植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族Group IIa基因研究進(jìn)展

羅昌國(guó)等

摘 要 WRKY基因家族編碼是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)WRKY的保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系可分為GroupⅠ、Ⅱ和 Ⅲ，其中GroupⅡ進(jìn)一步分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe。Group IIa基因之間具有很高的同源性，基因功能多樣，關(guān)系復(fù)雜。對(duì)GroupⅡa基因的結(jié)構(gòu)和在植物抗病性與環(huán)境脅迫中的作用，以及主要調(diào)控機(jī)制等方面研究進(jìn)行綜述，為GroupⅡa基因的后續(xù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 WRKY轉(zhuǎn)錄因子；基因進(jìn)化；脅迫；調(diào)控機(jī)制

中圖分類號(hào) S432. 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract WRKY gene family encodes plant-specific transcription factors. According to the conservative domain and the evolutionary relationship， the WRKY family can be divided into GroupⅠ， Ⅱ and Ⅲ， GroupⅡ can be further divided into Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd and Ⅱe. There are very high sequence homolog， diverse gene functions and complicated relationship among GroupⅡa genes. In these paper， we review recent progress in the genes structure， the functions in plant disease resistance and environmental stress， and the regulation mechanisms of GroupⅡa WRKY.

Key words WRKY transcription factors； Gene structure； Stress； Regulation mechanisms.

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.031

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor），又稱反式作用因子（transacting factor），是指能夠結(jié)合在靶基因上游（啟動(dòng)子區(qū)）順式作用元件上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶，或叫RNA合成酶）與DNA模板的結(jié)合，即典型的轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合域和核定位信號(hào)等功能域。植物常見轉(zhuǎn)錄因子包括WRKY[Trp（W）-Arg（R）-Lys（K）-Tyr（Y），色氨酸-精氨酸-賴氨酸-酪氨酸]、ABI3/VP1、AP2/EREBP、MADS、MYB、NAC（又名NAM，ATAF，CUC2）等約70個(gè)家族，約占植物基因總數(shù)的10%[1-2]。其中植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族有WRKY、NAC（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）、ERF[（APETALA 2（AP2）/ethylene-responsive element binding factor）]、NAM（NO APICAL MERISTEM）、NAC、ABI3（ABSCISIC

ACID INSENSITIVE 3）/VP1（VIVIPAROUS1）、ARF （auxin response factor）、SBP（SQUAMOSA-promoter binding protein）[3]。擬南芥中WRKY氨基酸的長(zhǎng)度從109（AtWRKY43）到1 895（AtWRKY19）個(gè)，序列長(zhǎng)度相差最大可達(dá)10余倍，其中保守結(jié)構(gòu)域約含有60個(gè)氨基酸序列，包括N端的WRKY到C端的Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC保守序列。WRKY的保守結(jié)構(gòu)域也是轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域，WRKY的名字也源自WRKY這一保守序列[4-5]。在少數(shù)的WRKY蛋白中，WRKY序列被WRRY、WRSY、WKRY、WVKY取代[6]。WRKY的C端是一個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)，其鋅指結(jié)構(gòu)為Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可將WRKY分為GroupⅠ、Ⅱ和 Ⅲ，GroupⅠ具有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，GroupⅡ和GroupⅢ只有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域；GroupⅠ、Ⅱ的鋅指結(jié)構(gòu)為Cx4-5Cx22-23HxH，而GroupⅢ鋅指結(jié)構(gòu)為Cx7Cx23HxC。GroupⅡ基因根據(jù)氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)可再進(jìn)一步分為 Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe[7-8]。不同的物種中，WRKY的數(shù)量不一樣，低等植物種類較少，從幾個(gè)到幾十個(gè)不等；高等植物WRKY數(shù)量比較多，有幾十到上百個(gè)不等[9-10]。WRKY在植物抗病、抗逆等方面的調(diào)控作用取得了很多的研究成果，并且已有一些研究綜述，但這一大家族中的GroupⅡa基因成員之間同源性高，關(guān)系緊密而復(fù)雜，對(duì)這一細(xì)分基因類型的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行總結(jié)可為后期研究提供參考。

1 GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)可追溯到20年前，Ishiguro等[11]第一次發(fā)現(xiàn)WRKY蛋白具有結(jié)合DNA的特性，并命名為SPF1（SWEET POTATO FACTOR1），第2個(gè)報(bào)道的WRKY是在發(fā)芽過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白ABF1和ABF2[12]。第3個(gè)報(bào)道的是從歐芹（Petroselinum crispum）中鑒定的WRKY1、WRKY2、WRKY3，并首次創(chuàng)造了“WRKY”轉(zhuǎn)錄因子一詞[4]。

據(jù)Yamasaki等[3]的研究，WRKY可能從簡(jiǎn)單的微生物歸位內(nèi)切酶C2H2 ZnF 或ββα-metal開始進(jìn)化，到了單細(xì)胞真核生物就形成最原始的WRKY，再進(jìn)化形成綠藻的WRKY，最后進(jìn)化形成高等植物的WRKY。Zhang等[7]分析認(rèn)為GroupⅠ WRKY屬于比較原始的類型，GroupⅡ由GroupⅠ進(jìn)化而來(lái)，GroupⅢ由GroupⅡd和GroupⅡe進(jìn)化而來(lái)（圖1）。比較原始的賈第鞭毛蟲Giadia lamblia只具有GroupⅠ類型基因，到了綠藻則具備了GroupⅠ和GroupⅢ類型的WRKY，到蘚類（Physcomitrella patens）就具備了GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ類型的WRKY，但GroupⅡ類型還不完全，還缺少其中的GroupⅡa和GroupⅡe，被子植物則具備了種類齊全的WRKY（表1）。

GroupⅡa WRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域包括LZ、WRKYGQK和Cx5Cx23HNH，它們都能影響WRKY的結(jié)合能力（圖2）。LZ（Leu zipper）結(jié)構(gòu)域中亮氨酸（Leu）數(shù)量的多寡直接影響到蛋白的結(jié)合能力，這一現(xiàn)象在被削弱LZ結(jié)構(gòu)域之后的AtWRKY18酵母雙雜實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到印證，而AtWRKY60的LZ結(jié)構(gòu)域中Leu在2個(gè)位置上被其它蛋白所取代則可能是導(dǎo)致其蛋白結(jié)合能力較AtWRKY40和AtWRKY18低的原因[17]。2005年，Yamasaki等首次報(bào)道了WRKY結(jié)構(gòu)域的溶液構(gòu)象結(jié)構(gòu)，由4個(gè)β-折疊（β-sheet）和Cys/His鋅指構(gòu)成一個(gè)鋅結(jié)合口袋（zinc-binding pocket）。WRKYGQK一般位于N端的β-折疊，構(gòu)成蛋白的突出面，伸入DNA大溝并與DNA接觸，并結(jié)合到W-box上[18-20]。野燕麥（Avena fatua）GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子ABF2結(jié)合蛋白可識(shí)別并結(jié)合到W-box（TTGACC/T），但是在加入二價(jià)金屬失活劑1，10-O-菲咯啉螯合物（1，10-O-phenanthroline）可使結(jié)合不能進(jìn)行，支持了鋅指結(jié)構(gòu)的存在[12]。

2 GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能

2.1 GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗病性

目前對(duì)GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗病功能方面的研究主要通過(guò)抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、病原菌或病原激發(fā)子誘導(dǎo)內(nèi)源基因的表達(dá)分析、過(guò)量表達(dá)目的基因、突變目的基因（gene knockout）以及干涉目的基因（Gene knockdown）等幾種方式。GroupⅡa WRKY通過(guò)調(diào)控重要的抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因或蛋白來(lái)調(diào)控植物的抗病性。對(duì)Group Ⅱa WRKY調(diào)控植物抗病性的認(rèn)識(shí)最初得益于擬南芥NPR1（NON EXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES1）基因的研究，對(duì)NPR1啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)它具有WRKY結(jié)合的W-box，凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）證明了AtWRKY18可結(jié)合到NPR1的W-box上[21]，NPR1通過(guò)調(diào)控下游PR1（pathogenesis-related）廣泛調(diào)控植株的抗病性[22-24]，因而AtWRKY18可能通過(guò)NPR1來(lái)調(diào)控植物抗病性[25]。EDS1（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1）是擬南芥中另一個(gè)調(diào)控植株對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型病害抗性的網(wǎng)絡(luò)[26]，EDS1的啟動(dòng)子區(qū)亦具有W-box，ChIP（chromatin

immunoprecipitation）實(shí)驗(yàn)也證明了AtWRKY40可結(jié)合到EDS1的W-box上[27]。除了通過(guò)結(jié)合到W-box上調(diào)控目的基因外，GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子還與一些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的抗病蛋白互作，大麥HvWRKY1、HvWRKY2與擬南芥AtWRKY18、AtWRKY40同源，其編碼的蛋白則通過(guò)與MLA（mildew-resistance locus A）互作來(lái)調(diào)控白粉病抗性[28]。

研究GroupⅡa WRKY在抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的角色十分有助于學(xué)者對(duì)基因功能的了解，但是目前的研究還不能完全詮釋基因的表達(dá)現(xiàn)象。在病源誘導(dǎo)內(nèi)源基因表達(dá)方面，很多病原菌都能誘導(dǎo)GroupⅡa WRKY基因的表達(dá)，但在不同病原菌或不同誘導(dǎo)條件下基因的表達(dá)特點(diǎn)不一樣，一方面不同病源菌誘導(dǎo)相同基因表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)不一樣，另一方面同一病原菌誘導(dǎo)不同的基因表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間點(diǎn)也不一樣。擬南芥3個(gè)GroupⅡa WRKY基因受細(xì)菌性葉斑菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000）和灰霉菌（Botrytis cinerea）誘導(dǎo)表達(dá)特點(diǎn)明顯不同，AtWRKY18同時(shí)受到細(xì)菌性葉斑菌和灰霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)明顯，而AtWRKY40僅受灰霉菌誘導(dǎo)，AtWRKY60僅受細(xì)菌性葉斑菌誘導(dǎo)，但后兩者誘導(dǎo)強(qiáng)度均不及AtWRKY18。在接種不同的病原菌試驗(yàn)中，AtWRKY18表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)在接種細(xì)菌性葉斑菌后4～8 h，而灰霉菌在接種后的24～72 h[17]。水稻中，GroupⅡa基因有4個(gè)成員OsWRKY28、OsWRKY62、OsWRKY71和OsWRKY76，它們都受稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和幾丁質(zhì)激發(fā)子（chitin elicitor）的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，OsWRKY28、OsWRKY71受幾丁質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)在2 h內(nèi)達(dá)到最高，而OsWRKY62、OsWRKY76則在4～8 h內(nèi)[29]，并且誘導(dǎo)強(qiáng)度明顯較前者高[30]。結(jié)合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和大量的內(nèi)源基因表達(dá)分析，可增進(jìn)了解上下游基因之間、不同信號(hào)通路之間關(guān)系，GroupⅡa WRKY基因在病原菌誘導(dǎo)表達(dá)中表現(xiàn)出來(lái)的復(fù)雜現(xiàn)象，可能與不同病菌對(duì)植物為害所依賴的信號(hào)通路不一樣，而不同的Group Ⅱa WRKY基因在相同或不同的網(wǎng)絡(luò)中所扮演的角色也不一樣。

過(guò)量表達(dá)目的基因可放大基因的功能，便于學(xué)者觀察基因功能及下游基因受調(diào)控的情況。在基因過(guò)量表達(dá)試驗(yàn)中，AtWRKY18正調(diào)控細(xì)菌性葉斑病的抗性，AtWRKY40和AtWRKY60則起到負(fù)調(diào)控的作用。過(guò)量表達(dá)AtWRKY18增強(qiáng)成熟擬南芥植株（5～6周）抗細(xì)菌性葉斑病，并提高了抗病相關(guān)基因PR1、PR2、PR5的表達(dá)，但幼齡期轉(zhuǎn)基因植株即不抗DC3000，也不提高前述抗病相關(guān)基因的表達(dá)[17，31]。單獨(dú)過(guò)量表達(dá)AtWRKY40或AtWRKY60的植株對(duì)DC3000抗性沒(méi)有影響，同時(shí)過(guò)量表達(dá)AtWRKY18AtWRKY40或AtWRKY18AtWRKY60兩個(gè)基因植株反而更感DC3000，但是同時(shí)過(guò)表達(dá)AtWRKY40AtWRKY60則沒(méi)有影響。在表型上過(guò)量表達(dá)AtWRKY40和過(guò)量表達(dá)AtWRKY18的表型相似，即出現(xiàn)較多鋸齒狀葉，而過(guò)表達(dá)AtWRKY60則沒(méi)有了出現(xiàn)表型上的明顯變化[17]。過(guò)量表達(dá)OsWRKY71增強(qiáng)水稻植株抗白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，簡(jiǎn)稱Xoo），并提高抗病相關(guān)OsPR1、OsNPR1的表達(dá)[32]。過(guò)量表達(dá)試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明了NPR1信號(hào)通路是GroupⅡa WRKY對(duì)植物抗病性的調(diào)控重要途徑之一，一些過(guò)量表達(dá)GroupⅡa WRKY基因試驗(yàn)中能觀察到NRP1的下游基因PR1明顯上上調(diào)表達(dá)。而一部分試驗(yàn)并沒(méi)有觀察PR基因的明顯變化，其中原因包括不同的GroupⅡa WRKY基因成員功能不同，所依賴信號(hào)通路也不一樣；部分GroupⅡa WRKY基因成員表達(dá)具有時(shí)空的特點(diǎn)，基因功能只能在特定的時(shí)間和空間發(fā)生。

通過(guò)突變或干涉目的基因驗(yàn)證基因功能是最有效的手段。在突變體中，擬南芥GroupⅡa WRKY基因調(diào)控細(xì)菌性葉斑病抗性的作用和基因成員之間相互影響的關(guān)系得到進(jìn)一步證實(shí)，AtWRKY40或AtWRKY60突變（即失去負(fù)調(diào)控作用）后提高細(xì)菌性葉斑病的抗性，但只有在WRKY18也被突變（即失去正調(diào)控作用）的情況下發(fā)生。目前，擬南芥GroupⅡa WRKY基因的單突變體、雙突變、三突變均已獲得，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60中任何一個(gè)基因突變對(duì)細(xì)菌性葉斑菌和灰霉菌的抗性影響不明顯，但是雙突變體wrky18wrky40、wrky18wrky60或三突變體wrky18wrky40wrky60表現(xiàn)出抗細(xì)菌性葉斑菌，而感灰霉菌[17]。雙突變體wrky18wrky40還表現(xiàn)出抗白粉病，而AtWRKY18、AtWRKY40單突變體和野生型擬南芥均不抗白粉病[27]。對(duì)水稻GroupⅡa WRKY基因進(jìn)行干涉后，植株表現(xiàn)抗白葉枯病菌Xoo[33]。

GroupⅡa WRKY基因除了通過(guò)參與某些植物抗病信號(hào)通路來(lái)調(diào)控植物抗病性外，還直接調(diào)控了植物抗性物質(zhì)植保素的合成過(guò)程。在植物植保素合成調(diào)控方面，棉花GaWRKY1可結(jié)合到杜松烯合成酶CAD[（+）-δ-cadinene synthase]基因啟動(dòng)了的W-box上，調(diào)控倍半萜類（Sesquiterpene）植保素的合成，GaWRKY1受病原菌Verticillium dahliae誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[34]。擬南芥無(wú)論接種還是未接種白粉菌，wrky18 wrky40中的camalexin（一種植保素）也極顯著高于野生型。接種白粉菌后，EDS1信號(hào)通路相關(guān)基因EDS1、PAD4、CYP71A13上調(diào)表達(dá)，尤其是wrky18 wrky40中明顯高于野生型。說(shuō)明camalexin合成與EDS1通路在擬南芥白粉菌侵入前的抗病作用十分重要[27]。

2.2 GroupⅡa WRKY基因與植物環(huán)境脅迫

GroupⅡa WRKY基因參與植物的非生物脅迫包括了溫度、水分等的脅迫，其作用方式主要通過(guò)調(diào)控脅迫相關(guān)的信號(hào)通路或調(diào)控脅迫相關(guān)的一些關(guān)健基因。脫落酸ABA信號(hào)途徑參與了干旱、冷、鹽等植物非生物脅迫反應(yīng)[35]，GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控?cái)M南芥的非生物脅迫及ABA信號(hào)通路中作用已經(jīng)有了較為深入的認(rèn)識(shí)，AtWRKY40受到外源ABA處理及鹽、干旱、冷脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[36]。目前，AtWRKY40或其同源基因在非生物脅迫中調(diào)控機(jī)制包括以下幾方面，一是它直接與ABA受體蛋白ABAR互作或直接結(jié)合到ABA信號(hào)通路關(guān)鍵基因的W-box元件上[10，37-39]；二是結(jié)合到脅迫應(yīng)答基因的W-box上；三是結(jié)合到脅迫代謝途徑相關(guān)基因的W-box上。編碼線粒體重要蛋白的3個(gè)關(guān)鍵基因AOX1a（alternative oxidase 1a）、NDB2 （NADH dehydrogenase B2）和BCS1（AAA ATPases）的啟動(dòng)子區(qū)都具有W-box元件，這3個(gè)基因與線粒體反向調(diào)控介導(dǎo)（mitochondrial retrograde regulation）脅迫反應(yīng)密切相關(guān)，AtWRKY40蛋白結(jié)合在這3個(gè)基因的W-box上，調(diào)控了這些基因的表達(dá)[40]。煙草和大豆的GroupⅡa WRKY基因也參與了脅迫應(yīng)答[41]。HvWRKY38與AtWRKY40、OsWRKY71、ABF2同源性很高，低溫處理和干旱明顯誘導(dǎo)該基因的表達(dá)[42]。低溫誘導(dǎo)OsWRKY28和OsWRKY62下調(diào)表達(dá)，鹽脅迫誘導(dǎo)OsWRKY28上調(diào)表達(dá)[43]。牛耳草（Boea hygrometrica）BhWRKY1屬于GroupⅡa WRKY基因（與AtWRKY60、OsWRKY71同源），干旱處理和ABA處理均誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá)，ChIP等的實(shí)驗(yàn)表明，BhWRKY1特異地結(jié)合在肌醇半乳糖苷合成酶GolS（galactinol synthase）基因啟動(dòng)子W-box上，GolS是催化棉子糖家族寡糖RFOs（raffinose family oligosaccharides）生物合成的第一個(gè)步驟，而RFOs是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物干旱、低溫等非生物脅迫中起十分關(guān)鍵的作用[44]。蒺藜科Larrea tridentata植物是沙漠中極耐干旱的常綠灌木，LtWRKY21與AtWRKY40同源，它調(diào)控ABA誘導(dǎo)基因HVA22及ABA信號(hào)通路重要基因VP1、ABI5的表達(dá)[45]。

2.3 GroupⅡa WRKY基因與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的關(guān)系

目前研究顯示，GroupⅡa WRKY基因與大部分的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都有直接或間接的聯(lián)系。NPR1[46-47]和EDS1[26]對(duì)植物抗病性的調(diào)控都常依賴于水楊酸SA（salicylic acid）信號(hào)通路，SA誘導(dǎo)AtWRKY40[17]和AtWRKY18上調(diào)表達(dá)，但過(guò)量表達(dá)AtWRKY18并沒(méi)有提高植株的SA含量[31]。同屬于GroupⅡa的水稻OsWRKY62[30，48]、OsWRKY71[32]、OsWRKY76[48]、葡萄VvWRKY3[49]亦受SA或SA信號(hào)通路激活藥劑BTH（Benzothiadiazole）處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。NPR1還是聯(lián)系SA和茉莉酸JA（jasmonic acid）/乙烯ET（ethylene）信號(hào)通路之間的重要節(jié)點(diǎn)[50]，因此很多參與這信號(hào)通路的基因同時(shí)受到SA和JA的誘導(dǎo)表達(dá)，例如OsWRKY71還受茉莉酸甲酯MeJA和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸ACC（ET的前體）處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[32]；棉花GroupⅡa WRKY基因GaWRKY1受MeJA和SA誘導(dǎo)表達(dá)[34]。JA信號(hào)通路中一些重要的基因如LOX2， AOS， JAZ7， JAZ8和 JAZ10等的啟動(dòng)子區(qū)都具W-box，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了AtWRKY40可結(jié)合到JAZ8的W-box上[27]。MeJA處理野生型擬南芥均能誘導(dǎo)AtWRKY18、AtWRKY40、AtMYC2上調(diào)表達(dá)，在JA信號(hào)通路被阻斷的coi1突變體中則不能被誘導(dǎo)表達(dá)[51]，而AtMYC2、COI1是JA信號(hào)通路中的重要基因[52]，進(jìn)一步說(shuō)明了GroupⅡa WRKY基因與JA信號(hào)通路之間的密切聯(lián)系。擬南芥GroupⅡa WRKY基因與ABA信號(hào)通路的聯(lián)系體現(xiàn)蛋白和基因兩個(gè)層面，在ABA刺激下，應(yīng)用酵母雙雜交（yeast two-hybrid）、CoIP（coimmunoprecipitation）、BiFC（bimolecular uorescence complementation）和生物化學(xué)（biochemical approaches）技術(shù)在體外或體內(nèi)都證實(shí)了AtWRKY40蛋白與ABA受體蛋白AtABAR（ABA receptor）的C端互作，AtWRKY18、AtWRKY60亦與AtABAR互作，但是強(qiáng)度不及AtWRKY40，而無(wú)ABA刺激或無(wú)效濃度的ABA則沒(méi)有互作的現(xiàn)象發(fā)生。AtWRKY40蛋白還可結(jié)合到ABI4和ABI5啟動(dòng)子區(qū)的W-box上，并抑制這2個(gè)基因的表達(dá)[38]，而ABAR、ABI4和ABI5等都是ABA信號(hào)通路中的重要基因[53]。不同GroupⅡa WRKY基因成員或不同的物種上的同源基因受植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)或調(diào)控又有所不同，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA處理中，水稻4個(gè)GroupⅡa WRKY基因只有OsWRKY71受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA處理中，水稻OsWRKY28、OsWRKY62和OsWRKY76均不受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，OsWRKY28僅受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；OsWRKY62受IAA、GA3、SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；OsWRKY76受IAA、GA3、MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[43]。雖然OsWRKY71只受到ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，但是OsWRKY71卻是聯(lián)系A(chǔ)BA和GA信號(hào)通路的重要橋梁[54]。大麥GroupⅡa WRKY基因HvWRKY38則是聯(lián)系A(chǔ)BA、SA與GA信號(hào)通路的重要橋梁[55]。從目前已取得的研究成果看，GroupⅡa WRKY基因與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的關(guān)系可能遠(yuǎn)超目前研究的認(rèn)識(shí)。種子發(fā)芽試驗(yàn)中也說(shuō)明了GroupⅡa WRKY基因與ABA之間的關(guān)系，兩者具有類似的作用。ABA抑制種子的發(fā)芽，擬南芥GroupⅡa WRKY基因表現(xiàn)負(fù)調(diào)控種子發(fā)芽的作用。MS培養(yǎng)基添加ABA發(fā)芽試驗(yàn)中，單基因過(guò)量表達(dá)植株AtWRKY18-OE和AtWRKY60-OE發(fā)芽率都降低，尤其AtWRKY18-OE極顯著降低，對(duì)ABA也特別敏感；wrky18、wrky60提高種子發(fā)芽率，wrky40降低種子發(fā)芽率[39]。

2.4 GroupⅡa WRKY基因之間的關(guān)系

生命是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體，盡管植物GroupⅡa WRKY基因成員只有幾個(gè)，但是成員之間的關(guān)系比較緊密而復(fù)雜。首先GroupⅡa WRKY蛋白結(jié)合能力不同，決定了它們?cè)谀承┕δ苌嫌兄鞔沃?；其次，在一定條件下，某些GroupⅡa WRKY基因功能的實(shí)現(xiàn)有賴于其它成員的表達(dá)情況，即由GroupⅡa WRKY基因主導(dǎo)某些植物性狀取決于不同成員基因產(chǎn)物的平衡關(guān)系。通過(guò)WRKY結(jié)構(gòu)域結(jié)合到靶基因的W-box上調(diào)控基因表達(dá)是多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的主要調(diào)控方式[7-8]，這一方式也在GroupⅡa中得到充分體現(xiàn)，當(dāng)WRKY結(jié)構(gòu)域缺失或被替代，即失去結(jié)合的能力。它們的蛋白不但可以單獨(dú)結(jié)到靶基因的W-box上，而且還可以形成蛋白復(fù)合體的形式增強(qiáng)其結(jié)合到靶基因上的能力。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明（yeast two-hybrid assays）GroupⅡa WRKY蛋白之間可以形成同源（homocomplexes）或異源（heterocomplexes）的蛋白復(fù)合體，復(fù)合體與W-box結(jié)合能力取決于蛋白的組合，即結(jié)合能力從強(qiáng)到弱依次為AtWRKY40、AtWRKY18、AtWRKY60[17]。值得關(guān)注的是，GroupⅡa WRKY與ABA受體蛋白AtABAR的結(jié)合能力與W-box有相似的次序[38]，但目前還缺少GroupⅡa WRKY蛋白復(fù)合體與AtABAR的結(jié)合能力的研究報(bào)道。與W-box的結(jié)合能力除了與GroupⅡa WRKY蛋白種類和構(gòu)成有關(guān)外，還與W-box的兩側(cè)序列有關(guān)，因?yàn)榘谢虻膯?dòng)子區(qū)上往往存在多個(gè)W-box，因此在某些實(shí)驗(yàn)條件下甚至觀察不到AtWRKY60結(jié)合W-box的情況[56]。在基因之間關(guān)系上，無(wú)論在過(guò)量表達(dá)還是在突變體的GroupⅡa WRKY基因?qū)嶒?yàn)中，AtWRKY40和AtWRKY60對(duì)擬南芥的細(xì)菌性葉斑病DC3000抗性負(fù)調(diào)控作用都受到AtWRKY18的影響，即當(dāng)AtWRKY40和AtWRKY60過(guò)量表達(dá)或突變時(shí)，AtWRKY18必需同步過(guò)量表達(dá)或突變才能實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控的作用[17]。在擬南芥白粉病抗性調(diào)控上， AtWRKY18與AtWRKY40同樣表現(xiàn)出緊密的聯(lián)系，2個(gè)基因必需同步突變的植株才抗白粉病[27]。此外，GroupⅡa WRKY還可與其它的WRKY組成蛋白復(fù)合體，如OsWRKY51與OsWRKY71結(jié)合后可以增強(qiáng)OsWRKY71結(jié)合到Amy32b啟動(dòng)子W-box上的能力[54]。雖然已經(jīng)有一些涉及GroupⅡa WRKY基因成員之間關(guān)系的研究事例，但要了解他們之間的作用位點(diǎn)、作用機(jī)制等還有待更多、更深入的研究。

3 展望

GroupⅡa WRKY基因之間無(wú)論在不同的植物上還是在同一植物不同成員之間的序列和空間結(jié)構(gòu)都具有很高的相似性，尤其是WRKYGQK和Cx5Cx23HNH保守結(jié)構(gòu)域部分，但是它們的功能和調(diào)控機(jī)制卻比較復(fù)雜。首先，成員之間功能差異很大，同一種植物內(nèi)不同GroupⅡa WRKY基因之間功能和W-box結(jié)合特性不同。其次，不同種植物上同源基因之間的功能和調(diào)控機(jī)制可能也存在較大的差異，例如同一個(gè)屬內(nèi)的湖北海棠（抗白粉?。┖透皇刻O果（感白粉?。┲g的GroupⅡa WRKY同源基因在白粉病侵染過(guò)程中表達(dá)特點(diǎn)有比較大的差異[57-58]。最后，不同物種的GroupⅡa WRKY基因成員在數(shù)量上差異上也很大，例如擬南芥只有3個(gè)，而玉米多達(dá)7個(gè)，數(shù)量上的差異與功能上的異同有何關(guān)系，其上、下游基因有哪些？目前對(duì)這方面的了解還十分有限。而LZ結(jié)構(gòu)域變化相對(duì)較大，不但在亮氨酸數(shù)量上有變化，而且在亮氨酸兩側(cè)序列變化也十分豐富，除了亮氨酸數(shù)量對(duì)蛋白結(jié)合能力有影響外，亮氨酸兩側(cè)序列和其他非保守結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍捉Y(jié)合能力的影響還有待于更多深入的研究。W-box兩側(cè)序列對(duì)WRKY選擇性結(jié)合或識(shí)別具有十分重要的作用，目前已測(cè)序的被子植物基因數(shù)量都在2萬(wàn)個(gè)以上，很多基因都具有多個(gè)W-box元件，數(shù)量龐大的W-box兩側(cè)序列對(duì)GroupⅡa WRKY的識(shí)別是否有規(guī)律可循值得深知，對(duì)這些問(wèn)題的深入研究將助于了解GroupⅡa WRKY轉(zhuǎn)錄因子如何有序地結(jié)合到不同靶基因的W-box上并實(shí)現(xiàn)其功能。

植物生存常常面臨復(fù)雜變化的環(huán)境和各種各樣的脅迫，不同GroupⅡa WRKY對(duì)各種抗性的調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，目前對(duì)這一過(guò)程的研究也才剛剛開始。GroupⅡa WRKY基因所調(diào)控的很多抗性之間或信號(hào)通路也存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，以及調(diào)控過(guò)程中所依賴的不同植物激素之間都可能存在一定的平衡關(guān)系?；铙w營(yíng)養(yǎng)型病害（如白粉病）和死體營(yíng)養(yǎng)型病害（如灰霉?。┧纳募闹骷?xì)胞命運(yùn)是截然不同的，前者不會(huì)殺死寄主細(xì)胞，后者必須殺死寄主細(xì)胞。不僅如此，植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病害的抗性主要依賴于SA及相應(yīng)的信號(hào)通路，死體營(yíng)養(yǎng)型病害則依賴于JA/ET及相應(yīng)的信號(hào)通路，而SA與JA/ET之間常常表現(xiàn)出拮抗作用[59-62]。然而現(xiàn)有研究結(jié)果表明，GroupⅡa WRKY基因都參與調(diào)控2種病害的抗性，而當(dāng)植物同時(shí)受到2種類型病害侵染或者受到不同類型病原菌交互侵染時(shí)，GroupⅡa WRKY基因如何實(shí)現(xiàn)其調(diào)控功能，還有待進(jìn)一步研究。

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