但對(duì)G2/M期細(xì)胞比例沒(méi)有明顯影響，提示拉帕替尼誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生顯著的G0/ G1期周期阻滯(表2、圖3)。

2.3 拉帕替尼誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙標(biāo)法分析拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，12.5和25μmol/L拉帕替尼處理細(xì)胞48h，細(xì)胞凋亡率隨著拉帕替尼的濃度增高而增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明較高濃度拉帕替尼可顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖4)。

表2 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z 細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells (%,±s,n=3)

表2 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z 細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells (%,±s,n=3)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group

Group G0/G1 S G2/M Control 45.05±6.88 41.81±7.39 13.14±3.17 Lapatinib(μmol/L) 6.25 73.99±4.72(2) 17.60±4.99(2) 8.41±1.07 12.5 68.63±8.26(1) 16.83±3.52(2) 14.54±4.74 25.0 68.87±7.55(1) 16.66±5.19(2) 14.46±2.77

2.4 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的影響 拉帕替尼處理CNE-2Z細(xì)胞后，采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控因子的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)，而P21和P53 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01，圖5)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度拉帕替尼處理后CNE-2Z細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平明顯降低，而P21和P53蛋白表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)可見(jiàn)促凋亡分子Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，而抗凋亡分子Mcl-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖6)。

圖3 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells

圖4 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Lapatinib induced apoptosis in CNE-2Z cellsA. Measurement of apoptosis in CNE-2Z cells; B. Statistic analysis of apoptosis rate; (1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group (0μmol/L lapatinib)

圖5 拉帕替尼對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Lapatinib regulated mRNA expression of cell cycle related moleculars A. Cyclin D1; B. P21; C. P53; (1)P＜0.01 compared with control group (0μmol/L lapatinib)

2.5 拉帕替尼對(duì)CNE-2Z細(xì)胞caspase-3/7酶活性的影響 采用Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒檢測(cè)caspase-3/7激酶活性變化，結(jié)果顯示，CNE-2Z細(xì)胞經(jīng)拉帕替尼處理24h后，隨著藥物濃度的增高，caspase-3/7酶活性逐漸增強(qiáng)，其中12.5～25μmol/L拉帕替尼作用后caspase-3/7酶活性與對(duì)照組比較明顯升高(P＜0.01，圖7)。

圖6 拉帕替尼對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Lapatinib regulated protein expression of cell cycle and apoptosis related moleculars

圖7 拉帕替尼對(duì)Caspase3/7酶活性的影響Fig.7 Measurement of caspase 3/7 activation by kinase activity assay(1)P＜0.01 compared with blank control group (0μmol/L)

3 討 論

EGFR和HER2及其相關(guān)下游信號(hào)通路的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，許多新型靶向治療藥物均是通過(guò)抑制這兩種受體的活性而發(fā)揮抗癌作用的。拉帕替尼通過(guò)同時(shí)靶向抑制EGFR 和HER2及其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤活性，目前在臨床上用于聯(lián)合卡培他濱治療HER2過(guò)度表達(dá)且既往接受過(guò)包括蒽環(huán)類、紫杉醇、曲妥珠單抗(赫賽汀)治療的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌[5]。此外，拉帕替尼還對(duì)胰腺癌、食管癌等其他腫瘤具有明顯的抑制作用[6-7]。國(guó)外研究也證明拉帕替尼具有抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)拉帕替尼可顯著抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。Cyclin D1是周期蛋白家族中重要的調(diào)控因子。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，Cyclin D1與CDK4/6結(jié)合并激活CDK4/6為細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期所必需[9]。P21是一種細(xì)胞周期抑制蛋白，可通過(guò)抑制CDK4/6-Cyclin D復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯。此外，P21是抑癌基因P53的下游信號(hào)分子，P53可以轉(zhuǎn)錄激活P21基因，調(diào)控P21的表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示，拉帕替尼可能通過(guò)降低Cyclin D1表達(dá)，并引起P21和P53的表達(dá)上調(diào)，從而使CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度拉帕替尼能誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bcl-2家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其抗凋亡成員和促凋亡成員之間可競(jìng)爭(zhēng)性形成同源或異源二聚體(如Bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax等)而決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[11]。Mcl-1和Bax分別是Bcl-2家族中重要的凋亡抑制蛋白和凋亡促進(jìn)蛋白，研究表明下調(diào)Mcl-1或(和)上調(diào)Bax可以引起腫瘤細(xì)胞凋亡[12-13]。此外，Bcl-2家族成員可通過(guò)線粒體內(nèi)外膜上的蛋白間接或直接影響線粒體途徑凋亡的發(fā)生，并激活caspase家族，產(chǎn)生caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行細(xì)胞凋亡[14]；而caspase-3/7是caspase家族中的主要凋亡執(zhí)行者，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼可顯著下調(diào)Mcl-1蛋白的表達(dá)，并增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)激活caspase-3/7，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，拉帕替尼能顯著抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期相關(guān)分子Cyclin D1、P21和P53以及細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白Bax和Mcl-1均可能參與了上述過(guò)程，該結(jié)果為拉帕替尼臨床治療鼻咽癌提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Lapatinib induced cell cycle arrest and apoptosis in CNE-2Z cells

TU Yan-hong1, LI Na2, GAO Shi-xiu1, XIAO He2, SONG Ruo-hui1*1Department of Otorhinolaryngology, First Hospital Affiliated to Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China
2Institute of Basic Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: song_0515@126.com

, E-mail: song_0515@126.com
This work was supported by the Fund of Anhui "Twelfth Five-Year" TCM Clinical Academic and Technological Lead Talents Training (2011-539)

ObjectiveTo explore the effect of lapatinib on the cell cycle and apoptosis of human CNE-2Z nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells, and to study the related mechanisms. Methods CCK-8 assay was used to assess the proliferation of CNE-2Z cells treated by lapatinib. After PI staining, the cell cycle distribution was determined by flow cytometry. Apoptosis was analyzed using Annexin V/PI double binding assay. The mRNA expression of cell cycle related molecular Cyclin D1, P21 and P53 was assessed with real time PCR. The expression of protein Cyclin D1, P21, P53, and apoptosis related protein Mcl-1 and Bax was determined by Western blotting. The enzymatic activity of caspase-3/7 was measured by using Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit. Results Lapatinib inhibited the proliferation of CNE-2Z cells in a dose-dependent manner. Various concentrations of lapatinib induced significant G0/G1phase arrest and promoted apoptosis of CNE-2Z cells. Lapatinib significantly down-regulated Cyclin D1 expression, but up-regulated P21 and P53 expression at mRNA and protein levels. Lapatinib also induced down-regulation of Mcl-1 with up-regulation of Bax protein expression, and activated Caspase-3/7 in CNE-2Z cells. Conclusion Lapatinib may effectively inhibit proliferation, induce cell cycle arrest and promote apoptosis of CNE-2Z cells, so it may serve as a potent therapeutic agent against nasopharyngeal carcinoma.

lapatinib; nasopharyngeal carcinoma; cell cycle; apoptosis

R739.6

A

0577-7402(2015)07-0568-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.11

2015-03-11；

2015-05-07)

(責(zé)任編輯：李恩江)

安徽省“十二五”中醫(yī)臨床學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人才培養(yǎng)對(duì)象基金(2011-539)

屠彥紅，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事鼻、咽喉疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療

230031 合肥 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科(屠彥紅、高士秀、宋若會(huì))；100850 北京 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所(李娜、肖鶴)

宋若會(huì)，E-mail:song_0515@126.com