miR-34a對鼻咽癌細胞增殖的負性調控作用

程忠強 蔣成義 韓躍峰 王斌

有關研究資料顯示［1］,miR-34a在鼻咽癌組織中表達下調,并與患者不良臨床病理特征相關；生物信息學分析顯示,受體絡氨酸激酶家族成員AXL的mRNA3’-UTR具有miR-34a特異性結合的序列,是miR-34a的下游靶點之一。研究證實［2］,AXL mRNA和蛋白的表達水平在鼻咽癌組織中均顯著高于對應癌旁組織。鼻咽癌組織中AXL高表達與出現(xiàn)遠處轉移和較高的TNM分期及患者不良預后顯著相關。因此,推測miR-34a可能在鼻咽癌細胞中通過抑制AXL/PI3K/Akt/Snail信號通路進而抑制癌細胞上皮間質轉化,最終發(fā)揮抗腫瘤侵襲作用。本研究進一步分析miR-34a在鼻咽癌組織中的表達情況及其對患者預后的影響,利用基因轉染技術,在鼻咽癌細胞株中過表達miR-34a,研究其對鼻咽癌細胞生物學特性的影響,闡明miR-34a在鼻咽癌侵襲、轉移中的作用機制,探討其應用于鼻咽癌基因治療的潛在價值,為鼻咽癌治療提供新思路?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院耳鼻喉頭頸外科2018年1月～2019年1月收治的60例鼻咽癌患者,根據(jù)miR-34a在鼻咽癌組織中的表達狀態(tài)分為miR-34a高表達組(鼻咽癌組織中miR-34a相對表達量/對應癌旁組織中miR-34a相對表達量≥1)、miR-34a低表達組(miR-34a相對表達量/對應癌旁組織中miR-34a相對表達量＜1),各30例。miR-34a低表達組男18例,女12例；平均年齡(67.3±4.9)歲。miR-34a高表達組男20例,女10例；平均年齡(66.8±5.0)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),具有可比性。納入標準：患者均在知情下參與；均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準通過；未接受過放化療。排除標準：中途退出本次研究者；依從性差者。

1.2方法 患者均行手術切除或病理活檢的鼻咽癌及對應癌旁組織。

1.2.1培養(yǎng)方法 在37°C細胞培養(yǎng)箱中,每隔48～72 h使用酶消化細胞進行細胞傳代,后續(xù)實驗應用傳代2～3代細胞。

1.2.2定時定量聚合酶鏈式反應檢測miR-34a在不同細胞株中的表達情況 收集細胞后加入Trizol (1 ml)、異丙醇,離心后,收集RNA沉淀物；檢測RNA的純度以及完整性,檢測miR-34a；按照試劑說明書配置反轉錄反應體系,合成cDNA。

1.2.3細胞劃痕試驗 取轉染48 h后的CNE-2細胞,以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸并接種于6孔板上,接種密度以過夜可鋪滿平板為準。每孔細胞均采用200 μl無菌移液器吸頭縱向劃線。以PBS洗去懸浮細胞,采用無血清DMEM培養(yǎng)基在含5% CO2的37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察并拍攝細胞遷移情況。

1.2.4細胞侵襲試驗 基質膠使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至1 mg/ml后包被transwell小室底部膜的上室面。取轉染48 h后的CNE-2細胞,以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并調整細胞密度至2.5×105/ml。在transwell小室內(nèi)加入200 μl細胞懸液,將transwell小室置于24孔板中,并在24孔板內(nèi)添加750 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。細胞在含5% CO2的37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后置于4% 多聚甲醛溶液中固定2 min,然后于甲醇中浸潤20 min。棉棒輕柔擦去transwell小室底部膜的上室面細胞,將下室面置于0.3%結晶紫溶液中染色15 min,PBS洗去多余染料。在顯微鏡下觀察、計數(shù)侵襲細胞數(shù)目。

1.3觀察指標 比較鼻咽癌組織及對應癌旁組織中miR-34a的相對表達量；不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量；miR-34a高表達組和miR-34a低表達組患者5年總生存率和5年無病生存率。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線法分析生存率。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1鼻咽癌組織及對應癌旁組織中miR-34a的相對表達量比較 鼻咽癌組織miR-34a的相對表達量(2.654±0.198)低于對應癌旁組織的(5.401±0.447),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 鼻咽癌組織及對應癌旁組織中miR-34a的相對表達量比較(±s)

表1 鼻咽癌組織及對應癌旁組織中miR-34a的相對表達量比較(±s)

注：與對應癌旁組織比較,aP＜0.05

2.2不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較 不同年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；不同淋巴結轉移和TNM分級患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較(±s)

表2 不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較(±s)

注：不同淋巴結轉移和TNM分級比較,P＜0.05

2.3miR-34a高表達組和miR-34a低表達組患者5年總生存率和5年無病生存率比較 miR-34a高表達組患者5年總生存期率和5年無病生存率分別為60.0%(18/30)、33.3%(10/30),與miR-34a低表達組的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA,通過與靶基因3’未翻譯區(qū)域結合介導基因轉錄后水平的調控功能［3］。miRNA在細胞生長和細胞分化以及腫瘤形成等生理病理過程中起著重大作用,現(xiàn)階段來看,在多種腫瘤中已經(jīng)檢測到miRNA的表達,并且與腫瘤的生長和腫瘤的轉移等惡性生物學特征密切相關［4］。因此,研究miRNA對腫瘤細胞的具體作用機制且改變細胞內(nèi)的表達水平等具有重要意義。

miRNA參與到鼻咽癌患者的惡性轉化過程,通過不同靶點發(fā)揮出抑癌基因作用。有關研究資料顯示［5］,miR-34a低表達或者失表達是腫瘤演化中的常見情況,miR-34a主要扮演抑癌基因。有關研究顯示［6］,miR-34a在鼻咽癌組織中表達下調,并與患者不良臨床病理特征相關,但在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本文研究結果顯示,鼻咽癌組織miR-34a的相對表達量(2.654±0.198)低于對應癌旁組織的(5.401±0.447),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示鼻咽癌組織miR-34a相對表達量低于正常水平。miR-34a誘導細胞周期停滯,促進細胞凋亡,增強放化療的敏感度。除此之外,miR-34a還參與到腫瘤干細胞分化過程之中,促使腫瘤干細胞分化,有關研究顯示［7］,miR-34a可顯著阻止腫瘤的生長。由于不同腫瘤具有不同的遺傳學背景,因此miR-34a的抑制腫瘤增殖機制也表現(xiàn)不同。體外實驗研究資料顯示［8］,miR-34a過度表達可顯著抑制鼻咽癌患者的克隆形成能力以及增殖能力,與此同時促進腫瘤凋亡。

本文研究結果顯示,不同年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；不同淋巴結轉移和TNM分級患者鼻咽癌組織的miR-34a相對表達量比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。miR-34a高表達組患者5年總生存期率和5年無病生存率分別為60.0%(18/30)、33.3%(10/30),與miR-34a低表達組的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示miR-34a的相對表達與不良臨床病理特征密切相關。有關資料顯示,miR-34a與EB病毒感染關系較為密切,EB病毒感染狀態(tài)與miR-34a密切相關。由于鼻咽癌與EB病毒感染密切相關,因此在有關研究中需謹慎選擇實驗對象［9,10］。

綜上所述,miR-34a在鼻咽癌細胞中的表達量低于正常細胞,并且與患者的不良臨床病理特征密切相關,上調miR-34a表達能夠顯著抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲。