豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的克隆表達(dá)及抗血清的制備

孫銘苑　方懷盛　才學(xué)鵬

摘要 [目的]探索豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因克隆、原核表達(dá)及抗血清制備的方法。[方法] 根據(jù)從GeneDB獲得的豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以豬帶絳蟲(chóng)的cDNA為模板，擴(kuò)增出豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的開(kāi)放閱讀框。將去掉信號(hào)肽的部分進(jìn)行了原核表達(dá)，用重組蛋白免疫青紫藍(lán)灰兔，并制備高效價(jià)抗血清。[結(jié)果]成功克隆了豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的開(kāi)放閱讀框序列，將其命名為T(mén)scpB，長(zhǎng)度為1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸，理論蛋白分子質(zhì)量約為39.71 ku，具有組織蛋白酶B的特征結(jié)構(gòu)域。采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，成功獲得了大小約38 ku的豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的重組蛋白，此目的蛋白以包涵體的形式存在。Western blotting表明，豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清可以與純化的重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明被豬囊尾蚴感染過(guò)的豬血清中存在組織蛋白酶B的抗體。[結(jié)論]豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B重組質(zhì)粒能在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達(dá)，且該蛋白具有較高的免疫活性。

關(guān)鍵詞豬帶絳蟲(chóng)；組織蛋白酶B；序列分析；原核表達(dá)；抗血清

中圖分類號(hào)S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-132-04

Cloning and Expression of Cathepsin B from Taenia solium and Preparation of Its Antiserum

SUN Mingyuan， FANG Huaisheng， CAI Xuepeng*

（State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology， Lanzhou Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou， Gansu 730046）

Absract [Objective]The research aimed to explore the methods of the cloning and expression of cathepsin B from Taenia solium and preparation of its antiserum.[Method] The specific primers were designed according to the sequence of cathepsin B from T. solium obtained from GeneDB. Taking cDNA of T.solium as the templates， the ORF of cathepsin B from T. solium was amplified. The prokaryotic expression was made after signal peptide was removed from ORF of cathepsin B. Chinchilla rabbits were immunized with the recombinant protein to prepare hightiter antiserum. [Result] The ORF of cathepsin B from T. solium was successfully cloned and named as TscpB. TscpB encoded 357 amino acids， and its length was 1 074 bp and its theoretical protein's molecular weight was 39.71 ku. And TscpB had the typical domain of cathepsin B. The target protein （rTscpB） was expressed by using prokaryotic expression system of Escherichia coli. The recombinant protein with the size of about 37 ku was obtained and it existed in the form of inclusion bodies. The results of Western blotting showed that the purified rTscpB could be specially combined with positive serums of swine infected with porcine cysticercosis， which indicated that the antibodies of cathepsin B existed in serum samples of pigs infected with Cysticercus cellulosae. [Conclusion] The recombinant plasmid of cathepsin B could be efficiently expressed in E. coli， and the protein had higher immunocompetence.

Key words Taenia solium； Cathepsin B； Sequence analysis； Prokaryotic expression； Antiserum

豬帶絳蟲(chóng)（Taenia solium）是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)，豬囊尾蚴能夠引起豬和人的囊蟲(chóng)病。鑒于豬帶絳蟲(chóng)病不僅能對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成危害，引發(fā)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會(huì)危害公共衛(wèi)生安全，加之分布廣泛，該病已經(jīng)被聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織列為“需要根除的六大疾病”之一。

迄今為止，針對(duì)豬帶絳蟲(chóng)病或豬囊尾蚴病的藥物以及疫苗的使用仍存在許多問(wèn)題。蛋白酶是在從病毒到脊椎動(dòng)物都廣泛存在的一類酶，大分子蛋白質(zhì)和低聚肽均可被其降解。同時(shí)，蛋白酶與寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和其在宿主體內(nèi)的存活息息相關(guān)。根據(jù)蛋白酶的蛋白水解機(jī)制，可將蛋白酶分為半胱氨酸蛋白酶和蘇氨酸蛋白酶等8類。組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員之一。大量試驗(yàn)研究表明，組織蛋白酶B在寄生蟲(chóng)攝取營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育、組織遷移、蛋白處理和活化以及免疫逃避等方面發(fā)揮重要作用，是預(yù)防及治療多種寄生蟲(chóng)疾病的潛在靶標(biāo)分子。筆者首次克隆了豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的開(kāi)放閱讀框序列，將去掉信號(hào)肽的部分進(jìn)行了原核表達(dá)，用重組蛋白免疫青紫藍(lán)灰兔，制備了高效價(jià)抗血清。

1材料與方法

1.1蟲(chóng)體、試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑豬帶絳蟲(chóng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲(chóng)研究室提供；Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、BL21（DE3）感受態(tài)、Trans 2k DNA Marker，均購(gòu)自北京全式金公司；pMD18T克隆載體、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和Primer STAR HS DNA Polymerase均購(gòu)自TaKaRa（大連）有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；健康青紫藍(lán)灰兔，購(gòu)于蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司；原核表達(dá)載體pET30a購(gòu)自Merck公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I（HF）、NotⅠ購(gòu)自NEB公司；聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride， PVDF）膜，購(gòu)自Millipore公司；鎳NTA瓊脂糖凝膠FF購(gòu)自GenScript公司；兔抗豬辣根過(guò)氧化物酶（HRP）酶標(biāo)IgG、山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶（HRP）酶標(biāo)IgG均購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1豬帶絳蟲(chóng)總RNA的提取及cDNA合成。豬帶絳蟲(chóng)總RNA的提取按照Trizol Reagent（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，相關(guān)器皿經(jīng)高溫烘烤，試劑、耗材均使用無(wú)RNase產(chǎn)品。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，利用提取的RNA和隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2組織蛋白酶B基因的擴(kuò)增。

通過(guò)比對(duì)豬帶絳蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneDB，篩選到組織蛋白酶B的開(kāi)放閱讀框序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物：

TscpBF： 5′ATGTCTGCGATGAAGATGTC3′

TscpBR： 5′CTAGTTTTGCGGGAGACCG3′

以第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 70 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD18T載體于16 ℃水浴中連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α。通過(guò)菌液PCR對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3組織蛋白酶B基因序列分析。

通過(guò)ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用SignalP 4.1在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)PredictProtein在線軟件（https：//www.predictprotein.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MotifScan在線軟件（http：//myhits.isbsib.ch/cgibin/motif_scan）對(duì)糖基化位點(diǎn)以及翻譯后的修飾位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)SMART在線軟件（http：//smart.emblheidelberg.de/）對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用BioEdit軟件的Kyte&Doolittle方法計(jì)算蛋白質(zhì)序列的疏水性分布。通過(guò)SWISSMODEL在線軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)3D結(jié)構(gòu)。

1.2.4重組表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)克隆到的TscpB序列及序列分析，在信號(hào)肽之后設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，送至上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物為模板，用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

TscpBF：5′CCGGAATTCCAGCACTGTGACTCACGCC3′（EcoR I）

TscpBR：5′CCGGCGGCCGCCTAGTTTTGCGGGAGACCG3′（NotⅠ）

將純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET30a分別經(jīng)EcoR I和NotⅠ雙酶切后連接過(guò)夜。利用PCR和雙酶切對(duì)其進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆送交上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30aTscpB。

1.2.5豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的原核表達(dá)及表達(dá)形式鑒定。

將含有重組質(zhì)粒的菌液接于5 ml Kan濃度為100 mg/ml的 LB培養(yǎng)液中，于37 ℃ 220 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。同時(shí)設(shè)置空載體和未誘導(dǎo)組作為對(duì)照。將培養(yǎng)12 h后的菌液再轉(zhuǎn)接至含5 ml Kan濃度為100 mg/ml的 LB培養(yǎng)液中，于37 ℃ 220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至吸光度OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h時(shí)分別從未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)組中各取出1 ml菌液。12 000 r/min離心1 min后，收集菌體。將處理后的樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，確定表達(dá)后鑒定蛋白的表達(dá)形式。

1.2.6蛋白純化及Westernblotting分析。按照確定的誘導(dǎo)條件大量（1 L）誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體。經(jīng)PBS反復(fù)洗滌、-70 ℃凍融3次處理后，按照Invitrogen公司的鎳瓊脂糖凝膠FF操作說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行純化。將純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，用5%脫脂奶粉于4 ℃過(guò)夜封閉。用1∶200倍稀釋的豬囊尾蚴病陰性血清和陽(yáng)性血清分別與PVDF膜于室溫下振蕩孵育1.5 h后，加入HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG（1∶20 000倍稀釋），于室溫下振蕩孵育1 h后，加入DAB底物溶液顯色。

1.2.7多克隆抗體的制備及免疫血清效價(jià)的測(cè)定。

測(cè)定純化后的蛋白濃度，將蛋白于-20 ℃保存?zhèn)溆?。免疫前，在試?yàn)兔耳緣靜脈采血并分離血清，于-20 ℃下保存，作為陰性對(duì)照。每3周免疫1次，共免疫4次，每只兔子的免疫劑量為200 μg/次。第1次免疫使用弗氏完全佐劑，蛋白與佐劑采用1∶1比例混合，使用乳化機(jī)將混合物乳化至穩(wěn)定的油包水型乳劑。在兔子背部及大腿實(shí)施皮下多點(diǎn)注射，免疫7 d后在耳緣靜脈采血，將分離的血清于-20 ℃下保存?zhèn)溆?；此后?次免疫都使用弗氏不完全佐劑。待抗體的滴度符合要求后頸動(dòng)脈采血，將分離的血清于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA方法對(duì)制備的免疫血清的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

2結(jié)果與分析

2.1豬帶絳蟲(chóng)總RNA的提取經(jīng)核酸電泳檢測(cè)，提取的總RNA呈現(xiàn)28 S、18 S和5 S共3條條帶（圖1）。

注：M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.豬囊尾蚴的總RNA。

圖1豬囊尾蚴總RNA的提取

2.2豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的擴(kuò)增

重新設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽序列的組織蛋白酶B的基因片段（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增的序列為1 025 bp，與GeneDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)（http：//www.genedb.org/）顯示的數(shù)據(jù)完全一致。

注：M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.TscpB的PCR產(chǎn)物。

圖2TscpB的PCR結(jié)果

2.3組織蛋白酶B基因的序列分析序列分析表明，TscpB蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Trp含量最少。TscpB蛋白的理論分子質(zhì)量為39.71 ku，等電點(diǎn)為6.63，原子組成為C1757H2696N488O518S24。帶電荷的殘基共占20.8%，其中負(fù)電荷殘基占10.7%，正電荷殘基占10.1%。不穩(wěn)定系數(shù)為48.47，證明該蛋白質(zhì)可能不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為71.32，總平均親水性為-0.384。通過(guò)對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TscpB二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占27.5%，β折疊占14.8%，無(wú)規(guī)則卷曲（L）占57.7%。對(duì)蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有7個(gè)Tyr、4個(gè)Thr、8個(gè)Ser，為可能的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，TscpB最可能的剪切位點(diǎn)在第23和24位氨基酸殘基之間，證明該蛋白可能存在信號(hào)肽。利用MotifScan對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白有3個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，分別為半胱氨酸活性位點(diǎn)、組氨酸活性位點(diǎn)、天冬酰胺活性位點(diǎn)；2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)；6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；4個(gè)CK2蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；6個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn)，具有組織蛋白酶B結(jié)構(gòu)域。SMART分析表明，1～23位氨基酸構(gòu)成該蛋白的信號(hào)肽序列，證明該蛋白可能是分泌型蛋白（圖3）。該蛋白3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析相一致（圖4）。

圖3TscpB的結(jié)構(gòu)域

圖4TscpB 3D結(jié)構(gòu)示意

2.4重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoR I 和Not I雙酶切，產(chǎn)物出現(xiàn)預(yù)期大小的目的片段（圖5）。測(cè)序結(jié)果表明，已經(jīng)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。

注：M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET30a-TscpB酶切；2.pET30a質(zhì)粒酶切。

圖5pET30a-TscpB 雙酶切鑒定結(jié)果

2.5組織蛋白酶B的原核表達(dá)及蛋白純化

將重組質(zhì)粒pET30a-TscpB轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大約38 ku的表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致（圖6）。經(jīng)鑒定，該重組蛋白以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)。

將所有重組蛋白過(guò)柱層析純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)最終獲得了較高純度的重組蛋白（圖7）。定量檢測(cè)純化后的蛋白最終質(zhì)量濃度為1 mg/ml。

注：M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.BL21（DE3）誘導(dǎo)；2.pET-30a/BL21（DE3）未誘導(dǎo)；3.pET-30a/BL21（DE3）誘導(dǎo)；4.pET30a-TscpB/BL21（DE3）未誘導(dǎo)；5.pET30a-TscpB/BL21（DE3）誘導(dǎo)。

圖6pET30a-TscpB 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

注：M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6.洗脫峰。

圖7pET30a-TscpB 重組蛋白的純化

2.6rTscpB的Western blotting結(jié)果從圖8可以看出，rTscpB與豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清反應(yīng)，在38 ku左右處出現(xiàn)特異性條帶，而與陰性血清無(wú)反應(yīng)，證明rTscpB具有抗原性。

注：M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清；2.豬囊尾蚴病陰性血清。

圖8rTscpB的Western blotting檢測(cè)

2.7ELISA檢測(cè)結(jié)果從圖9可以看出，4次免疫后兔子血清的抗體效價(jià)可達(dá)1∶2.04×105。

圖9免疫后抗體水平結(jié)果

3討論

在最早的生化試驗(yàn)中，蠕蟲(chóng)的提取物被發(fā)現(xiàn)具有木瓜蛋白酶的活性，且這種活性能夠被一些蛋白酶抑制劑特異性抑制。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，這些蛋白酶中的某些成分被證明具有和哺乳動(dòng)物組織蛋白酶B相似的活性[1]。在絳蟲(chóng)中，多房棘球絳蟲(chóng)的組織蛋白酶B基因的研究較多。研究表明，多房棘球絳蟲(chóng)能夠分泌兩種組織蛋白酶B，主要定位于原頭蚴、可育囊和生發(fā)層[2]。在酸性環(huán)境下，該酶能夠發(fā)揮水解活性，降解BSA、IgG、纖連蛋白和膠原蛋白[3-6]。迄今為止，關(guān)于豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的研究報(bào)道非常少，僅有試驗(yàn)表明豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴時(shí)期ES抗原中含有組織蛋白酶B[7]。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是目前被最廣泛使用的外源蛋

白表達(dá)系統(tǒng)。作為一種常用的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)，如工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、表達(dá)周期短及表達(dá)量高等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的突出優(yōu)點(diǎn)是可以高水平地表達(dá)外源基因，其表達(dá)產(chǎn)量可以達(dá)到自身總蛋白的80%以上。

筆者擴(kuò)增到豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的開(kāi)放閱讀框，長(zhǎng)度為1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的理論蛋白分子質(zhì)量約為39.71 ku，其1～23位氨基酸構(gòu)成該蛋白的信號(hào)肽序列，說(shuō)明豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B很可能是一種分泌型的蛋白。筆者采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，成功獲得了大小約為38 ku的豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B的重組蛋白，此目的蛋白以包涵體的形式存在。Western blotting結(jié)果表明，豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清可以與純化的重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而陰性血清不發(fā)生反應(yīng)。這說(shuō)明被豬囊尾蚴感染過(guò)的豬血清中存在組織蛋白酶B的抗體，同時(shí)也證實(shí)了該蛋白具有抗原性，可能具有潛在的免疫診斷價(jià)值。該試驗(yàn)中高效價(jià)抗血清的制備為進(jìn)一步探究該酶的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。

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