人促卵泡激素體外生物學(xué)活性測定方法的建立

賈慧,齊連權(quán)，梁艷，常翠云，王鑫，徐俊杰，陳薇

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所 北京 100071；2.北京泰德制藥股份有限公司，北京 100176

人促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是一種治療女性不孕的重要藥物，主要用于治療女性無排卵性不孕癥、控制性卵巢刺激和輔助生殖技術(shù)等。FSH是一個異源二聚體的糖蛋白激素，由垂體前葉產(chǎn)生，相對分子質(zhì)量約30×103。FSH由一個α亞基和一個β亞基經(jīng)非共價鍵連接[1]，其中α亞基與其他糖蛋白激素如促甲狀腺素（thyroid stimu?lating hormone，TSH）、促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）、胎盤產(chǎn)生的絨毛膜促性腺激素（chori?onic gonadotrophin，CG）一致，而β亞基為FSH所特有，發(fā)揮生物學(xué)活性。FSH用于女性不孕癥的治療已有40余年。目前，F(xiàn)SH主要來源為從絕經(jīng)期婦女尿液中提取和在哺乳動物細胞中表達純化重組FSH，由于重組FSH的高純度和高度安全性，在過去20年被廣泛接受和使用[2]。

迄今惟一被國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)批準和認可的FSH的體內(nèi)活性測定方法仍為半個世紀前建立[3-6]，該方法是基于FSH對雌性幼大鼠卵巢有增重作用。根據(jù)2010年版中國藥典二部附錄Ⅻ，F(xiàn)SH生物測定法采用的是比較尿促性素標準品與供試品對幼大鼠卵巢增重的作用，以測定供試品中FSH的效價。但是該方法具有很多局限性，如耗時長、操作繁瑣，以及對結(jié)果重復(fù)性的限制等，并且該方法依賴于較高的實驗技能。由于該方法須使用雌性幼大鼠，鼠齡要求嚴格，所以對待檢樣品的前期制備、貯存、運輸及實驗過程中的樣品保存等有極高的穩(wěn)定性要求。另外，大量動物的使用還存在倫理學(xué)上的問題?；诖耍瑲W盟委員會聯(lián)合各醫(yī)藥、化學(xué)制品、化妝品及生物制品企業(yè)，計劃在產(chǎn)品開發(fā)和放行檢測過程中盡量減少實驗動物的數(shù)量[7]。

由于體內(nèi)活性檢測的局限性和限制性，近期上市的幾個FSH產(chǎn)品使用了幾種物理化學(xué)方法替代體內(nèi)活性對產(chǎn)品進行檢測，例如分子排阻高效液相色譜法、定量等電聚焦電泳法[8-10]。這些物理化學(xué)方法與傳統(tǒng)的大鼠卵巢增重法（Steelman-Pohley法）相比，精確度有很大的提高，但是與生物學(xué)活性的特異相關(guān)性不高，包括酶聯(lián)免疫方法等物理化學(xué)方法都不能很好地反應(yīng)產(chǎn)品的生物學(xué)活性。

基于此，我們開發(fā)了一種體外細胞的活性測定方法，用人FSH的靶細胞來評價FSH的生物學(xué)活性。初級卵巢細胞的成熟由FSH誘導(dǎo)形成，所以在哺乳動物卵巢中顆粒細胞是FSH天然的靶細胞。FSH受體是G蛋白家族的一種跨膜蛋白受體，當FSH與位于靶細胞膜上的FSH受體結(jié)合后，激發(fā)cAMP信號傳導(dǎo)通路，進而轉(zhuǎn)錄激活目的基因表達，激活芳香化酶，引起類固醇蛋白如孕酮、雌二醇等的合成和分泌。

已有多種人顆粒細胞系被建立用于研究和應(yīng)用，例如來源于卵巢腫瘤細胞的HTOG、COV434和KGN細胞系，通過致癌性轉(zhuǎn)化的HGL、HO-23、GCLa、HGP53細胞系[11]。KGN細胞株是從一位患有顆粒細胞癌的婦女身上獲得的，在FSH受體的表達上表現(xiàn)出良好的生理活性。KGN細胞產(chǎn)生孕酮的量與FSH的加入呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系[12]，據(jù)此，我們建立了一種FSH的體外生物學(xué)活性測定方法，用不同濃度的FSH作用于KGN細胞，使細胞的孕酮分泌相應(yīng)增加，采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中孕酮含量的增加程度，以此反映FSH的生物學(xué)活性，無須任何改造，簡單方便實用。

采用KGN細胞活性測定方法可同時檢測多個樣品，其結(jié)果用FSH國際標準品進行校正。相比藥典規(guī)定的卵巢增重法，利用KGN細胞測定FSH活性的方法避免了耗時長、操作繁瑣、重復(fù)性差的限制，評價結(jié)果的重現(xiàn)性和準確度均有大幅度提高，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)和檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料

KGN細胞系由解放軍總醫(yī)院母義明教授贈送；已上市的CHO細胞表達的重組人FSH產(chǎn)品果納芬（Gonal-f）購自默克雪蘭諾有限公司（批號BAO21064、BAO20708、BAO22155，13.6 IU/μg）；自制 重 組 人 FSH（ 批 號 R6008DS01、R6009DS01、R6010DS01）；第二代FSH活性測定用國際標準品（NIBSC code為 08/282，12.6 IU/μg）購自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）；活性測定用尿促性素國家標準品（150524-200503，190 IU/支）購自中國藥品食品檢定研究院。

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Life Technology公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；青鏈霉素、胰蛋白酶、PBS緩沖液、0.4%臺盼藍染色液均購自Sigma公司；孕酮檢測ELISA試劑盒分別購自Alpha Diagnos?tic公司和DRG公司；酶標儀和SoftMax分析軟件為Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 細胞懸液和FSH樣品制備

KGN細胞為單層貼壁生長細胞，生長用培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM/F12，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3～4 d，待細胞生長至對數(shù)生長期后可用于實驗。細胞用0.25%胰酶消化2～3 min后棄去胰酶，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色法，在顯微鏡下用血球細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/mL，接種96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，即2×104/孔，24 h后更換為含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，然后用含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基對FSH樣品進行1∶3系列稀釋，共8個稀釋度，將稀釋好的樣品加入96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，每個樣品2個復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后檢測。

1.3 孕酮含量檢測

待FSH作用細胞不同時間后，用DRG公司生產(chǎn)的孕酮含量檢測ELISA試劑盒（D450nm的線性范圍為0～2.5）檢測各孔細胞培養(yǎng)上清中的孕酮含量：分別取各孔細胞上清25 μL，轉(zhuǎn)移至已包被好的ELISA板中，同時每板中加入試劑盒提供的孕酮標準品，室溫下?lián)u床孵育5 min，每孔加入200 μL酶聯(lián)抗體，室溫下?lián)u床孵育1 h，棄去各孔液體，用洗液清洗各孔，每孔300 μL，重復(fù)清洗3次，每孔加入200 μL顯色溶液，室溫下反應(yīng)15 min，每孔加入50 μL終止液終止顯色，用酶標儀測定D450nm值，并利用SoftMax軟件進行數(shù)據(jù)計算和分析，制作孕酮標準品曲線，分別計算不同F(xiàn)SH濃度作用下各孔的孕酮含量。

1.4 采用FSH國際標準品確定樣品的活性單位

利用SoftMax軟件，以國際標準品和樣品的濃度為橫坐標、對應(yīng)的D450nm值為縱坐標，繪制國際標準品和樣品的劑量-反應(yīng)曲線，采用四參數(shù)方程進行擬合，分別計算標準品和樣品的EC50值，用國際標準品的活性對樣品活性按下式進行校正：

1.5 方法學(xué)驗證和多批次樣品檢測

對建立的方法的專屬性、線性與范圍、準確性、精密度和耐受性進行驗證，采用該方法對多批次FSH產(chǎn)品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 最佳作用時間和濃度的確定

不同濃度的FSH作用KGN細胞24、48、72、96 h后檢測細胞的孕酮含量，結(jié)果見圖1。在不同濃度的FSH作用下，KGN細胞分泌出不同濃度的孕酮，F(xiàn)SH濃度為0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)，細胞的孕酮分泌量與FSH濃度呈明顯的劑量相關(guān)性。隨著作用時間的延長，相同濃度FSH作用下KGN細胞的孕酮分泌量逐漸升高，高濃度FSH作用24、48、72、96 h時，誘導(dǎo) KGN細胞分泌的孕酮量分別為0.4、11.2、96.8和112.5 ng/mL，與培養(yǎng)基對照組相比，孕酮分泌量分別提高了約0.4、10、100和110倍。各濃度FSH作用24 h時細胞基本無孕酮分泌，高濃度FSH作用48 h后顯示孕酮含量增加，但幅度不明顯，作用72 h后孕酮分泌量明顯升高，96 h與72 h相比孕酮分泌量也略有升高。

以FSH濃度為橫坐標、D450nm值為縱坐標做圖（圖2），結(jié)果顯示作用24 h時D450nm值與陰性對照一致；高濃度FSH作用48 h后D450nm值明顯降低，但還未形成良好的S型作用曲線；各濃度FSH作用72和96 h后，D450nm值與FSH濃度形成典型的S型作用曲線。比較后可以看出，作用96與72 h相比孕酮含量并沒有明顯提高，作用曲線一致。因此，為縮短檢測時間，最終確定該方法最佳作用時間為72 h，F(xiàn)SH作用濃度為0.1～200 ng/mL。

2.2 樣品檢測并采用FSH國際標準品進行標定

對市售重組FSH（默克雪蘭諾有限公司）采用最終確定的方法進行檢測，選用對數(shù)生長期KGN細胞，檢測結(jié)果（表1）與該市售樣品的標示量（13.6 IU/μg）一致。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 專屬性 FSH產(chǎn)品中含有一定濃度的輔料，因此考察輔料成分對KGN細胞是否有刺激作用。用超純水配制不含F(xiàn)SH的輔料溶液，然后按同樣方法分別稀釋輔料溶液和FSH蛋白溶液，作用KGN細胞72 h后檢測孕酮含量。結(jié)果顯示各稀釋率下輔料D450nm值均與陰性對照一致（圖3），說明輔料對KGN細胞無刺激作用，對結(jié)果不產(chǎn)生影響。

2.3.2 線性與范圍 國際標準品、市售重組FSH（批號：BAO21064）和自制樣品（批號：R6008DS01）在FSH為0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)均存在良好的劑量反應(yīng)曲線，且符合四參數(shù)方程式（表2），呈典型的倒S型，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。國際標準品和FSH樣品的劑量反應(yīng)曲線見圖4，其相關(guān)系數(shù)分別為0.994、0.996和0.998，三者作用曲線重合，說明3種FSH樣品的量效作用關(guān)系一致，屬于同質(zhì)樣品，其活性結(jié)果可以用國際標準品進行校正。

表1 市售樣品檢測結(jié)果

圖1 FSH作用不同時間孕酮分泌量比較

圖2 FSH作用不同時間作用曲線比較

2.3.3 準 確 性 試 驗 FSH自 制 樣 品（批 號 ：R6008DS01）與國際標準品按一定比例混合，分別制成50%、100%、150%添加的回收率樣品，進行活性測定，并與標準品理論添加值進行比較，每個樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果見表3，各樣品的回收率為86%～114%（表3），符合生物學(xué)活性測定的回收率要求。

2.3.4 精密度實驗 對3批市售FSH樣品和3批自制FSH樣品分別重復(fù)測定3次，計算變異系數(shù)，其比活性平均值為12.9～14.3 IU/μg（表 4），其變異系數(shù)均小于15%。

2.3.5 耐用性試驗 市售有不同廠家的孕酮檢測試劑盒，檢測原理基本相同，但檢測靈敏度會有所不同。選用較常用的2個廠家的孕酮檢測ELISA試劑盒（分別為Alpha Diagnostic公司和DRG公司產(chǎn)品）進行試驗，這2種試劑盒檢測原理相同，但說明書顯示其檢測靈敏度和吸光度值范圍有所差異。結(jié)果顯示，在同樣濃度條件下，Alpha Diagnostic公司試劑盒測定的D450nm值為0.2～1.174，DRG公司的則為0.3～1.90（圖5），二者的檢測靈敏度存在一定差異，但劑量反應(yīng)曲線非常一致（圖6），EC50值一致。經(jīng)國際標準品校正，得出的結(jié)果顯示2種試劑盒檢測活性一致（表5），說明該方法對不同品牌的試劑盒有很好的耐用性。

表2 FSH活性測定四參數(shù)方程

表3 回收率實驗結(jié)果

表4 精密度實驗結(jié)果

2.4 與大鼠卵巢增重法測定結(jié)果比較

選擇3批市售果納芬樣品和1批尿源FSH國家標準品進行活性測定，并與傳統(tǒng)方法（大鼠卵巢增重法）測定結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)KGN細胞活性測定結(jié)果與卵巢增重法測定結(jié)果一致（表6、7）。

3 討論

如同促紅細胞生成素、人體絨毛膜促性腺激素和人類促黃體生成素，F(xiàn)SH仍是為數(shù)不多的需要體內(nèi)活性測定方法的蛋白質(zhì)。惟一被國內(nèi)外相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)批準的體內(nèi)活性檢測方法仍是在1953年建立的大鼠卵巢增重法。該方法有很大的局限性，包括須使用大量動物，試驗方法的準確性、精密度，以及較復(fù)雜的結(jié)果計算方法。此外，有研究表明FSH在其他哺乳動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為與在大鼠體內(nèi)存在差異，因此采用大鼠卵巢增重法進行FSH生物學(xué)活性評價可能存在種屬上的差異[13]。

圖3 專屬性實驗結(jié)果（輔料影響）

圖4 四參數(shù)劑量反應(yīng)曲線

為避免該方法的缺陷，近年嘗試采用一些理化方法如凝膠排阻層析法、等點聚焦法及反相色譜法等[8-10]代替體內(nèi)測定方法，但這些方法都不能很好地反映生物學(xué)活性，其結(jié)果必須與幾十批產(chǎn)品的體內(nèi)活性結(jié)果進行相關(guān)性分析。此外，這些理化分析方法對樣品的純度要求很高，其結(jié)果與產(chǎn)品的不同工藝相關(guān)，所以通用性不是很好。

本研究建立的KGN細胞體外生物活性測定法可以克服上述體內(nèi)活性測定方法和理化方法的局限性。KGN細胞來源于人，天然表達FSH受體，不需要進行基因轉(zhuǎn)染等修飾[11]。KGN細胞經(jīng)不同濃度的FSH刺激后產(chǎn)生的孕酮分泌量的變化可以通過商用的孕酮檢測ELISA試劑盒進行測定。與體內(nèi)測定法相同，該方法在檢測時可以使用活性測定用FSH國際標準品（92/642或08/282）對結(jié)果進行校正[14]。而對于色譜法等理化測定方法，由于該國際標準品輔料中含有大量人血清白蛋白而對結(jié)果產(chǎn)生干擾，所以不能用于理化測定方法的校正。與體內(nèi)活性測定法相比，KGN細胞檢測法需要的FSH蛋白劑量范圍更寬，為0.1～200 ng/mL。經(jīng)過完整的方法學(xué)驗證，結(jié)果表明該方法對FSH有很好的專屬性，并且不受樣品中輔料物質(zhì)的干擾；在一定的濃度范圍內(nèi)有很好的劑量-反應(yīng)相關(guān)作用曲線，回收率實驗結(jié)果為80%～120%，精密度試驗的變異系數(shù)在15%以內(nèi)，對于生物活性測定方法來說有很高的準確度和精密度；孕酮含量檢測考察了2種品牌的商用ELISA試劑盒，雖然有不同的靈敏度，但對結(jié)果的測定和計算沒有明顯差異，表現(xiàn)了很好的耐用性。該方法使用96孔細胞培養(yǎng)板進行檢測，可同時進行多個樣品的檢測，與體內(nèi)活性檢測方法相比，可以大大提高檢測效率，同時可顯著降低檢測成本。更重要的是，與理化測定方法不同，KGN細胞活性測定法對CHO細胞表達的重組人FSH和尿源FSH產(chǎn)品都有很好的適用性，其結(jié)果與體內(nèi)活性測定一致。綜上所述，這種KGN細胞體外活性測定法可以對FSH的生物學(xué)活性進行很好的評價，其結(jié)果可以對臨床試驗進行很好的預(yù)測。

表5 不同品牌試劑盒實驗結(jié)果

表6 與卵巢增重法結(jié)果比較（果納芬）

表7 與卵巢增重法結(jié)果比較（尿源國家標準品）

國內(nèi)外藥品監(jiān)管機構(gòu)一直鼓勵開發(fā)新的分析方法代替動物實驗方法進行生物活性分析[15]，但是像FSH這樣的激素類糖蛋白，由于其結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，開發(fā)一種體外活性測定方法來代替動物實驗方法確實存在很大的挑戰(zhàn)性。FSH的不同唾液酸化程度受上游細胞培養(yǎng)條件的影響很大，導(dǎo)致產(chǎn)生很多不同的糖型結(jié)構(gòu)[13,16]。這些不同的結(jié)構(gòu)亞型在體內(nèi)表現(xiàn)了不同的藥代動力學(xué)結(jié)果，例如不同的唾液酸化程度其在體內(nèi)的半衰期有很大的不同[17]。本研究開發(fā)的基于KGN細胞的體外活性測定方法可以區(qū)分不同的結(jié)構(gòu)特征。KGN顆粒細胞系是一個很好的FSH體外作用模型，細胞表面具有天然的FSH受體，無須進行基因轉(zhuǎn)染等改造。FSH作用于KGN細胞，使其產(chǎn)生孕酮，其產(chǎn)生量與FSH濃度具有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，可以很好地反映FSH在體內(nèi)的生物學(xué)活性。綜上所述，KGN細胞體外測定方法有諸多優(yōu)勢，有望在將來代替現(xiàn)有的體內(nèi)活性測定方法，對FSH產(chǎn)品進行生物學(xué)活性評價，更易于對FSH產(chǎn)品進行質(zhì)量控制和一致性比較。

圖5 不同品牌孕酮檢測試劑盒吸光度值比較

圖6 不同品牌孕酮檢測試劑盒作用曲線比較

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