TPX2在食管胃交界部腺癌中的表達及臨床意義

沈亮 許一鳴 丁勝光 仲崇俊

TPX2在食管胃交界部腺癌中的表達及臨床意義

沈亮 許一鳴 丁勝光 仲崇俊

目的 研究TPX2在食管胃交界部腺癌組織中的表達，并探討其臨床意義。方法 采用免疫組織化學法分析80例食管胃交界部腺癌、41例癌旁不典型增生組織及48例正常胃黏膜組織中TPX2蛋白的表達；運用RT－PCR法檢測TPX2mRNA在40例食管胃交界部腺癌、36例癌旁不典型增生組織和28例正常胃黏膜組織中的表達水平。結果 食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生組織及正常胃黏膜組織中的TPX2蛋白陽性率分別為71．2%（57／80）、53．7%（22／41）和31．2%（15／48），三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝10．315，P＝0．018）；TPX2mRNA陽性率分別為77．5%（31／40）、69．4%（25／36）和7．1%（2／28），三組間比較差異也有統(tǒng)計學意義（χ2＝7．468，P＝0．025）。TPX2蛋白及mRNA在食管胃交界部腺癌組織中表達的陽性率隨著腫瘤浸潤深度增加、淋巴結轉移和腫瘤分期增高而逐漸增高（P＜0．05），而與性別、年齡及組織分化程度均無關（P＞0．05）。結論 TPX2的異常表達可能是食管胃交界部上皮細胞癌變與浸潤轉移的重要因素，TPX2的檢測有利于食管胃交界部腺癌的早期診斷和預后判斷。

TPX2； 食管胃交界部腺癌； RT－PCR； 免疫組織化學

食管胃交界部腺癌作為常見的消化道腫瘤，多種癌基因的突變和抑癌基因的失活可能對其發(fā)生、發(fā)展產生重要作用，但具體的分子機制尚不清楚［1］。TPX2（targeting protein for Xklp2靶蛋白）定位于人類染色體20q11．2，是一個受細胞周期嚴格調控的核增殖蛋白，在細胞有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮重要作用［2］。TPX2的異常表達與食管鱗癌、宮頸鱗癌等惡性腫瘤的關系密切，但對食管胃交界部腺癌影響的相關報道還較少。本研究通過免疫組織化學SP法和RT－PCR法檢測食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生組織及正常胃黏膜組織中TPX2蛋白及TPX2mRNA的表達情況，探討其在食管胃交界部上皮細胞癌變過程中的作用。

材料與方法

一、標本來源

收集2013年8月至2015年4月在南通市第一人民醫(yī)院胸心血管外科治療的80例食管胃交界部腺癌患者的標本。80例患者中，男性59例，女性21例；年齡42～77歲。術后病理：組織學分級Ⅰ級27例，Ⅱ級32例，Ⅲ級21例；浸潤黏膜層14例，侵達肌層29例，侵達漿膜37例；伴淋巴結轉移69例，無淋巴結轉移11例；TNM分期，Ⅰ期9例，Ⅱ期33例，Ⅲ期38例。全部標本分別在無壞死區(qū)癌灶、癌旁3cm內（41例病理證實為上皮不典型增生）及遠端正常胃黏膜取材。每例標本取材時均分為2份，一份取材后立即放置在液氮中冷凍，用于RT－PCR法檢查TPX2mRNA的表達；另一份用4%甲醛固定，用于免疫組織化學法檢測TPX2蛋白的表達。

二、SP法檢測TPX2蛋白的表達

采用免疫組織化學SP法檢測TPX2蛋白的表達。免疫組織化學試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，TPX2兔抗人多克隆抗體購自Bioward公司。TPX2抗體稀釋度為1︰500，DAB顯色，蘇木精復染，具體步驟按SP試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知TPX2陽性的宮頸鱗癌組織切片作陽性對照。TPX2陽性細胞定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。400倍顯微鏡下觀察5個視野的陽性細胞數，評定標準以陽性細胞核占全部細胞核的百分比界定，核染色≤0表示“＋”，11%～30%表示“＋＋”，31%～50%表示“＋＋＋”，＞50%表示“＋＋＋＋”，其中核染色＞10%（＋＋以上）被判為陽性表達［3］。

三、RT－PCR法檢查TPX2mRNA的表達

取100mg標本組織，采用TrizolTM（Invitrogen公司，美國）方法進行總RNA的提取，并按照試劑盒說明進行樣品濃度和純度的測定。收取的RNA溶于DEPC處理過的去離子水，—80℃冰箱保存。RT－PCR引物設計采用軟件Oligio6．0，TPX2上游引物：5’－GCCCTTTGTTCCCAAGAAAGA－3’，下游引物：5’－AGCAGTGGAATCGAGTGGAGA－3’，擴增片段長度335bp。內參β－actin上游引物：5’－CATCCTGCGTCTGGACCT－3’，下游引物：5’－TCAGGAGGAGCAATGATCTTG－3’，擴增片段長度480bp。PCR反應體系：10mmol／L dNTPs混合物25μL，Taq DNA聚合酶（5IU／μL）0．5 μL，cDNA模板2μL，上、下游引物（10μmol／L）各0．5μL，DEPC水11μL，補水至25μL。PCR反應條件：95℃變性5min后，95℃30s，56℃30s，72℃1min，25個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。RT－PCR產物經15g／L瓊脂糖凝膠電泳分離［4］。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11．0軟件進行統(tǒng)計學分析，TPX2蛋白和mRNA表達的陽性率采用百分比表示，三種組織類型間的陽性率比較采用χ2檢驗。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、食管胃交界部腺癌、癌旁不典型增生組織及正常胃黏膜組織中TPX2蛋白和TPX2mRNA的表達

TPX2蛋白陽性信號位于細胞核內，呈棕黃色顆粒（圖1）。正常胃黏膜、癌旁不典型增生組織及食管胃交界部腺癌組織中TPX2蛋白陽性率依次增高，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝10．315，P＝0．018）。

RT－PCR擴增結果見圖2，正常胃黏膜組織中TPX2mRNA呈低表達，食管胃交界部腺癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織中TPX2 mRNA的陽性率分別為77．5%（31／40）、69．4%（25／36）和7．1%（2／28），三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7．468，P＝0．025）（表1）。二、TPX2蛋白和mRNA表達與食管胃交界部腺癌臨床特點的關系

食管胃交界部腺癌組織中TPX2蛋白和mRNA表達的陽性率與癌組織浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期有關（P＜0．05），隨著腫瘤浸潤深度增加、淋巴結轉移及腫瘤分期增高，TPX2表達的陽性率也逐漸增高（P＜0．05）；而在不同性別、年齡、組織分化程度患者中，TPX2表達的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（表2）。

討 論

食管胃交界部腺癌不僅發(fā)病率高，而且容易侵襲和轉移，嚴重威脅人類的健康及生命［5］。近年來，隨著外科手術、輔助放化療等各項治療技術的不斷改進，食管胃交界部腺癌的診斷及治療效果得到了明顯地提高。但由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多因素的復雜過程，導致食管胃交界部上皮細胞癌變的詳細分子機制不明確，目前還沒有特別有效的方法實現對食管胃交界部腺癌的早期診斷和有效治療［6］。因此，尋找與食管胃交界部腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的分子標志物或基因，可以為腫瘤的預防、早期診斷和有效治療提供更加有效的方法。

圖1 免疫組織化學法檢測TPX2蛋白的表達 SP×400。A：正常胃黏膜組織；B：癌旁不典型增生組織；C：食管胃交界部腺癌組織。

圖2 RT－PCR法檢測TPX2mRNA的表達。M表示marker；A表示正常胃黏膜膜組織；B表示癌旁不典型增生組織；C表示食管胃交界部腺癌組織。

表1 TPX2蛋白和mRNA在不同類型組織中的表達

TPX2作為一種表達受細胞周期嚴格調控的基因，定位于人類染色體20q 11．2。在細胞周期的Gl－S交界期，TPX2開始出現，有絲分裂完成后消失。在S和G2期，TPX2分布在細胞核；而在有絲分裂期，TPX2通過與紡錘體的密切結合使動力蛋白XkIp2靶向結合到紡錘體微管，從而保證紡錘體的正常極性和姐妹染色單體的正確分離［7］。TPX2的異常表達能夠抑制有絲分裂過程中正常核分裂的完成，干擾自身生理途徑的激活，最終導致中心體擴增、異倍體形成，從而引起細胞的過度增殖，導致惡性腫瘤的形成［8］。同時，TPX2也可以通過影響細胞信號轉導途經促進腫瘤細胞的分裂，增強腫瘤細胞的侵襲力。相關研究［9］認為 TPX2參與了STAT3和JAK1信號途徑，上調JAK2、STAT1、鈣黏蛋白E和CD44的表達，下調Cyclin D1的表達。因此，TPX2的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。既往的研究［10］顯示，TPX2在肺腺癌、宮頸鱗癌等腫瘤中呈高表達。但在食管胃交界部腺癌中的表達及其與食管胃交界部腺癌侵襲轉移關系的研究，國內外文獻報道較少。明確TPX2在食管胃交界部腺癌組織中的表達及其對浸潤轉移的影響，可以為食管胃交界部腺癌的早期診斷和基因靶向治療提供新的思路和理論依據。

表2 TPX2與食管胃交界部腺癌臨床特點的關系

國內外很多學者采用免疫組織化學、RT－PCR、Western Blot等方法檢測凋亡相關基因、細胞增殖相關基因、DNA損傷與修復相關基因以及信號轉導相關基因等在多種腫瘤中的表達狀態(tài)，通過觀察癌基因與抑癌基因表達水平的改變來進一步探討腫瘤細胞癌變的分子機制［11］。目前，已有學者采用RTPCR等方法對食管鱗癌組織中TPX2mRNA的表達進行了研究，結果提示TPX2與食管鱗癌的生物學行為關系密切，并可作為其預后評價的指標［12］。本研究顯示：TPX2在正常胃黏膜上皮細胞中呈低表達，而在癌旁不典型增生組織及食管胃交界部腺癌組織中表達明顯增高，提示TPX2的異常表達在食管胃交界部上皮細胞癌變過程中起到了重要的促進作用，是腫瘤發(fā)生的主要分子機制。腫瘤細胞的浸潤和侵襲能力反映了腫瘤的惡性程度，也是造成其轉移、擴散和影響預后的主要原因。本研究同時提示隨著腫瘤浸潤深度的增加、淋巴結的轉移及腫瘤分期的增高，TPX2的表達也逐漸增高，這一結果與TPX2在宮頸鱗癌等組織中的表達基本一致，也進一步提示TPX2與腫瘤的侵襲轉移關系密切，是腫瘤復發(fā)轉移的危險因素，可以成為判斷癌癥預后的重要指標。當然，本研究目前僅通過蛋白及mRNA的檢測來分析TPX2與食管胃交界部腺癌的關系，尚缺少分子水平、細胞水平的驗證，需通過進一步研究來證實TPX2基因對食管胃交界部腺癌的影響。

綜上所述，TPX2作為一種潛在的癌基因，通過參與細胞周期的調控來促進腫瘤細胞的增殖，影響腫瘤細胞的凋亡。TPX2的異常表達與食管胃交界部腺癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切，可以成為食管胃交界部腺癌早期診斷及預后判斷的新指標。

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3 林冬梅，馬瑩，肖汀，等．TPX2在肺鱗狀細胞癌及其癌前病變中的表達和意義［J］．中華病理學雜志，2006，35（9）：504．

4 劉紅春，李瑩瑩，劉玉含，等．食管鱗癌組織中TPX2mRNA的表達及與臨床病理生物學特征的關系［J］．臨床與實驗病理學雜志，2010，26（2）：708－710．

5 Tong T，Zhong Y，Kong J，et al．Over expression of Aurora A contributes to malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2014，10（21）：304－306．

6 Lin DM，Ma Y，Xiao T，et al．TPX2expression and its significance in esophageal squamous cell carcinoma［J］．Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2015，35（9）：540．

7 Shigeishi H，Ohta K，Hiraoka M，et al．Expression of TPX2in salivary gland carcinomas［J］．Oncol Rep，2009，21：341－344．

8 Warner SL，Stephens BJ，Nwokenkwo S，et al．Validation of TPX2as a potential therapeutic target in pancreatic cancer cells［J］．Clin Cancer Res，2015，15：6519－6528．

9 Vos JW，Pieuchot L，Evrard JL，et al．The Plant TPX2 protein regulates prospindle assembly before nuclear envelope breakdown［J］．Plant Cell，2008，20（10）：2783．

10 常海平，王敬芝，田原，等．宮頸鱗癌組織中TPX2的表達及其臨床意義［J］．中國實用婦科與產科雜志，2012，28（9）：685－687．

11 Gritsko TM，Coppola D，Paciga JE，et al．Activation and over expression of centrosome kinase BT AK Aurora A in human ovarian cancer［J］．Clin Cancer Res，2003，9（4）：1420－1429．

12 Krams M，Heidebrecht HJ，Hero B，et al．Repp86expression and outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］．J Clin Onco，2003，21（9）：1810．

Expression of TPX2 in esophageal gastric junction adenocarcinoma and its clinical significance

Shen Liang，Xu Yiming，Ding Shengguang，Zhong Chongjun．Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，Nantong First People’s Hospital，Nantong 226001，China

Zhong Chongjun，Email：dllll423423＠163．com

Objective To investigate the expression of TPX2in esophageal gastric junction adenocarcinoma and its clinic significance．Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of TPX2protein in 80cases of esophageal gastric junction adenocarcinoma，41cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 48cases of normal gastric mucosa tissues．RT－PCR was adopted to determine the expression of TPX2mRNA in 40cases of esophageal gastric junction adenocarcinoma，36cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 28cases of normal gastric mucosa tissues． ResultsThe positive rates of TPX2protein expression in esophageal gastric junction adenocarcinoma，adjacent atypical hyperplasia tissues and normal gastric mucosa tissues were 71．2%（57／80），53．7%（22／41）and 31．2%（15／48），respectively，and there were significant differences among them（χ2＝10．315，P＝0．018）．The positive rates of TPX2mRNA expression were 77．5%（31／40），69．4%（25／36）and 7．1%（2／28），respectively，and there were significant differences among them（χ2＝7．468，P＝0．025）．The positive rates of expression of TPX2protein and mRNA in esophageal gastric junction adenocarcinoma increased with the infiltration depth，lymph node metastasis and tumor staging（P＜0．05），while were not related to sex，age and tissue differentiation（P＞0．05）．Conclusions The abnormal expression of TPX2may be involved in early carcinogenesis，infiltration and metastasis of esophageal gastric junction adenocarcinoma，and the detection of TPX2expression may play an important role in the early diagnosis and prognosis prediction in patients with esophageal gastric junction adenocarcinoma．

TPX2； Esophageal gastric junction adenocarcinoma； RT－PCR； Immunohistochemistry

2015－08－20）

（本文編輯：周珠鳳）

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2015．04．005

南通市衛(wèi)生局青年科研基金（WQ2014021）

226001 南通市第一人民醫(yī)院胸心血管外科

仲崇俊，Email：dllll423423＠163．com

沈亮，許一鳴，丁勝光，等．TPX2在食管胃交界部腺癌中的表達及臨床意義［J／CD］．中華胸部外科電子雜志，2015，2（4）：232－236．