大孔樹脂純化飛龍掌血總生物堿的工藝研究

劉思藝

【摘 要】 目的：[SS]對(duì)大孔樹脂純化飛龍掌血總生物堿的工藝條件進(jìn)行初步探索。方法：[SS]采用紫外-可見分光光度法，以總生物堿吸附率、解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過考察樹脂類型、原料液質(zhì)量濃度、p值、上樣體積流量、解吸溶劑及繪制樹脂靜態(tài)吸附平衡曲線、泄露曲線，綜合評(píng)判優(yōu)化工藝。結(jié)果：[SS]AB-8樹脂富集純化效果較好，其對(duì)飛龍掌血總生物堿的適宜吸附和解吸條件為：吸附原料液質(zhì)量濃度為02g/ml，p 值為.0～6.0，上樣體積流量為3BV/h；解吸先用2BV水除雜，再依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脫。結(jié)論：[SS]AB-8樹脂可用于飛龍掌血總生物堿的純化，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 可飛龍掌血；總生物堿；大孔樹脂；純化

【中圖分類號(hào)】R96 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-817（201）1-0013-02

龍掌血又名見血飛，為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血（oddalia asiatica Lam）的干燥根或根皮，始載于《植物名實(shí)圖考》，是貴州苗族習(xí)用藥材。其味辛，微苦，性溫；入肝、肺經(jīng)。臨床主要用于感冒、胃氣痛、胸脅痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、勞傷吐血、瘡癤腫痛、毒蛇咬傷、外傷出血等[1-2]。現(xiàn)代研究表明其具有抗A型流感病毒活性、抑制白色念珠菌、痢疾桿菌等細(xì)菌、抗心肌缺血等作用[3-6]，研究前景廣闊?？偵飰A作為其一個(gè)有效部位群，占藥材分離物的4.% [7]，有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性[8-9]，目前尚無優(yōu)選飛龍掌血總生物堿富集純化研究的報(bào)道。酸性染料比色法可對(duì)總有效部位進(jìn)行含量測(cè)定，已有用于飛龍掌血提取物中總生物堿含量的測(cè)定[10]。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察7種大孔樹脂對(duì)飛龍掌血總生物堿的吸附、解吸性能，并對(duì)篩選出的AB-8樹脂的純化工藝做進(jìn)一步的研究，確定了適宜的吸附、解吸的工藝條件。[JP]

1 材料與儀器

1.1 儀器 WFZ UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司）；XS22A 型分析天平（瑞士普利賽斯公司）；GKC21CR4型可控硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）；MD200-2型氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試劑與材料 檸檬酸固體、溴百里香草酚藍(lán)、十二水磷酸氫二鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙醇、甲醇（天津市百世化工有限公司）；三氯甲烷（衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司）；氫氧化鈉（廣州市海珠區(qū)化學(xué)試劑廠）；無水硫酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），所用試劑均為分析純。DA-201、NKA-II、DM-301、DM-130、NKA-9、AB-8、D-101大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）。

1.3 藥品 鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：0713-200208，中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；飛龍掌血藥材購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)周勁松副教授鑒定為蕓香科植物飛龍掌血oddalia asiatica Lam的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法[10]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取小檗堿對(duì)照品適量，精密稱足，置稱足量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1ml含小檗堿0μg的對(duì)照的溶液。精密吸取濃度為0μg·ml-1小檗堿對(duì)照品溶液3.0ml，空氣吹干后精密加入酸性染料溶液4.0ml及4.0ml緩沖液，用10.0ml氯仿萃取，加少量無水硫酸鈉吸水。

2.1.2 陰性溶液的制備 精密吸取酸性染料溶液4.0ml及緩沖溶液4.0ml，加10.0ml氯仿萃，加少量無水硫酸鈉吸水。

2.1.3 供試品溶液的制備 按單因素考察和正交試驗(yàn)得出的提取方法，取飛龍掌血藥粉（40目）約10g，2倍量7%乙醇，7℃水浴回流提取40 min，提取液濃縮至無醇味，取上清液，稀釋至適宜的質(zhì)量濃度，備用。精密吸取原液。經(jīng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附后藥液適量，20ml量瓶中按對(duì)照品溶液的制備方法項(xiàng)下操作。

2.1.4 波長(zhǎng)選擇 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液進(jìn)行全掃描，記錄吸收曲線，對(duì)照品和供試品的吸收曲線形狀一致，均在波長(zhǎng)418nm處有最大吸收，陰性溶液無干擾，故選擇418nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液（0μg·ml-1）0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6ml于錐形瓶中，自“空氣吹干按“對(duì)照品溶液的制備方法操作，418nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.044X+0.00，r=0.9991。線性范圍2.87～22.91μg·ml-1

2.1.6 測(cè)定方法 精密吸取原液、經(jīng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附后藥液適量，置20ml量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項(xiàng)下操作，計(jì)算總生物堿的量。

2.2 樹脂的篩選

2.2.1 樹脂的預(yù)處理 分別取上述7種大孔吸附樹脂，在使用前一晚用蒸餾水浸泡洗至無醇味，備用。

2.2.2 堿靜態(tài)吸附率比較 精密稱取各樹脂2.g（濕重），置10ml具塞三角瓶中，加入制備好的樣品溶液（0.4g/mL）20ml，置于恒溫?fù)u床中振搖24h后，測(cè)定樣品液中總生物堿含量，計(jì)算樹脂吸附率。上述7種樹脂吸附后，依次加入水10mL、7%乙醇2ml×2次，置于恒溫?fù)u床中依次振搖24h，測(cè)定各解吸液中總生物堿含量，計(jì)算解吸率。結(jié)果見表1。綜合考慮吸附率和解吸率，選用AB-8型大孔樹脂作為總生物堿純化的載體。

2.3 AB-8型大孔樹脂純化飛龍掌血總生物堿工藝參數(shù)

2.3.1 濃度對(duì)樹脂吸附率的影響 取預(yù)處理樹脂適量（相當(dāng)于干樹脂約1.0g），精密稱定，分別加入0.2、0.4、0.6 g/ml的樣品液20.0ml，置于恒溫?fù)u床中振搖24h，測(cè)定樹脂的靜態(tài)吸附率，吸附率分別為7.62%，0.00%，4.2%。因此飛龍掌血總生物堿的最佳吸附濃度為0.2g/ml。

2.3.2 p值對(duì)樹脂吸附率的影響 將濃度0.2g/ml樣品溶液調(diào)成p值為4.0、.0（原液）、6.0、7.0和8.0的溶液，分別精密吸取20.0ml，置裝有預(yù)處理樹脂（相當(dāng)于干樹脂約1.0g）的具塞三角瓶中，恒溫?fù)u床中振搖24h，測(cè)定樹脂的靜態(tài)吸附率，分別是79.24%、82.94%、83.29%、80.82%、79.14%，上樣液最佳p值為.0～6.0，用原藥液上樣即可。

2.3.3 樹脂靜態(tài)吸附平衡曲線的測(cè)定 取預(yù)處理樹脂適量（相當(dāng)于干樹脂約1.0g），精密稱定，加入濃度0.2g/ml樣品液20ml，置于恒溫?fù)u床中振搖，分別于0.、1、2、3、4、6、8、12、24h取樣，測(cè)定AB-8大孔樹脂對(duì)總生物堿的吸附率，以吸附率對(duì)時(shí)間作圖，繪制AB-8樹脂對(duì)總生物堿的靜態(tài)吸附平衡曲線。由圖1可知，吸附4h后樹脂對(duì)總生物堿吸附率基本不再變化，說明AB-8型樹脂對(duì)總生物堿的吸附速度較快，4h即達(dá)到吸附平衡。

2.3.4 流速對(duì)樹脂吸附量的影響 將等量的0.2g/ml樣品液分別以1.0、2.0、3.0、4.0、.0 BV/h的流速通過樹脂層析柱，考察不同流速對(duì)樹脂吸附量的影響。結(jié)果吸附量依次為88.34、87.66、87.82、84.9、74.77mg/g，表明AB-8型樹脂對(duì)總生物堿的最佳吸附流速為3BV/h。

2.3. 總生物堿在AB-8樹脂上的泄露曲線 將0.2g/ml的樣品溶液加到AB-8樹脂層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，流速3BV/h，按保留體積分段收集流出液，并測(cè)定各段流出液中總生物堿的濃度，以流出液中總生物堿濃度對(duì)上樣體積作圖，繪制泄露曲線。由圖2可知，第 9個(gè)保留體積液中總生物堿明顯增多，說明上樣至第8個(gè)保留體積時(shí)總生物堿開始明顯泄漏。綜合考慮，選擇上樣量為8BV。

2.3.6 洗脫方法的考察 向充分吸附飛龍掌血提取液后的AB-8大孔樹脂中加入2BV水，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，測(cè)定水解析液中總生物堿含量。再向水解吸后樹脂中依次加入各BV不同濃度的乙醇（10%、20%、30%、40%、0%、60%、70%），同法操作，測(cè)定醇解析液中總生物堿的含量，結(jié)果見表2。考慮成本，確定洗脫方法為水洗脫后，依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脫。

2.4 工藝驗(yàn)證 根據(jù)上述確定的樹脂類型和工藝條件，用3根樹脂柱同時(shí)進(jìn)行純化試驗(yàn)，初步確定飛龍掌血生物堿純化工藝為：采用AB-8大孔樹脂，濕法裝柱，上樣藥材濃度為0.2g/ml，p 值 .0～6.0，藥材與干樹脂質(zhì)量之比為 2.3∶1，室溫下以 3.0 BV/h 的體積流速進(jìn)行吸附飽和。解吸時(shí)，先以2BV 的水洗脫（棄去），再依次用BV 10%、20%、30%、40%、0%、60%乙醇洗脫。吸附率80.27%，解吸率為72.87%，生物堿純度從9.1%提高至為39.09%，工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本文圍繞大孔樹脂純化的“上樣-吸附-洗脫步驟進(jìn)行考察，設(shè)定的工藝參數(shù)便于實(shí)際操作與應(yīng)用。醇解吸前先用水洗脫雜質(zhì)、色素等，但水對(duì)飛龍掌血生物堿有一定的解吸作用，為了生物堿收率需要控制洗脫用水量。其結(jié)果表明試驗(yàn)方案證可行，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

在酸性染料法測(cè)總生物堿含量的操作時(shí)應(yīng)注意避光，且不同p對(duì)結(jié)果影響較大。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)緩沖溶液的p值進(jìn)行了考察，配制p分別為4、4.、、.的緩沖溶液，在其他條件相同時(shí)對(duì)同提取液進(jìn)行萃取分離，檢測(cè)其含量，結(jié)果顯示當(dāng)p為.時(shí)總生物堿的含量最高，所以嚴(yán)格控制水相p為.。

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（收稿日期：201.04.20）