新疆棉花黃萎病拮抗放線菌的分離與篩選

來(lái)娜娜+朱文豪+劉政+等

摘要：為獲得對(duì)新疆地區(qū)棉花黃萎病具有拮抗活性的土壤放線菌，從新疆不同地區(qū)棉田采集24份健康棉花根際土樣，通過平板稀釋法分離純化得到放線菌561株。經(jīng)室內(nèi)平板對(duì)峙法篩選獲得101株具有拮抗棉花黃萎病菌作用的放線菌，獲得抑菌圈直徑≥17 mm的放線菌5株，其中TD3-2-1的抑菌圈直徑達(dá)20.07 mm，其發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌菌絲抑菌率達(dá)79.7%。TD3-2-1具有作為生防菌的潛能。

關(guān)鍵詞：棉花黃萎?。环啪€菌；拮抗作用；分離；生物防治

中圖分類號(hào)： S435.621.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0119-02

收稿日期：2014-03-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360452）。

作者簡(jiǎn)介：來(lái)娜娜（1987—），女，甘肅蘭州人，碩士研究生，從事植物病害生物防治研究。 E-mail：lainana1234@qq.com。

通信作者：王曉東，博士，副教授，從事植物病害生物防治研究。E-mail：wxd_agr@shzu.edu.cn。新疆是我國(guó)最大的商品優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地，棉花產(chǎn)業(yè)是新疆地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè)。由于棉花種植面積擴(kuò)大、常年連作、頻繁調(diào)引品種和秸稈還田等原因[1-2]，棉花黃萎病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，該病具有寄主廣泛、土壤傳播快、抗逆性強(qiáng)和變異性大等特點(diǎn)[3]，給新疆棉花生產(chǎn)造成極大危害，已成為制約新疆棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要限制因素[4]。目前，國(guó)內(nèi)外防治棉花黃萎病主要通過培育抗病品種、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)措施和植物檢疫等。經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐檢驗(yàn)的陸地棉抗黃萎病新材料的選育迄今尚未取得重大突破[4-5]，主要原因在于棉花黃萎病菌在全國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)存在著大量不同的生理小種，攜帶黃萎病抗性基因的品種非常少[6]，且抗病性是相對(duì)的、暫時(shí)的；另外，育種材料中嚴(yán)重缺乏廣譜抗黃萎病的類型[7-9]。采用化學(xué)防治不僅造成環(huán)境污染，而且對(duì)防治棉花黃萎病菌及形成的微菌核效果不佳。農(nóng)業(yè)措施中使用較多的是輪作，該方法需要將宿主作物與非宿主植物（如單子葉植物）輪作4～5季才有較好的效果[10]。鑒于此，篩選出病菌高效拮抗菌，人為增施生物菌劑已成為棉花黃萎病綜合防治中最具潛力的防治措施之一[11]。通過對(duì)新疆多個(gè)棉區(qū)棉花根際土壤中微生物的大量分離，以期篩選出對(duì)棉花黃萎病菌具有高效拮抗作用的放線菌菌株，為新疆棉花黃萎病生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣采集從新疆石河子、庫(kù)爾勒、阜康、阿瓦提、昭蘇等地棉田中，用五點(diǎn)取樣法采集土樣24份。采集土樣時(shí)，隨機(jī)選取健康棉株，距棉株主干5 cm處，用小鏟撥去地表土層，以見棉花根系為宜，取土樣約200 g，裝入保鮮袋內(nèi)，注明采集日期、地點(diǎn)、土質(zhì)和土樣編號(hào)等，置于室溫下風(fēng)干備用。

1.1.2供試菌株棉花黃萎病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）MK-XJ，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室王曉東提供。

1.1.3供試培養(yǎng)基高氏一號(hào)培養(yǎng)基[12]：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7.4～7.6。不加瓊脂為高氏一號(hào)培養(yǎng)液。121 ℃滅菌26 min后備用。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，切成小塊后放入1 000 mL蒸餾水中煮15 min，紗布過濾后加瓊脂18 g、葡萄糖20 g，溶化后補(bǔ)足水分至1 000 mL。121 ℃滅菌26 min后備用。

1.2土壤放線菌的分離純化

采用平板稀釋法進(jìn)行[1]。稱取土樣10 g，放入90 mL含有玻璃珠的無(wú)菌水中（150 mL三角瓶），28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u培20 min，靜置15 min后，在無(wú)菌條件下吸取土壤懸浮液，用無(wú)菌水依次稀釋至10-2、10-3、10-4，然后用移液器吸取100 μL稀釋液均勻涂布在高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，表面晾干后，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，挑出形態(tài)各異的放線菌菌落，通過平板稀釋劃線法進(jìn)行純化，所獲菌株進(jìn)行編號(hào)后，保存在4 ℃保鮮柜中備用。

1.3拮抗放線菌的初篩

采用平板對(duì)峙法[12]進(jìn)行拮抗放線菌的初篩。將MK-XJ的孢子菌懸液濃度調(diào)至1×107 CFU/mL，無(wú)菌條件下吸取 40 μL 均勻涂布在PDA培養(yǎng)基平板上，表面晾干后備用。放線菌培養(yǎng)5 d后用無(wú)菌打孔器（打孔直徑5 mm）沿菌落同心環(huán)上進(jìn)行打孔，挑取菌餅放入涂布有MK-XJ孢子的PDA培養(yǎng)基平板上，每皿均勻分布3塊菌餅，放在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，觀察放線菌抑菌情況，并利用“十”字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4拮抗放線菌的復(fù)篩

對(duì)初篩中具有拮抗MK-XJ作用的放線菌再次進(jìn)行篩選。對(duì)峙后的培養(yǎng)皿放在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，進(jìn)行觀察和測(cè)量。具體方法同“1.3”節(jié)。

1.5拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)MK-XJ菌絲生長(zhǎng)的影響

1.5.1放線菌發(fā)酵液的制備挑取新鮮拮抗放線菌菌絲塊，接種至100 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)液（250 mL三角瓶）中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液4 ℃、1×104 r/min離心20 min后，傾出上清液，經(jīng)膜孔0.45 μm細(xì)菌器過濾后，放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)MK-XJ菌絲生長(zhǎng)的影響將生長(zhǎng)良好的MK-XJ菌落用無(wú)菌打孔器制成菌餅（打孔直徑7 mm），浸泡在稀釋10倍的放線菌發(fā)酵液中，處理30 min后，取出晾干。挑取菌餅放入PDA培養(yǎng)基平板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。利用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑。以高氏一號(hào)培養(yǎng)液為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式：生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-7 mm）×100% 。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 8.0中的方差分析程序（ANOVA）分析上述各試驗(yàn)中不同處理間的差異顯著性。抑菌率數(shù)據(jù)在進(jìn)行方差分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)化。處理之間的差異顯著性采用Duncans新復(fù)極差法（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1土壤放線菌的分離及拮抗菌初步篩選

由表1可知，從新疆不同地區(qū)采集的24份土樣中分離得到561株放線菌。從中獲得101株對(duì)MK-XJ具有不同程度拮抗作用的放線菌，占分離菌株總數(shù)18.0%。抑菌圈直徑 ≥10 mm 的放線菌有59株，占分離菌株總數(shù)10.52%；抑菌圈直徑≥15 mm 的放線菌29株，占分離菌株總數(shù)5.2%。

表1新疆棉田土壤放線菌分離及拮抗菌的篩選

序

2.2拮抗放線菌的復(fù)篩

對(duì)初篩獲得的29株具有拮抗MK-XJ作用的放線菌進(jìn)行二次篩選，結(jié)果獲得抑菌圈≥17 mm的拮抗放線菌5株，對(duì)這5株放線菌進(jìn)行第3次篩選，結(jié)果（圖1）表明，菌株 TD3-2-1 的抑菌圈直徑為2007 mm，與其他菌株差異顯著。

2.3拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)MK-XJ菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，供試5株拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)MK-XJ菌絲生長(zhǎng)均具有不同程度的抗生作用。其中，放線菌TD3-2-1抑菌率最大，為79.7%，與其他放線菌菌株抑菌率差異顯著。放線菌GS-22發(fā)酵處理后的抑菌率為55.7%，LG-22抑菌率為58.5%，兩者間差異不顯著。

3討論

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的一種真菌性土傳病害，主要侵染棉株維管束系統(tǒng)，引起棉花大幅度減產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外雖已在棉花抗黃萎病育種、農(nóng)業(yè)措施及化學(xué)防治等方面做了大量的研究，并取得了一定成果，但仍然未從根本上解決該病的防治問題[13]。在探索新的防治途徑中，利用拮抗性微生物已成為棉花黃萎病最具前景的防治手段之一[14]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)對(duì)棉花黃萎病有防效的拮抗微生物做了大量篩選，其中對(duì)生防細(xì)菌和真菌研究較多[15-18]，而對(duì)拮抗放線菌的研究較少。放線菌是一類土壤和植物根際的重要微生物種群，分布廣泛，抗逆性較強(qiáng)，所生產(chǎn)的抗生素種類繁多、功能各異，這些突出的特征在植物病害生物防治中起著至關(guān)重要的作用[19]。劉大群等從土壤中分離獲得了一株拮抗鏈霉菌Men-myco-93-6，研究發(fā)現(xiàn)該菌及其次生代謝產(chǎn)物對(duì)不同致病力的棉花黃萎病菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)棉花具有增產(chǎn)效果[20]。本研究從新疆不同棉區(qū)土樣中經(jīng)大量分離和多次篩選，成功獲得一株對(duì)棉花黃萎病具有拮抗作用的放線菌菌株TD3-2-1，其發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)79.7%，具有良好的生防潛質(zhì)。拮抗放線菌的篩選進(jìn)一步拓寬了棉花黃萎病拮抗微生物種類的篩選范圍，可為今后棉花黃萎病的生防工作提供參考。放線菌TD3-2-1對(duì)棉花黃萎病的生防機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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