人抑癌基因NKX2-3真核表達載體的構建及其對腫瘤細胞生長的作用

馮瀅瀅，郭靖，劉家宏，徐小潔，張云靜，陳云萍，葉棋濃，趙克

1.第二炮兵總醫(yī)院 結直腸肛門外科，北京 100088；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850；

3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤一科，北京 100048；4.解放軍180醫(yī)院 內3科，福建 泉州 362000

NK2轉錄因子相關基因位點3（NKX2-3）是同 源結構域轉錄因子NKX家族中的重要成員，可調節(jié)細胞特異性基因的表達，參與組織分化和發(fā)育[1-3]。研究顯示NKX2-3不僅影響腸道免疫炎癥反應，是炎性腸?。↖BD）相關性基因[4-5]，而且可能通過調節(jié)Wnt信號通路實現(xiàn)調節(jié)細胞增殖、生長及腫瘤形成等作用，從而參與散發(fā)性和IBD相關結直腸癌的發(fā)病[6]。因此，我們決定構建帶Flag標簽的NKX2-3真核表達載體，并探討其對結腸癌、肝癌細胞生長的影響，為后續(xù)研究做準備。

1 材料和方法

1.1 材料

人結腸癌HCT-116細胞系、人肝癌HepG2細胞系、人胚腎293T細胞系、大腸桿菌DH5α、帶Flag標簽的pcDNA3.0載體由本室傳代培養(yǎng)；人乳腺文庫由本室保存；限制性內切酶，T4DNA連接酶為TaKaRa公司產品；PCR回收試劑盒、質粒提取、膠回收試劑盒為Promega公司產品；VigoFect為威格拉斯生物技術有限公司產品；胎牛血清、DMEM為Gibco公司產品；引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；測序由北京博邁德生物技術有限公司完成；HRP標記的小鼠抗Flag M2標簽單克隆抗體為Sigma公司產品。

1.2 Flag-pcDNA3.0-NKX2-3重組質粒的構建與測序

根據(jù)在NCBI網(wǎng)站查詢的NKX2-3編碼序列（NC_000010.11）合成上游引物（5'-CGGGATCCAT GATGTTACCAAGCCCGGTCA-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGCTACCAGGCCCGGATGCCCTGC-3'），PCR擴增人NKX2-3的編碼序列（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸150 s，30個循環(huán)；72℃再延長7 min），4℃保存，膠回收試劑盒回收PCR產物；用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切帶Flag標簽的pcDNA3.0載體，經(jīng)37℃、12 g/L瓊脂糖凝膠電泳4 h后，膠回收載體大片段；將PCR片段用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶與帶Flag標簽的pcDNA3.0載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，振蕩培養(yǎng)后對菌液PCR鑒定陽性的提取質粒，經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送北京博邁德生物技術有限公司測序。

1.3 轉染人胚腎293T細胞和Western印跡檢測

將人胚腎293T細胞接種于2塊6 cm皿中，皿中載有含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種量以轉染時70%～80%的細胞密度為宜，轉染前1 h 換液。將 4 μL VigoFect與 200 μL NaCl溶液混合，靜置 5 min；期間將 10 μg重組質粒與 200 μL NaCl溶液混合，輕柔吹打混勻后將上述2種溶液混勻，室溫靜置15 min后均勻加入6 cm皿中，同法轉染Flag-pcDNA3.0載體作為對照；37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液，24 h后收取細胞，3000 r/min離心5 min，棄上清，加2倍細胞量的RIPA，冰上裂解20～30 min，繼續(xù)加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水煮15 min，12 000 r/min離心 2 min，取上清液進行SDS-PAGE，再電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，用HRP標記的抗Flag標簽鼠單克隆抗體室溫孵育1 h，抗體用5%脫脂奶粉1∶5000稀釋，1×TBST洗膜3次，5 min/次；化學發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影。

1.4 生長曲線實驗

Flag-pcDNA3.0-NKX2-3 質粒分別轉染 HCT-116、HepG2細胞24 h后，與轉染Flag-pcDNA3.0空載體的對照HCT-116、HepG2細胞同時以3000/孔的密度接種于5塊96孔板，每組設3個復孔，每孔含培養(yǎng)基100 μL，分別在第0、1、2、3、4 d同一時間吸棄原培養(yǎng)基，加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，37℃、5%CO2孵育1 h，測定D450nm值。以培養(yǎng)時間為橫軸、D450nm值平均值為縱軸繪制生長曲線。

2 結果

2.1 Flag-pcDNA3.0-NKX2-3重組質粒的構建與鑒定

根據(jù)NCBI查詢的NKX2-3編碼序列合成上、下游引物后PCR擴增人NKX2-3的編碼序列，獲得長約1080 bp的DNA片段，與預期一致（圖1）。將PCR產物用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與同樣經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切的Flag-pcDNA3.0載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶1080 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認為是帶有人NKX2-3基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1080 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結果（圖3）。DNA序列測定結果表明，插入的DNA序列與人NKX2-3基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

圖1 PCR擴增人NKX2-3的編碼序列M：DL2000 DNA marker；1：PCR擴增產物

圖2 重組質粒Flag-pcDNA3.0-NKX2-3的菌液PCR結果電泳圖譜M：DL2000 DNA marker；1：陰性對照（無模板的PCR擴增）；2：以乳腺文庫為模板PCR擴增的陽性對照；3～5：Flag-NKX2-3的1～3號克隆的菌液PCR結果

2.2 Western印跡檢測Flag-NKX2-3在293T細胞中的表達

將構建的Flag-NKX2-3重組質粒和空載體分別轉染293T細胞系，24 h后提蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測Flag-NKX2-3蛋白的表達。結果如圖4所示，轉染重組質粒后，F(xiàn)lag-HRP抗體在相對分子質量約43×103處檢測到明顯特異性條帶，而空載體無條帶，說明Flag-NKX2-3能夠在293T細胞系中正確表達，而空載體不表達。

2.3 CCK8法檢驗Flag-NKX2-3對腫瘤細胞系生長的抑制作用

有研究顯示，NKX2-3基因主要有調節(jié)細胞增殖、生長及腫瘤形成的作用。我們將Flag-NKX2-3真核表達載體及Flag-pcDNA3.0載體轉染結腸癌HCT-116細胞系、肝癌HepG2細胞系，用CCK8法檢測細胞生長曲線。結果如圖5所示，NKX2-3能抑制這2種細胞的生長。

3 討論

NKX2-3作為NKX同源轉錄因子家族成員，主要表達于腸道和脾臟中胚層起源的組織細胞，如腸道黏膜固有層和黏膜下層的微血管內皮細胞以及平滑肌細胞，在脾臟和腸道集合淋巴結中可影響B(tài)細胞成熟和T細胞依賴性免疫反應。NKX2-3缺陷小鼠實驗揭示了NKX2-3在脾臟、小腸形成和發(fā)展中的重要作用，以及對黏膜定居因子細胞黏附分子1（MADCAM-1）的重要意義[1,7-9]，許多研究也證實其在炎性腸病發(fā)病中舉足輕重的作用[5,10]。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)NKX2-3能抑制結腸癌HCT-116細胞、肝癌HepG2細胞的生長，可能是一個抑癌基因。這與近幾年的研究結果相符。

Phiel曾在2001年報道NKX2-3可能在平滑肌肉瘤形成中發(fā)揮作用[11]。2008年Wang報道NKX2-3在散發(fā)性腸癌患者癌組織中較正常組織低表達，可能是一個抑癌基因[12]。轉錄因子可以調節(jié)下游基因，2009年Yu發(fā)現(xiàn)NKX2-3在Crohn病患者病變腸道組織中高表達[13]，于是他在2株腸癌細胞株（散發(fā)性結腸癌細胞株和炎性腸病相關性腸癌細胞株）中篩選檢測所有受NKX2-3影響的基因,發(fā)現(xiàn)分別有1677和1375個基因受其調控,其中至少7個基因是Wnt信號通路上的，Wnt信號通路的失調是結腸癌形成機制中的重要事件，推測NKX2-3通過調節(jié)Wnt信號通路參與了炎性腸病相關的腸癌和散發(fā)性腸癌的發(fā)病過程[6]。同年，Leja在研究胃腸道神經(jīng)內分泌腫瘤過程中也發(fā)現(xiàn)NKX2-3在肝轉移癌組織中的表達比在正常腸黏膜組織和原發(fā)腫瘤組織中明顯低，推測NKX2-3可能參與了腫瘤的侵襲轉移過程[14]。

圖3 重組質粒Flag-NKX2-3的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切電泳圖譜M：DL2000 DNA marker；1：空載體Flag-pcDNA3.0-NKX2-3；2：重組質粒Flag-NKX3-2

圖4 Western印跡檢測Flag-NKX2-3蛋白的表達1：轉染空載體質粒的293T細胞；2：轉染重組質粒Flag-NKX2-3的293T細胞

圖5 NKX2-3抑制腫瘤細胞生長

除此之外，Yu在2011年的另一項研究中再次證實受NKX2-3調節(jié)的基因至少有1000個，涉及眾多信號通路，其中最重要的有G蛋白偶聯(lián)受體通路、ERK/MAPK信號通路、VEGF-PI3K/AKT通路，參與了免疫炎性反應，血管形成，細胞的增殖、生長和腫瘤形成，代謝過程，細胞黏附、轉移等，并且證實NKX2-3的下調激活了MAPK信號通路[15]。這和我們的實驗結果一致，也解釋了NKX2-3抑制腫瘤細胞生長可能與抑制MAPK通路有關，但還須進行深入研究。

綜上所述，NKX2-3是一個與癌癥關系密切的多功能抑癌基因。我們構建的Flag-NKX2-3重組質粒在真核細胞中獲得了表達，易于檢測，表達的NKX2-3蛋白能夠抑制結腸癌、肝癌細胞的生長，與文獻報道一致，這為進一步了解NKX2-3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制奠定了基礎。

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