順鉑聯(lián)合鴉膽子油乳對人卵巢癌裸鼠原位移植瘤生長的影響

趙楠，韓鳳娟，王桂媛，李玉花

1.黑龍江中醫(yī)藥大學 附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040

順鉑是中心以二價鉑同2 個氯原子和2 個氨分子結合的重金屬絡合物，具有較強的廣譜抗癌作用，可抑制DNA的復制過程，高濃度時抑制RNA及蛋白質合成。臨床上順鉑可以與多種抗腫瘤藥協(xié)同作用，且無交叉耐藥特點，為當前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一，一般多用于生殖系統(tǒng)腫瘤如卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌，頭頸部癌如鼻咽癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌，對肺癌、乳腺癌等也有一定的功效。鴉膽子油乳由中藥鴉膽子［Brucea javanica（L.）Merr.］干燥的成熟果實提取的脂肪油經乳化作用制成，其主要活性成分油酸及亞油酸具有很強的抗癌活性，與腫瘤細胞膜有特異的親和力[1]，能抑制腫瘤細胞的DNA合成。研究表明，鴉膽子油乳作為臨床應用較廣的一種中藥，對多種惡性腫瘤細胞均具有誘導凋亡的作用，并可逆轉多種癌細胞的多藥耐藥，臨床上多采用鴉膽子油乳作為逆轉劑與常用抗癌藥合用治療產生耐藥性的腫瘤。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c（nu/nu）裸小鼠，雌性，鼠齡4～8 周，體重18～22 g，SPF 級，購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心［合格證號：11400700054740］，恒溫（25℃±2℃）、恒濕（45%～50%）飼養(yǎng)于無菌實驗室的凈化空氣層流架中。人卵巢癌SKOV3 細胞株購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院；鴉膽子油乳劑購自浙江九旭藥業(yè)公司，10 mL/支；順鉑購自山東齊魯制藥廠，50 mL/支；新生胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Sigma 公司；二甲亞颯（DMSO）購自北京化學試劑廠；DAB 顯色試劑盒、兔抗人整合素α5、MRP-1/CD9免疫組化試劑盒、免疫組化SP 試劑盒均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 人卵巢癌細胞株的培養(yǎng)

人卵巢癌SKOV3 細胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，在98%相對濕度、37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。常規(guī)消化收集處于對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)活細胞數(shù)，讀出細胞濃度，將細胞分裝入離心管，12 000 r/min 離心5 min，去其上清液，并調整細胞濃度為（1～3）×107/mL。

1.3 腫瘤動物模型的建立

常規(guī)消毒裸鼠，將濃度為1×107/mL 的SKOV3 細胞0.2 mL 注射于裸鼠后背部皮下，待接種成功的原代接種瘤生長至直徑1～1.5 cm，頸椎脫臼法處死裸鼠，剝取皮下腫瘤浸入4℃的生理鹽水中漂洗，并切成1 mm3大小。常規(guī)麻醉、消毒裸鼠，將準備好的皮下腫瘤組織小塊小心放置在卵巢破口深處，滴注適量醫(yī)用生物蛋白膠固定，觀察有無出血，逐層關腹。

1.4 動物給藥及處理

裸鼠接種2 周后，測得裸鼠的體重為18～24 g，給予藥物干預。用隨機數(shù)字表將32 只裸鼠完全隨機分為4組，每組8只，分別為空白對照組、鴉膽子油乳組、順鉑組和鴉膽子油乳順鉑聯(lián)合組。空白對照組給予生理鹽水0.2 mL/只，鴉膽子油乳組給予鴉膽子油乳0.2 mL/20 g，順鉑組給予順鉑0.2 mL（按3 mg/kg計算），聯(lián)合組給予鴉膽子油乳注射液0.2 mL/20 g 加順鉑0.2 mL。每隔3 d 給藥1 次，共計腹腔給藥6次。

1.5 實驗觀察指標

1.5.1 移植瘤裸鼠生長情況 每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動、飲食、排便、對外界的反應等，以及移植瘤表面有無紅腫及破潰面，其大小、形態(tài)、質地、硬度、活動度，并觸及有無搏動。

1.5.2 移植瘤生長參數(shù)測定 ①腫瘤體積測量：移植瘤裸鼠處死后剝瘤塊取出腫瘤組織，電子天平稱重，并用游標卡尺測量瘤體最長徑（a/mm）與最短徑（b/mm），根據公式V=ab2/2計算腫瘤體積。②腫瘤抑制率檢測：腫瘤抑瘤率（%）=（1-治療組腫瘤組織平均重量/空白組腫瘤組織平均重量）×100%。③相對腫瘤增殖率（T/C）的計算：相對腫瘤增殖率（T/C）=（TRTV/CRTV）×100%。TRTV 為治療組相對腫瘤體積，CRTV為陰性對照組相對腫瘤體積，RTV（相對腫瘤體積）=V/V0（V0為給藥前腫瘤體積，V為處死前腫瘤體積）。療效評價標準：T/C＞60%為無效；T/C≤60%，并經統(tǒng)計學處理P＜0.05為有效。

1.5.3 血細胞指標檢測 末次給藥后將各組裸鼠眼眶取血后處死，收集血液于EP 管中，加入肝素抗凝劑，取300μL用血細胞分析儀檢測白細胞及血小板數(shù)目；取500μL 靜置30 min，離心取血清，檢測各組裸鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、血肌酐（CR）的變化。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據分析，計量資料用x±s 表示，進行正態(tài)性及方差齊性分析，兩組間均數(shù)使用獨立樣本t檢驗，兩組用藥前后使用配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用多重比較LSD 法。以α=0.05 為檢驗水準，P＜0.05 視為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SKOV3裸鼠移植瘤模型的建立

觀察發(fā)現(xiàn)，一般接種2～3 d 后裸鼠后背即可出現(xiàn)界限清晰、質地柔軟的“假瘤樣”皮下結節(jié)；1～2 周后部分移植瘤表面出現(xiàn)破潰，部分可見血管；當移植瘤直徑達1.5 cm 后，腫瘤生長速度逐漸減慢，裸鼠精神萎靡、消瘦、厭食、怕光、煩躁，一般生存期為37～42 d。

2.2 卵巢癌SKOV3原位腫瘤的形成

移植原位腫瘤后常規(guī)飼養(yǎng)裸鼠。一般可見，移植28 d 后原位腫瘤生長速度減慢，荷瘤鼠逐漸表現(xiàn)出消瘦、萎靡、厭食等癥狀。剖腹探查原位腫瘤的形成，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑為1.0～2.0 cm，有1 只發(fā)生腸系膜腹腔轉移。見圖1。

2.3 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響

給藥前各組裸鼠腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著治療天數(shù)的增加，治療結束后，各組裸鼠腫瘤體積產生明顯差異，各治療組與對照組相比差異顯著（P＜0.01），說明鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組均可有效遏制腫瘤細胞生長（表1）。

2.4 不同藥物對SKOV3 裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較

鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組的抑瘤率分別為23.56%±3.67%、42.57%±3.45%、48.36%±3.08%，聯(lián)合組的抑瘤率明顯高于鴉膽子油乳組和順鉑組，可以有效遏制腫瘤組織的生長（表2）。

2.5 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積、RTV 與T/C的影響

腹腔注射給藥后，鴉膽子油乳組、順鉑組與聯(lián)合組腫瘤體積、RTV和T/C 明顯下降，T/C 均低于60%，根據抗腫瘤藥效學指導原則中的療效評價標準，揭示其體內抗腫瘤活性較強，且與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

2.6 不同藥物對SKOV3 裸鼠白細胞及血小板的影響

通過檢測裸鼠血小板和白細胞數(shù)量來觀察各治療組的變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，鴉膽子油乳組血小板、白細胞數(shù)量均減少，其中血小板的減少差異不顯著（P＞0.05），而白細胞數(shù)量減少的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而順鉑組、聯(lián)合組的血小板、白細胞數(shù)量均明顯減少，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表4）。

2.7 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響

與空白對照組比較，鴉膽子油乳組治療后裸鼠ALT 值無顯著差異，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），LDH、CR 值差異顯著（P＜0.01）；與鴉膽子油乳組比較，順鉑組與聯(lián)合組的ALT、LDH、CR 值均有所升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表5）。

表1 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響（n=8，）

表1 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響（n=8，）

表2 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較（n=8，）

表2 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較（n=8，）

表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值（n=8，）

表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值（n=8，）

圖1 原位腫瘤的形成（A）、形態(tài)（B）、大?。–）、正面形態(tài)（D）及腸系膜轉移（E）

表4 不同藥物對SK0V3裸鼠白細胞及血小板的影響（n=8，）

表4 不同藥物對SK0V3裸鼠白細胞及血小板的影響（n=8，）

表5 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響（n=8，）

表5 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響（n=8，）

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤第三位，死亡率居于婦科惡性腫瘤之首,五年生存率為15%～30%[2-3]，嚴重威脅著女性健康及生命。腫瘤細胞減滅術、鉑類化療藥物和紫杉醇聯(lián)合化療的綜合治療，仍是目前臨床上治療卵巢癌的主要方式。上世紀60 年代開始采用腹腔灌注化療治療卵巢癌，主要針對患者術后殘余及腹腔轉移的病灶進行治療，可以有效清除游離癌細胞及微小癌灶，防治術后腹腔復發(fā)及肝臟轉移，提高患者生存率，改善生存質量。

我們的前期體外實驗研究已證實鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑可以抑制人卵巢癌SKOV3 細胞的生長，促進其凋亡。隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，細胞生長抑制率呈上升趨勢。在此基礎上，我們將體外實驗引入體內，將腫瘤細胞懸液皮下注射成瘤后，取成型的皮下腫瘤進行組織塊原位移植，建立人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型，分組給予藥物干預，進一步觀察鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV3細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響。

3.1 人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤模型的建立

自1969年丹麥學者Rygaard和Povlsen首次建立了人結腸癌組織裸鼠皮下移植瘤模型后，裸鼠移植瘤模型實驗技術日臻完善。裸鼠移植瘤模型成為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、檢測抗腫瘤藥物的敏感性、研發(fā)新型抗腫瘤藥物的有效實驗手段[4]。卵巢癌裸鼠移植瘤模型按腫瘤的來源不同，可以分為切除標本實體瘤和卵巢癌細胞株；按接種部位的不同，可以分為皮下移植裸鼠模型、腹腔種植裸鼠模型和裸鼠體內原位移植模型[5]。

1993 年Fidler 建立了第一個人卵巢癌原位移植模型，該方法保留了人腫瘤的遺傳學及卵巢原發(fā)瘤灶、局部浸潤、對側卵巢轉移、腹腔大網膜和臟器表面種植、盆腔淋巴結轉移、腹水形成等卵巢癌的生物學特性[6-7]，能夠更客觀、真實地反映人卵巢癌的臨床發(fā)展過程。手術切除標本實體瘤模型病例結構更接近人卵巢癌，但建模時間長、難度大，成功率多為28%～40%[8-9]，而細胞株建立模型的原代移植成功率則高達90%，腫瘤組織塊鼠間傳代的移植成功率高達100%[10]。所以，采用腫瘤細胞株培養(yǎng)后建模的方法較為理想。

我們通過將人體腫瘤細胞接種到免疫缺陷小鼠BALB/c（nu/nu）體內的移植方法，建立了人卵巢癌SKOV3 裸鼠原位移植瘤模型。該模型成瘤率高且穩(wěn)定，實驗周期短，干預措施易于實施，且樣本的均一性及實驗結果的重復性較為客觀，樣本脫落少，更能準確真實地反映腫瘤在體內的發(fā)生演變過程。

3.2 鴉膽子油乳聯(lián)合順鉑腹腔給藥治療卵巢癌的療效性分析

中藥鴉膽子油乳注射液是由鴉膽子干燥的成熟果實提取的脂肪油經乳化作用制成的水包油型乳劑，具有抗癌活性的油酸及亞油酸是其主要活性成分，并且可以與腫瘤細胞膜發(fā)生細胞特異性親和。鴉膽子油乳的有效成分具有細胞周期非特異性抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細胞的DNA 合成，使腫瘤細胞變性、破裂、壞死，同時作用于機體免疫調節(jié)系統(tǒng)，改善細胞免疫狀態(tài)。這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一。鴉膽子油乳主要通過質膜系統(tǒng)和線粒體系統(tǒng)直接殺傷癌細胞，其活性成分不飽和脂肪酸可以通過降低腫瘤細胞的-SH 基含量，使細胞膜變薄，從而增加對抗癌藥物的通透性，提高細胞內藥物濃度，有利于抗癌藥物的滲透。因此，在臨床上多采用鴉膽子油乳與常用抗癌藥聯(lián)合放化療治療腫瘤。

1978 年美國首先批準臨床采用順鉑治療腫瘤，其具有高效廣譜抗癌的特點，抗腫瘤主要機制是可與腫瘤細胞DNA 結合，并破壞DNA 功能，阻斷其復制，導致腫瘤細胞的生長受到抑制[11]。此外，順鉑還參與腫瘤細胞的跨膜轉運、水合解離、靶向遷移[12]，均與其抗腫瘤效應相關。臨床上順鉑聯(lián)合化療仍是目前應用廣泛的治療方案，其在提高患者生存率的同時，也存在一定的毒性作用[13]。順鉑一般容易引起消化道反應、骨髓抑制、腎毒性、耳毒性及周圍神經毒性等副反應。

我們通過測量裸鼠移植瘤體積、抑瘤率等，發(fā)現(xiàn)鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對SKOV3 移植瘤的生長具有抑制作用；檢測裸鼠白細胞、血小板數(shù)目及肝腎功能的改變，顯示鴉膽子油乳相對于順鉑對人卵巢癌SKOV3 細胞裸鼠白細胞及血小板、肝腎功能（ALT、LDH、CR）的影響較小，具有低毒作用，在一定程度上可以避免順鉑化療藥物所致的不良反應，在臨床上具有廣泛的應用前景。

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