Box—Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選金櫻子提取工藝

江迎春等

摘要：目的 篩選金櫻子提取工藝。方法 以金櫻子總皂苷、總酚酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，Design-Expert8.0.5軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立多元二次回歸方程，篩選金櫻子提取工藝參數(shù)。結(jié)果 篩選出金櫻子的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度62.79%，料液比13.12∶1，提取時(shí)間137.93 min，提取次數(shù)1.85次，考慮到實(shí)際操作方便及工業(yè)大生產(chǎn)的實(shí)用性，將提取工藝參數(shù)修訂為乙醇濃度60%，料液比13∶1，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次。結(jié)論 本研究篩選出的參數(shù)可為金櫻子的提取工藝提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金櫻子；總皂苷；總酚酸；提取工藝；Box-Behnken響應(yīng)面法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.027

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0099-04

Optimization of Extraction Process of Effective Constituents from Rosae Laevigatae Frustus by Box-Behnken Response Surface Method JIANG Ying-chun， DENG Chong， LI Jing-li （School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

Abstract：Objective To screen extraction process for Rosae Laevigatae Fructus. Methods With the content of total saponins and total phenolic acids from Rosae Laevigatae Fructus as the evaluation indexes， ethanol concentration， extraction time， solid-liquid ratio and extraction times as investigation factors， the test data were analyzed by Design-Expert8.0.5 software， and a multiple quadratic regression equation was set up to screen extraction process parameters of Rosae Laevigatae Fructus. Results The best extraction process parameters of Rosae Laevigatae Fructus were as follows：ethanol concentration was 62.79%；solid-liquid ratio was 13.12∶1；the extraction time was 137.93 min；extraction times were 1.85 times. Considering the convenience for actual operation and the practicability of industrial production， the extraction process parameters should be ethanol concentration of 60%， revised solid-liquid ratio of 13∶1， 2 hours extracting time， and 2 extraction times. Conclusion Final selected parameters provide the basis for the extraction process of Rosae Laevigatae Fructus.

Key words：Rosae Laevigatae Fructus；total saponins；total phenolic acids；extraction process；Box-Behnken response surface method

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa Laevigata Mickx.的干燥成熟果實(shí)，其味酸、澀，性平，具有固精縮尿止帶、澀腸止瀉的功效[1]。金櫻子可作為利尿劑、鎮(zhèn)咳劑，也可用于皮膚腫瘤、燒燙傷、神經(jīng)衰弱、高血壓、神經(jīng)性頭痛、慢性腎炎等的治療[2]。金櫻子含有多糖、皂苷、三萜、黃酮類、有機(jī)酸等多種化合物，其中金櫻子皂苷、酚酸具有廣泛的生理活性，如溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇等作用[3]。本試驗(yàn)以金櫻子總皂苷、總酚酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，

通訊作者：鄧翀，E-mail：fmmudz217@126.com

采用Box-Behnken響應(yīng)面法，篩選金櫻子乙醇回流提取工藝參數(shù)，為金櫻子的提取工藝提供進(jìn)一步參考。

1 儀器與試藥

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司），SQ8200HD型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司），GB204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.1 mg），UV-1102紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

金櫻子藥材購(gòu)于西安萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng)，經(jīng)本院王薇副教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物金櫻子Rosa Laevigata Mickx.的干燥成熟果實(shí)。沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-200302），齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)130742-201058），所有試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總酚酸、總皂苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg、齊墩果酸對(duì)照品9.90 mg，分別配成0.20、0.99 g/L的對(duì)照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定金櫻子粉末各約5 g，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取，合并濾液，濃縮揮干，用不同濃度乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，4 ℃保存待用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液30、50、60、80、90、100 ?L，分別置10 mL具塞刻度試管中，加乙醇至2 mL，加0.3%十二烷基磺酸鈉0.8 mL及0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）6]（1∶1）混合溶液0.4 mL，混勻，暗處放置5 min，加0.1 mol/L HCl溶液至刻度，混勻，暗處放置20 min[4]，以顯色劑為空白對(duì)照，在744 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=39.608X+0.019 0，r2=0.999 1，表明沒(méi)食子酸在0.006～0.020 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取對(duì)照品溶液 0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于10 mL具塞試管中，70 ℃水浴揮干，精密加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸溶液0.8 mL，搖勻，60 ℃恒溫水浴加熱 15 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，以顯色劑為空白對(duì)照[5]，分別在545 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.947 2X-0.032 7，r2=0.999 6，表明齊墩果酸在0.297～0.792 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 分別精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液90 ?L、齊墩果酸對(duì)照品溶液0.7 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，RSD分別為0.08%、0.08%，結(jié)果表明精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次粉碎后的金櫻子6份，各約5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、齊墩果酸RSD分別為0.25%、0.24%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液50 ?L，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、齊墩果酸的RSD分別為0.26%、0.67%，表明供試品溶液在1 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液30 ?L、齊墩果酸對(duì)照品溶液80 ?L，加入已知含量的供試品溶液中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率分別為103.35%±6.30%、105.57%±3.66%，RSD（n=5）分別為0.58%、1.19%。表明該方法回收率符合規(guī)定。

2.1.8 含量測(cè)定 精密量取金櫻子供試品溶液50 ?L，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算供試品中總酚酸、總皂苷含量。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及中藥材的傳統(tǒng)提取經(jīng)驗(yàn)，確定回流提取的考察因素為提取次數(shù)、乙醇濃度、提取時(shí)間和溶劑倍量[6]進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert8.0.5b軟件，各因子編碼值、試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。按其選擇的因素和水平進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾，定容于25 mL量瓶，作為供試品溶液。取供試品溶液適量，測(cè)定總酚酸、總皂苷含量，平行測(cè)定3次。以含量最大值為100分，計(jì)算其他含量值占最大值的比例。依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求、文獻(xiàn)記載和以往研究基礎(chǔ)分析[7]，制定加權(quán)系數(shù)各為0.5，綜合評(píng)分=（Xi1/max1×0.5+Xi2/max2×0.5）×100。其中，Xi1代表總酚酸平均值中的第i個(gè)值，Xi2代表總皂苷平均值中的第i個(gè)值，max1代表總酚酸最大值，max2代表總皂苷最大值。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。利用Design-Expert8.0.5b軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到金櫻子綜合評(píng)分對(duì)乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）的多元二次回歸模型方程：綜合評(píng)分=79.33-21.70A+10.51B+2.22C+13.02D-1.87AB-11.14AC+4.82AD+5.67BC-7.05BD-7.66CD-16.34A2-7.51B2-3.75C2-4.50D2，r2=0.8655。

方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，在本試驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，整體模型達(dá)到極顯著水平（P=0.000 6），乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取次數(shù)（D）對(duì)總得率有極顯著影響，二次項(xiàng)中的A2的偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平，其他各項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均未達(dá)到顯著水平?；貧w方程的失擬檢驗(yàn)不顯著（P=0.737 0），說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。擬合檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了金櫻子綜合得率與提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇濃度和液料比的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)金櫻子綜合提取得率隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，應(yīng)用Design-Expert8.0.5b軟件繪制考察指標(biāo)與影響較顯著的3個(gè)自變量的等高線圖，見(jiàn)圖1。圖1a顯示在提取時(shí)間為137.93 min、提取次數(shù)為1.85條件下乙醇濃度與料液比對(duì)金櫻子總提取率的影響。金櫻子總提取率與乙醇濃度、料液比基本呈二次關(guān)系，當(dāng)乙醇濃度在62%左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。圖1b顯示在提取時(shí)間為137.93 min、料液比為13.12條件下乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)金櫻子總提取量的影響。提取次數(shù)對(duì)金櫻子總提取量的影響呈近似二次關(guān)系，在提取次數(shù)為2次左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。圖1c顯示在提取次數(shù)為1.85、料液比為13.12條件下乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)金櫻子總提取率的影響。當(dāng)乙醇濃度在62%左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。圖1d顯示在提取時(shí)間為137.93 min、乙醇濃度62%條件下料液比和提取次數(shù)對(duì)金櫻子總提取率的影響。當(dāng)料液比在13左右、提取次數(shù)在2次左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。圖1e顯示在提取次數(shù)為1.85、乙醇濃度62%條件下料液比和提取時(shí)間對(duì)金櫻子總提取量的影響。當(dāng)料液比在13左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。圖1f顯示在料液比為13.12、乙醇濃度62%條件下提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)金櫻子總提取率的影響。當(dāng)提取次數(shù)在2次左右時(shí)，金櫻子總提取率達(dá)到最大值。

由回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，金櫻子綜合得率最大預(yù)測(cè)值為97.29。根據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表4，偏差率為0.25%。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件重復(fù)性好。

3 討論

目前，采用正交試驗(yàn)來(lái)研究金櫻子提取工藝的報(bào)道較多[8-10]。本試驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法，以金櫻子總皂苷、總酚酸含量為綜合指標(biāo)，從整體化學(xué)成分角度篩選金櫻子提取工藝參數(shù)，體現(xiàn)了中藥化學(xué)成分多樣化的特征，更具有科學(xué)性和合理性。

結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，金櫻子最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度62.79%，料液比13.12∶1，提取時(shí)間137.93 min，提取次數(shù)1.85次?？紤]到實(shí)際操作方便及工業(yè)大生產(chǎn)的實(shí)用性，將提取工藝參數(shù)修訂為：乙醇濃度60%，料液比13∶1，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次。在此條件下，金櫻子理論提取率為97.29%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，金櫻子平均提取率為97.54%，偏差率為0.25%，說(shuō)明該模型可靠。

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（收稿日期：2015-01-14；編輯：陳靜）