鉛、鎘脅迫下云南樟幼苗的生理特性變化

唐探　姜永雷　張瑛　等

摘要：選擇原生長狀況基本相同的云南樟半年生實(shí)生幼苗為研究材料，進(jìn)行在不同濃度的鉛、鎘溶液澆灌下云南樟幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)（丙二醛含量、葉片抗氧化酶活性、可溶性蛋白及游離脯氨酸含量）的測定。結(jié)果表明：在不同濃度的Pb2+、Cd2+脅迫下，MDA的含量略高于或顯著高于對照，且總體呈上升的趨勢；隨著Pb2+、Cd2+處理濃度的增加，與對照組相比，SOD活性變化不顯著，POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；低濃度的Pb2+脅迫使得云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯減少，而在Cd2+脅迫下，其可溶性蛋白含量下降不明顯；脯氨酸含量總體呈上升趨勢；Pb2+、Cd2+對云南樟幼苗的毒害作用強(qiáng)度不同，在10 mmol/L的濃度下，Cd2+脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒害作用。

關(guān)鍵詞：云南樟；鉛鎘；脅迫；生理特性

中圖分類號： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0199-03

收稿日期：2014-02-15

基金項(xiàng)目：“省部級重點(diǎn)學(xué)科、省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及校實(shí)驗(yàn)室共享平臺”資助項(xiàng)目；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)面上項(xiàng)目（編號：2010ZC264）。

作者簡介：唐探（1991—），男，江蘇句容人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴铇滟Y源。E-mail：tantan_1991@126.com。

通信作者：程小毛，博士，副教授，主要從事園林植物分子生物學(xué)研究。E-mail：30375713@qq.com。隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，重金屬污染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的問題。在植物方面，重金屬通過對植物生理生化過程的影響，如抑制葉綠素的生物合成，抑制各種參與植物生理生化過程的酶（如根系還原酶、各種氧化酶）以及影響蛋白質(zhì)的生物合成等[1]，導(dǎo)致植物生長發(fā)育不良，甚至引起死亡。

云南樟有凈化有毒空氣的能力，有抗癌功效，能吸煙滯塵、涵養(yǎng)水源、固土防沙和美化環(huán)境，過濾出清新干凈的空氣，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值，因此云南樟成為南方許多城市和地區(qū)園林綠化的首選良木。但是目前關(guān)于云南樟在重金屬方面的研究，尤其在鉛、鎘脅迫方面的研究較少。本試驗(yàn)通過對健康、原生長狀況基本相同的2年生云南樟實(shí)生幼苗進(jìn)行不同濃度的鉛、鎘溶液的處理，研究重金屬鉛、鎘處理下云南樟幼苗生理特性（包括其丙二醛含量、可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化及抗氧化酶活性等方面）的變化，以便更好地了解云南樟幼苗對重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為云南樟的擴(kuò)大栽培及園林應(yīng)用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取云南樟（Cinnamomum glanduliferum）2年生實(shí)生苗為研究材料，選取健康并生長一致的苗木于2012年8月15日移栽到5L塑料盆中，基質(zhì)為“紅土 ∶珍珠巖 ∶腐殖土=3 ∶3 ∶2”的混合基質(zhì)。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組：對照CK，Pb2+處理A組，Pb2+處理B組，Cd2+處理A組，Cd2+處理B組。每組6盆，每盆1株。試驗(yàn)大棚內(nèi)白天溫度范圍為20～30 ℃，夜間溫度范圍為9～18 ℃，相對濕度為35%～80%。處理時(shí)間從2012年9月10日至10月10日，共1個(gè)月時(shí)間。所有指標(biāo)測定在處理結(jié)束時(shí)進(jìn)行，每株選取從上到下的第三至第五片完全展開的葉作為生理生化指標(biāo)的測定樣品，每處理至少5株重復(fù)。

鉛脅迫處理：分別用5 mmol/L Pb（NO3）2溶液（Pb2+A組）和10 mmol/L Pb（NO3）2溶液（Pb2+B組）進(jìn)行處理，每處理10株，每株隔天均勻澆灌10 mL處理溶液，對照組用清水代替，再補(bǔ)充至水分充足。

鎘脅迫處理：分別用10 mmol/L CdCl2溶液（Cd2+A組）和20 mmol/L CdCl2溶液（Cd2+B組）進(jìn)行處理，每處理10株，每株隔天均勻澆灌10 mL處理溶液，對照組用清水代替，再補(bǔ)充至水分充足。

1.3測定項(xiàng)目及方法

1.3.1丙二醛含量的測定[2]葉片測定樣品約0.2 g，在 6 mL 10%三氯乙酸中研磨，然后以12 000 r/min離心10 min。取上清液2mL，再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，充分反應(yīng)后將裝有反應(yīng)液的試管置沸水浴30 min，然后在冰浴中迅速冷卻。然后在10 000 r/min下離10 min，取上清液用分光光度計(jì)（Unicam UV-330，USA）測定其在440、532、600 nm處的吸光度。

1.3.2抗氧化酶活性的測定取約0.2g材料于5mL提取緩沖溶液（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH值70，含1 mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)0.05% Triton X-100，20 g/L 不溶性聚乙烯吡咯烷酮）中研磨成勻漿。經(jīng)過 8 000 r/min 離心20 min，取上清液進(jìn)行酶活性測定。過氧化物酶（POD）：取約含100 μL的酶提取液加入3 mL酶反應(yīng)液中（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖溶液，pH值6.0，含 3 mmol/L 愈創(chuàng)木酚和2.5 mmol/L H2O2）中，充分混勻。于紫外-可見分光光度計(jì)上讀取470 nm處吸光光度值在 2 min 內(nèi)每2 s中的變化[3]。根據(jù)摩爾消光系數(shù) 39.4 mL/（mmol·cm），計(jì)算酶活性。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，EC1.15.1.1，SOD）：本試驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)思唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小[4]。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧負(fù)離子，氧負(fù)離子可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560 nm處有最大吸收。而SOD可清除氧負(fù)離子，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之亦然。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。

1.3.3可溶性蛋白含量的測定以50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH值7.8）為提取液[其中含0.1 mmol/L EDTA及 20 g/L PVP]。稱取0.2 g葉片，用液氮研磨后，加入5mL提取液，進(jìn)一步研磨成勻漿，離心10 min取上清液，加入G-250反應(yīng)后在595 nm處測吸光值，方法參照Bradford等的方法[5]。

1.3.4游離性脯氨酸含量的測定游離脯氨酸的測定采用Bates等的方法[6]。葉片樣品用3%的磺基水楊酸提取，勻漿在 8 000 r/min 離心10 min，上清液用于游離脯氨酸的測定。測定反應(yīng)液包括2 mL提取液、2 mL冰醋酸和2 mL茚三酮，沸水浴60 min后在冰盒中終止反應(yīng)。然后加入4 mL甲苯劇烈振蕩以提取生成的有色產(chǎn)物，取上層有機(jī)層測定其在 520 nm 處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線用L-脯氨酸制作。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)分析都利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行一元方差分析（one-way ANOVA），平均數(shù)間的多重比較采用Ducans檢驗(yàn)方法。P<0.05時(shí)差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1鉛、鎘脅迫對丙二醛（MDA）的影響

MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量是反映膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜受破壞程度的重要標(biāo)志。試驗(yàn)顯示（圖1），與對照組相比，Pb2+處理下的MDA含量總體呈上升趨勢，且Pb2+A處理組的MDA含量上升顯著；Cd2+脅迫下，云南樟幼苗中MDA含量隨著處理濃度的增加而呈上升的趨勢，且與對照組相比，Cd2+B處理組下的MDA含量上升顯著。

2.2鉛、鎘脅迫對葉片抗氧化酶活性的影響

試驗(yàn)顯示（表1），鉛、鎘脅迫對云南樟幼苗的葉片抗氧化酶活性的影響存在差異。與對照組相比，5 mmol/L Pb2+處理下的過氧化物酶（POD）活性上升了25.0%，隨著Pb2+脅迫濃度的進(jìn)一步增大，POD活性呈下降趨勢，10 mmol/L Pb2+處理下的POD活性相比5 mmol/L Pb2+處理下的POD活性下降顯著。與對照組相比，10 mmol/L Cd2+處理下的POD活性上升顯著，隨著Cd2+脅迫濃度的進(jìn)一步增大，POD活性顯著下降，20 mmol/L Cd2+處理下的POD活性相比對照組和10 mmol/L Cd2+處理下的POD活性分別下降了30.30%和40.92%。重金屬脅迫會引起超氧化物歧化酶（SOD）活性發(fā)生改變，但在本試驗(yàn)中Pb2+、Cd2+處理的SOD活性變化幅度較小。

表1鉛、鎘脅迫下超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的變化

處理組超氧化物歧化酶

（U/mg）過氧化物酶

[μmol/（min·mg）]CK727.46±18.02a1 860.90±101.66bPb2+A733.10±30.54a2 325.61±242.82cPb2+B718.31±26.22a1 771.30±133.53bCd2+A728.87±9.31a2 195.49±401.54bcCd2+B736.15±8.61a1 296.99±220.21aP0.818ns0.002**注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著，P<0.05。每個(gè)值代表5個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；下表同。

2.3鉛、鎘脅迫對葉片可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.3.1鉛、鎘脅迫對葉片可溶性蛋白含量的影響可溶性蛋白含量變化可以作為檢測植物葉片功能和衰老的一個(gè)指標(biāo)[7]。由圖2可以看出，在受到Pb2+脅迫時(shí)，云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量顯著下降，且Pb2+A和Pb2+B處理組之間的可溶性蛋白含量差異顯著。在受到Cd2+脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量下降不明顯。隨著Pb2+、Cd2+濃度的進(jìn)一步增大，云南樟幼苗可溶性蛋白含量變化不明顯。

2.3.2鉛、鎘脅迫對葉片脯氨酸含量的影響試驗(yàn)顯示（圖3），在Pb2+脅迫下，與對照組相比，Pb2+處理的云南樟幼苗葉片中脯氨酸含量總體呈上升趨勢，且Pb2+A處理組脯氨酸含量相比對照組上升明顯。在Cd2+脅迫下，隨著Cd2+濃度的增加，云南樟幼苗葉片中的脯氨酸含量均顯著上升。表明云南樟幼苗在受到Pb2+、Cd2+脅迫時(shí)，可以通過自身脯氨酸含量的積累提高細(xì)胞的滲透勢，并進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以減少逆境脅迫下細(xì)胞組織的失水。

3結(jié)論與討論

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映植物遭受逆境傷害的程度，含量越高，植物遭受到的傷害越大[8]。本試驗(yàn)中，與對照組相比，不同濃度的Pb2+、Cd2+脅迫下，MDA的含量略高于或顯著高于對照，且總體呈上升的趨勢。這在覃勇榮等研究鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態(tài)分析中有類似報(bào)道[9]。說明在Pb2+、Cd2+脅迫下，云南樟幼苗葉片細(xì)胞內(nèi)的活性氧增加，打破活性氧的代謝平衡，導(dǎo)致膜脂過氧化嚴(yán)重，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使細(xì)胞受到傷害。

SOD是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的主要保護(hù)酶，能減少活性氧自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[10-12]。本試驗(yàn)中，隨著Pb2+、Cd2+處理濃度的增加，SOD活性變化不顯著。這在前人研究中有過類似報(bào)道[13]。POD的主要作用是清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2，以及由此產(chǎn)生的有機(jī)過氧化物ROOH，在植物體內(nèi)抗氧化代謝中起重要作用[14]。本試驗(yàn)中，在Pb2+、Cd2+脅迫下，POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，這說明當(dāng)POD活性隨著脅迫濃度的增大而上升時(shí)，植物通過提高保護(hù)酶的活性來清除體內(nèi)的自由基，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到一定值時(shí)，POD活性開始降低，這可能是由于其傷害程度超過了植株防御反應(yīng)的閾值，酶的結(jié)構(gòu)或合成受到破壞，從而使POD的活性喪失[15]。SOD和POD活性的差異也說明了在逆境脅迫下不同抗氧化酶所起的作用及機(jī)制并不相同，而在本試驗(yàn)中，云南樟幼苗主要通過提高POD的活性來清除Pb2+、Cd2+脅迫下產(chǎn)生的自由基及緩解其膜脂過氧化作用。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。重金屬毒害能夠刺激蛋白酶的水解活性，使可溶性蛋白變性、降解，從而使酶參與的許多生理活動紊亂[16]。在本試驗(yàn)中，低濃度的Pb2+脅迫使得云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯減少，而在Cd2+脅迫下，其可溶性蛋白含量下降不明顯，這可能是不同重金屬脅迫下，可溶性蛋白含量的變化趨勢不同，其原因有待于進(jìn)一步研究。脯氨酸含量是反映植物受逆境脅迫的重要指標(biāo)，對維持細(xì)胞水分平衡起著重要的作用，并具有清除活性氧的功能[16-18]。在本試驗(yàn)中，與對照組相比，Pb2+、Cd2+脅迫下的脯氨酸含量總體呈上升趨勢，且Pb2+A、Cd2+A、Cd2+B處理組的脯氨酸含量顯著上升，這與崔大練等的研究結(jié)果[19]一致，說明云南樟幼苗通過提高脯氨酸含量來提高細(xì)胞滲透勢，維持細(xì)胞水分平衡。此外，相同濃度下，Cd2+A處理組脯氨酸含量明顯高于Pb2+B處理組的含量，說明此時(shí)Cd2+對植物的傷害更加嚴(yán)重，植物會產(chǎn)生更多的脯氨酸來耐受重金屬的傷害。

綜上所述，云南樟幼苗在Pb2+A處理下，所測的生理指標(biāo)大多數(shù)與對照差異顯著，而在Pb2+B處理下，所測的所有生理指標(biāo)與對照無明顯差異，分析低濃度的Pb2+脅迫下，是否對云南樟幼苗的生理指標(biāo)影響較大，而高濃度的Pb2+脅迫下對其生理指標(biāo)無明顯影響這一問題仍有待進(jìn)一步研究。Cd2+脅迫下，與對照相比，Cd2+B處理組所測的生理指標(biāo)相對于Cd2+A處理組的生理指標(biāo)更加顯著，綜合各項(xiàng)指標(biāo)看出，高濃度的Cd2+脅迫對云南樟幼苗的傷害程度更大。而同一濃度的重金屬離子Pb2+、Cd2+對云南樟幼苗的脅迫程度也不同，在10 mmol/L的濃度下，Cd2+脅迫對云南樟幼苗的傷害更大。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ranieri A，Castagna A，Scebba F，et al. Oxidative stress and phytochelatin characterisation in bread wheat exposed to cadmium excess[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2005，43（1）：45-54.

[2]Hodges D M，Delong J M，F(xiàn)orney C F，et al. Improving the thiobarturic acid-reactive substances assay for estimating lipid peroxidtion tissues containing anthocyanin and other interfering compompounds[J]. Planta，1999（207）：604-611.

[3]Lin J S，Wang G X. Doubled CO2 could improve the drought tolerance better in sensitive cultivars than in tolerant cultivars in spring wheat[J]. Plant Science，2002，163（3）：627-637.

[4]Giannopolitis C N，Ries S K. Superoxide dismutase in higher plants[J]. Plant Physiology，1977，59：309-314.

[5]Bradford K J，Sharkey T D，F(xiàn)arquhar G D. Gas exchange，stomatal behavior，and δ13C values of the flacca tomato mutant in relation to abscisic acid[J]. Plant Physiology，1983，72（1）：245-250.

[6]Bates L S，Waldren R P，Teare I D. Rapid determination of free proline for water-stress studies[J]. Plant and Soil，1973，39：205-207.

[7]俞慧娜，徐根娣，楊衛(wèi)韻，等. 錳處理對大豆生理特性的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（7）：35-38.

[8]陳會，任艷芳，陳秀蘭，等. 鎘脅迫下不同耐性水稻植株幼苗生長和抗氧化酶的變化[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：1099-1104.

[9]覃勇榮，馮濟(jì)梅，梁文忠，等. 鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態(tài)分析[J]. 河池學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32（2）：17-21，59.

[10]陳倩，陶功勝，謝寅峰，等. 高氯酸鉀脅迫對水稻幼苗光合作用及保護(hù)酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：715-721.

[11]周守標(biāo)，王春景，楊海軍，等. 菰和菖蒲對重金屬的脅迫反應(yīng)及其富集能力[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（1）：281-287.

[12]王志穎，劉鵬. 檸檬酸抑制劑對鋁脅迫下油菜抗氧化酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（5）：957-966.

[13]李卜，吳妤，李奕松. 鎘脅迫對棗樹幼苗葉片生理特性的影響[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27（1）：22-25.

[14]李文一，徐衛(wèi)紅，胡小鳳，等. Zn脅迫對黑麥草幼苗生長、生理生化及Zn吸收的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（5）：190-194.

[15]原海燕，黃蘇珍，郭智，等. 鋅對鎘脅迫下馬藺生長、鎘積累及生理抗性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（9）：2111-2116.

[16]袁沛果，龔玥綺，李卜，等. 鎘脅迫對酸棗幼苗生長及生理特性的影響[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（3）：14-17.

[17]S mirnoff N. The role of active Oxygen in the response of plants to water deficit and desiccation[J]. New Photologist，1993，125（1）：27-58.

[18]夏禮如，錢春桃. 復(fù)合鈉鹽脅迫對黃瓜幼苗生長及生理特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（1）：147-150.

[19]崔大練，馬玉心，俞興偉. 重金屬Zn2+·Cd2+對田菁生理生化指標(biāo)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：376-378.劉忠偉，裴占陽，陳偉，等. 倒毛雞生物學(xué)特性、屠宰性能及肉質(zhì)性狀研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：202-205.