LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應(yīng)用

王艷蓉張治國(guó)吳金霞

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州 730000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應(yīng)用

王艷蓉1張治國(guó)2吳金霞2

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州 730000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

干旱、鹽堿、高溫和寒冷等逆境制約著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。植物中含有一組親水性極強(qiáng)的蛋白，稱為胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA蛋白），在自然條件下這種蛋白質(zhì)一般在種子發(fā)育晚期積累，其對(duì)多種非生物脅迫具有很強(qiáng)的抵抗能力，并能響應(yīng)干旱、寒冷、高鹽和ABA等信號(hào)。LEA蛋白通過(guò)保持細(xì)胞滲透壓、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、作為分子伴侶保護(hù)其他蛋白等方式維持植物正常的代謝反應(yīng)。就LEA蛋白的分類、結(jié)構(gòu)、抗逆機(jī)制以及在植物抗逆改良中的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

LEA蛋白；非生物脅迫；植物抗逆性

植物所在環(huán)境常常會(huì)對(duì)其生存產(chǎn)生各種不利的影響，這些不利的環(huán)境因素統(tǒng)稱為逆境。其中非生物脅迫，如干旱、鹽堿、寒冷及澇害制約植物的生長(zhǎng)，并造成作物減產(chǎn)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物形成不同的生理和生化過(guò)程以適應(yīng)或應(yīng)對(duì)非生物脅迫。植物的這種抵抗脅迫的能力被稱為抗逆性［1］。當(dāng)不利環(huán)境來(lái)臨時(shí)，植物通過(guò)代謝反應(yīng)積累一些保護(hù)物質(zhì)或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如糖醇、甜菜堿和甘氨酸等）來(lái)維持正常的生理生化代謝或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，以降低環(huán)境脅迫帶來(lái)的損害。

1 LEA蛋白簡(jiǎn)介

1981年，Dure等［2］最早從棉花的子葉中分離得到一類蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)在棉花胚胎晚期大量積累，并且使胚胎具有干旱耐受性，被命名為胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA蛋白）。不久，在其他植物的種子和營(yíng)養(yǎng)器官中相繼發(fā)現(xiàn)LEA蛋白，而且大多是在導(dǎo)致植物細(xì)胞脫水的情況下得到的。LEA蛋白不僅存在玉米（Zeamays）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）和小麥（Triticum aestivum）等高等植物中，而且在低等植物，如藻類［3］、苔蘚植物［4］和蕨類植物［5］，甚至在細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌［6］及一些無(wú)脊椎動(dòng)物，如蛭形輪蟲(chóng)（Philodina roseola）［7］等中也存在LEA蛋白，這說(shuō)明LEA蛋白并不是植物所特有的，而是廣泛分布于生物界中。LEA蛋白的積累往往是和寒冷、高鹽及干旱造成的細(xì)胞失水緊密聯(lián)系，在外源ABA的誘導(dǎo)下，許多營(yíng)養(yǎng)器官也可以產(chǎn)生積累LEA蛋白，這說(shuō)明LEA蛋白既是植物階段發(fā)育的產(chǎn)物又是可被誘導(dǎo)的，并且是無(wú)組織專一性的。大多數(shù)LEA蛋白的分子量較小，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等極性氨基酸殘基，缺乏色氨酸、半胱氨酸殘基，這使得LEA蛋白具有極強(qiáng)的親水性和熱穩(wěn)定性。大多數(shù)LEA蛋白具有與親水性蛋白類似的保守氨基酸序列。因此，有些時(shí)候LEA蛋白也被分類為親水性蛋白質(zhì)。親水性蛋白的一個(gè)顯著的特點(diǎn)是含有大量的甘氨酸，但并非所有的LEA蛋白都是具有高甘氨酸含量的，所以現(xiàn)在普遍認(rèn)為L(zhǎng)EA蛋白與親水性蛋白在分類上是重疊的。

2 LEA蛋白的分類

最早，Baker等［8］根據(jù)在棉花種子中分離到的一些LEA蛋白的cDNA和基因序列曾對(duì)LEA蛋白進(jìn)行過(guò)分類闡述。但隨著更多的LEA蛋白在其他物種中被發(fā)現(xiàn)，Dure等［9］根據(jù)每個(gè)組群所含的特定基序?qū)EA蛋白分為3個(gè)組：第1組LEA蛋白包含一個(gè)由20個(gè)親水性氨基酸所組成的基序；第2組LEA蛋白的特征是具有至少2-3個(gè)被Close等［10］命名為K（EKKGIMDKIKEKLPG）、Y（DEYGNP）和S（Sn）的基序；而第3組LEA蛋白具有由11個(gè)氨基酸組成的多拷貝基序（TAQAAKEKAXE）。另一種分類方式是由Dure［11］所提出的，分類的依據(jù)是棉花種子原型標(biāo)記，即D-19為第1族，D-11為第2族，D-7為第3族。第2族LEA蛋白也被稱為“脫水蛋白”，因其是一類由脫水誘導(dǎo)的蛋白，但“脫水蛋白”這個(gè)命名貌似很牽強(qiáng)，因?yàn)槠渌宓腖EA蛋白大多也可以被脫水所誘導(dǎo)。這3族涵蓋了大多數(shù)LEA蛋白，但其他LEA蛋白難以分類。對(duì)此，Bray［12］豐富了這種分類方式，一些小的LEA蛋白族被提出：D-113為第4族，D-29為第5族，D-34為第6族。此外，還有兩個(gè)未編號(hào)的特例：LEA5（D-73）和LEA14（D-95）。根據(jù)這個(gè)分類方式，新發(fā)現(xiàn)的LEA蛋白可以根據(jù)氨基酸序列或特定的基序編入這幾族中，但還是有極個(gè)別的LEA蛋白不能分入其中。

第1族LEA蛋白是由小麥Em基因所表達(dá)的，并被分為兩個(gè)超家族［13］。通過(guò)圓二色譜（circular dichroism，CD）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）結(jié)構(gòu)分析表明，第1族LEA蛋白在溶液中形成高比例的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（70%-82.5%），一小部分形成左右螺旋或者多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)［14］。雖然其大多包含的是無(wú)規(guī)則卷曲，但一般具有由20個(gè)氨基酸殘基組成的序列GGETRKEQLGEEGYREMGRK，這些氨基酸可以占到全序列的20%-40%，其中甘氨酸殘基的含量約為18%，并且均為極性氨基酸，所以具有極強(qiáng)的親水性，可以作為細(xì)胞內(nèi)保水劑，在植物遭遇干旱、高鹽脅迫時(shí)防止細(xì)胞失水并降低高鹽離子對(duì)細(xì)胞的損害。在小麥Em蛋白體外重組試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Em蛋白防止檸檬酸合成酶在干燥或寒冷的情況下凝聚或失活［15］。值得一提的是第1族LEA蛋白不僅在植物中被發(fā)現(xiàn)，也在枯草芽孢桿菌和鹵蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)，并且具有保水的功能［16］。第1族LEA蛋白一般在胚胎發(fā)育中積累，尤其是在干燥的種子中含量豐富，此外在干旱脅迫的組織器官中也發(fā)現(xiàn)它的存在。

第2族LEA蛋白包括3個(gè)超家族，常被稱為“脫水蛋白”，其主要存在于包括藻類在內(nèi)的植物中。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是具有1-3個(gè)特殊的基序：富含賴氨酸的K基序（EKKGIMDKIKEKLPG）、Y基序（DEYGNP）和由多聚絲氨酸組成的S基序（Sn）［9］。其中K基序在一個(gè)多肽中可以存在1-11個(gè)不等的拷貝，并且常常穿插有保守的F基序；Y基序一般存在于肽鏈的N端，有1-35個(gè)拷貝不等；由于富含絲氨酸，S基序往往能被磷酸化。根據(jù)所含基序不同，根據(jù)基序的排列順序第2族LEA蛋白可分為5個(gè)亞族：K亞族、SK亞族、YSK亞族、YK亞族和KS亞族。與第1族LEA蛋白相似，盡管具有一定含量的α螺旋結(jié)構(gòu)，第2族LEA蛋白仍然包含大量無(wú)規(guī)則卷曲的蛋白質(zhì)，無(wú)論是高溫、金屬離子還是鹽都不能使其形成有序的結(jié)構(gòu)，因此它也是一類親水性蛋白；由于含有豐富的游離羥基，它可以對(duì)細(xì)胞液與細(xì)胞膜具有穩(wěn)定的作用，從而維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；同時(shí)第2族LEA蛋白還可以作為分子伴侶對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行包裹保護(hù)，從而降低干旱對(duì)植物的損傷。當(dāng)外源ABA、干旱、高鹽脅迫信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，第2族LEA蛋白會(huì)在植物體內(nèi)大量合成積累，表現(xiàn)出對(duì)脅迫信號(hào)的敏感性。據(jù)報(bào)道，第2族LEA蛋白在所有植物的種子中均有發(fā)現(xiàn)，而且在非維管植物（如苔蘚）和蕨類植物（如卷柏［17］）中也有發(fā)現(xiàn)。

第3族LEA蛋白最主要的結(jié)構(gòu)特征是具有由11個(gè)氨基酸組成的重復(fù)基序［10］，但這族LEA蛋白還包含其他的保守基序，如D-7亞族、D-29亞族，它們所含有的保守基序與11個(gè)氨基酸組成的保守基序（TAQAAKEKAXE）并不完全相同，這就使得第3族LEA蛋白相對(duì)于其他族LEA蛋白具有多樣性。圓二色譜與紅外光譜分析表明第3族LEA蛋白大多缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)，在溶液中主要形成無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，但在緩慢脫水時(shí)，第3族LEA蛋白能形成β片層結(jié)構(gòu)；在快速脫水或甘油、甲醇等有機(jī)溶劑存在時(shí)，則能形成特定的α螺旋結(jié)構(gòu)。此外，SDS也會(huì)促進(jìn)其折疊，說(shuō)明這些蛋白的結(jié)構(gòu)與脫水速率有關(guān)［18］。如果將脫水的蛋白重新溶于水中，有序的α螺旋和β片層結(jié)構(gòu)又會(huì)重新形成無(wú)規(guī)則卷曲，證明這些結(jié)構(gòu)的互變是可逆的［19］。在成熟的種子和花粉細(xì)胞中第3族LEA蛋白可以像可溶性糖一樣使細(xì)胞質(zhì)在極度脫水的情況下保持穩(wěn)定。在豌豆線粒體中發(fā)現(xiàn)的第3族LEA蛋白可以與磷脂雙分子層相互作用，并保護(hù)其免受干燥的損傷。第3族LEA蛋白廣泛分布于高等植物中，在藻類、苔蘚、蕨類植物中也有發(fā)現(xiàn)。有趣的是，在脫水的情況下，一些細(xì)菌［20］和線蟲(chóng)［21］也會(huì)積累類似于第3族LEA蛋白的蛋白質(zhì)。在昆蟲(chóng)［22］與甲殼類動(dòng)物［23］中也發(fā)現(xiàn)有第3族LEA蛋白的存在。同樣的，第3族LEA蛋白可以響應(yīng)高鹽、干旱、低溫和ABA信號(hào)，并且一些成員還可以響應(yīng)缺氧［24］和高光強(qiáng)［25］信號(hào)。本族LEA蛋白在細(xì)胞中呈均勻分布，在成熟的棉花胚胎中濃度可達(dá)200 mmol/L［26］，且存在于所有的細(xì)胞質(zhì)溶膠中，這樣的定位可以使LEA蛋白更全面的發(fā)揮其功能。在對(duì)小麥的研究中發(fā)現(xiàn)中，小麥根部缺少第3族LEA蛋白的植株會(huì)在干旱環(huán)境下死亡。積累在小麥葉綠體中的第3族LEA-L2蛋白可以明顯增加植株的耐寒性，使用組成型表達(dá)的小麥LEA-L2蛋白基因轉(zhuǎn)化擬南芥也獲得了相同的結(jié)果，植株的耐寒性明顯增加［25］。還有報(bào)道稱，在煙草中過(guò)表達(dá)玉米的第3族LEA蛋白ZmLEA3可以提高植株對(duì)丁香假單胞菌的抗性［27］。這證明LEA蛋白不僅對(duì)非生物脅迫具有抗性，而且對(duì)生物脅迫也起一定的作用。另外，最近的研究表明，鹵蟲(chóng)的類第3族LEA蛋白可以在脫水和高鹽環(huán)境中提高果蠅細(xì)胞的活力［28］。

第4族LEA蛋白最主要的一個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：在其N(xiāo)端具有一個(gè)基序1［AQEKAEKMTA（R/H）DPXKEMAHERK（E/K）（A/E）（K/R）］。根據(jù)所含其他特征基序不同，又可以將第4族LEA蛋白分為2個(gè)亞族：4A亞族具有一個(gè)包含基序2的由80-124個(gè)氨基酸殘基組成的肽段；4B亞族包含一個(gè)更長(zhǎng)的肽段，含有108-180個(gè)氨基酸殘基，從棉花中分離的D-113蛋白就屬于4B亞族。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明本族LEA蛋白的前70-80個(gè)氨基酸殘基可以形成α螺旋結(jié)構(gòu)，而其余的部分則形成無(wú)規(guī)則卷曲。大豆GmPM16蛋白在水溶液中呈無(wú)定型狀態(tài)，不過(guò)在1% SDS或脫水的狀態(tài)下，該蛋白90%的部分會(huì)形成有序的α螺旋，且這些構(gòu)象變化是可逆的［29］。最早發(fā)現(xiàn)的第4族LEA蛋白是棉花的D-113蛋白，它均勻分布在所有胚胎組織中，濃度可達(dá)300 mmol/L［26］。盡管第4族LEA蛋白對(duì)ABA有響應(yīng)［30］，但在逆境中ABA是如何調(diào)控LEA蛋白表達(dá)的還不得而知。不過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平分析中表明，一些第4族LEA蛋白表達(dá)的下降與組蛋白的去乙?；嘘P(guān)［31］。在擬南芥D-113同源蛋白的體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)乳酸脫氫酶具有保護(hù)作用，即使是在99%失水的條件下，也能保持乳酸脫氫酶的活性［32］。番茄中瞬時(shí)沉默第4族LEA蛋白基因會(huì)造成植株對(duì)干旱的敏感性提高［33］。這些都表明第4族LEA蛋白在植物應(yīng)對(duì)干旱環(huán)境時(shí)起到了重要作用。

第5族LEA蛋白相對(duì)于其他族LEA蛋白具有更高比例的疏水性氨基酸殘基，凡是疏水氨基酸殘基比例比典型LEA蛋白高的LEA蛋白都包含在本族中，因此本族的LEA蛋白并不都是同源的。根據(jù)其序列相似性可以將第5族LEA蛋白分為5A、5B和5C三個(gè)亞族。在煮沸的情況下，本族LEA蛋白會(huì)形成不可溶的球狀蛋白結(jié)構(gòu)。第5族LEA蛋白同樣在種子發(fā)育晚期積累，并可以被干旱、寒冷、高鹽、紫外線和機(jī)械損傷等信號(hào)所誘導(dǎo)。

最早發(fā)現(xiàn)的第6族LEA蛋白是菜豆的PvLEA18蛋白［34］，迄今已在36種維管植物中發(fā)現(xiàn)了第6族LEA蛋白，它們的顯著特征是具有較小的分子質(zhì)量，一般7-14 kD，并且具有高度保守的氨基酸序列。在所包含的4個(gè)明顯的基序中，基序1和基序2是高度保守的，基序1保守序列為L(zhǎng)EDYK，第6位和第7位分別是脯氨酸和蘇氨酸殘基，基序2則是100%保守的。通常情況下第6族LEA蛋白具有高度的親水性，缺乏半胱氨酸與色氨酸殘基。SDSPAGE電泳顯示第6族LEA蛋白的遷移率比通過(guò)氨基酸序列推導(dǎo)預(yù)測(cè)的遷移率高，其所處的是無(wú)定型狀態(tài)。第6族LEA蛋白一般也是在干種子和花粉中積累的，同時(shí)響應(yīng)干旱和ABA信號(hào)，在生長(zhǎng)發(fā)育中也會(huì)表達(dá)。例如，在分生組織中，如頂端分生組織和根原基，維管束中及表皮中都有第6族LEA蛋白的積累，亞細(xì)胞定位顯示其在營(yíng)養(yǎng)器官的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)。與其他族LEA蛋白不同的是，第6族LEA蛋白不能防止酶的脫水失活，其靶蛋白有別于其他族LEA蛋白［32］。

第7族LEA蛋白又叫做ASR蛋白，屬于親水性蛋白質(zhì)，它們的分子質(zhì)量較小，具有很高的熱穩(wěn)定性，且多為無(wú)定型蛋白［35］。ASR蛋白在許多雙子葉和單子葉植物中被發(fā)現(xiàn)，在裸子植物，如火炬松［36］、銀杏［37］中也有報(bào)道，不過(guò)在擬南芥中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ASR蛋白或同源基因。所有發(fā)現(xiàn)的ASR蛋白中都包含3個(gè)高度保守的基序，并且都位于肽鏈的C端。其還包含一個(gè)核定位信號(hào)［38］，番茄的亞細(xì)胞組分分離試驗(yàn)中表明，ASR1蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，不過(guò)有的ASR蛋白也位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)［39］。ASR基因的表達(dá)模式在不同植物中是不同的，其會(huì)在衰老、果實(shí)成熟、種子成熟和花粉成熟過(guò)程中積累。ASR蛋白也可以響應(yīng)干旱、高鹽、寒冷和ABA信號(hào)，不過(guò)在馬鈴薯中的ASR基因同源物DS2不能響應(yīng)ABA［40］。番茄的ASR1蛋白在水溶液中呈無(wú)定型狀態(tài)，不過(guò)這種無(wú)序的構(gòu)象在結(jié)合鋅離子之后可以轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻臉?gòu)象，這種構(gòu)象的改變也可以由脫水引起［35］。

3 LEA蛋白的作用機(jī)制

3.1 作為分子伴侶保護(hù)其他蛋白

LEA蛋白家族中很多成員可以起到保護(hù)細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的作用，尤其是第2族LEA蛋白可以保護(hù)乳酸脫氫酶免受凍害的損傷。最近的研究顯示，大多數(shù)LEA蛋白在干旱的條件下可以保護(hù)對(duì)脫水敏感的酶，如乳酸脫氫酶、延胡索酸酶、檸檬酸合成酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等。Goyal等［15］的試驗(yàn)表明LEA蛋白的保護(hù)功能有一部分是通過(guò)防止脫水敏感性蛋白的凝聚而發(fā)揮作用的，這與分子伴侶在逆境中的作用是相同的。結(jié)構(gòu)分析表明，許多LEA蛋白確實(shí)具有與一些分子伴侶相同的多態(tài)結(jié)構(gòu)，這也進(jìn)一步證明了上述觀點(diǎn)。對(duì)第1族LEA蛋白EM和第3族LEA蛋白（線蟲(chóng)的AavLEA1蛋白）研究表明，它們沒(méi)有像經(jīng)典的熱休克蛋白那樣在高溫下防止檸檬酸合成酶的凝聚的能力，但是具有一些抗脫水分子伴侶的功能。通常分子伴侶不僅可以防止蛋白質(zhì)的凝聚，還可以與靶蛋白短暫地形成復(fù)合物，但目前尚不知道LEA蛋白是否也與其靶蛋白形成復(fù)合物。LEA蛋白發(fā)揮作用的機(jī)制并不復(fù)雜，它就像一個(gè)“分子盾牌”保護(hù)著其他蛋白。無(wú)定型的、高親水的LEA蛋白在細(xì)胞失水、細(xì)胞內(nèi)容物密度增大時(shí)可以降低變性多肽間的相互作用，從而降低了其凝聚的可能性［41］。

3.2 去除金屬離子

細(xì)胞失水會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子濃度的上升，這可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)大分子的結(jié)構(gòu)從而影響其功能。由于LEA蛋白富含大量極性氨基酸殘基，可以使其螯合離子。Wise［42］發(fā)現(xiàn)鈣離子可以與2b族和3a族LEA蛋白相結(jié)合。2b族酸性LEA蛋白ERD10、COR47和ERD14在被磷酸化后可以和鈣離子結(jié)合。質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明這3個(gè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)位于絲氨酸豐富的基序。本族的Xero2由于不含有這段多聚絲氨酸基序，所以不能被磷酸化，不能結(jié)合鈣離子。盡管本族的中性蛋白DHR18也含多聚絲氨酸基序，并可以被磷酸化，但是其不能結(jié)合鈣離子。這說(shuō)明酸性氨基酸殘基在結(jié)合鈣離子中也起著重要作用。第2族LEA蛋白可以結(jié)合其他金屬離子，但作用機(jī)理與結(jié)合鈣離子是不同的。通過(guò)一系列的試驗(yàn)表明Fe3+與LEA蛋白具有最高的親和力，其次是Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+。而且許多第2族LEA蛋白可以響應(yīng)重金屬離子信號(hào)，如暴露于汞離子、鎘離子或銅離子的小球藻和菜豆，其中的第2族LEA蛋白基因表達(dá)會(huì)上調(diào)。第2族LEA蛋白與金屬離子的結(jié)合也可能與抗氧化功能有關(guān)，如柑橘的CuCOR19蛋白可以保護(hù)脂質(zhì)體免受過(guò)氧化作用的侵害［43］。體外試驗(yàn)表明，CuCOR19蛋白可以清除羥自由基和過(guò)氧化物自由基［44］，這些活性氧都是由金屬離子催化產(chǎn)生的，并且對(duì)機(jī)體具有毒害作用。脫水會(huì)使這些有催化作用的金屬離子在體內(nèi)積累。所以LEA蛋白不僅可以直接清除活性氧，而且可以通過(guò)螯合催化產(chǎn)生活性氧的金屬離子來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害［45］。

3.3 穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)

Steponkus等［46］對(duì)Cor15am的研究表明，LEA蛋白可以與膜結(jié)合并且穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。小麥的第2族酸性LEA蛋白WCOR410在冷脅迫條件下會(huì)聚集在質(zhì)膜上，特別是易受寒冷影響的組織中WCOR410積累量更多。雖然很多第2族LEA蛋白都定位于細(xì)胞膜上，但是其他明顯的例子還沒(méi)有找到。Koag等［47］在結(jié)構(gòu)上闡述了酸性小單層囊泡上的第2族LEA蛋白的折疊方式，但是并沒(méi)有能夠揭示其功能。然而最近的研究表明，豌豆線粒體中的第3族LEA蛋白LEAM可以在干燥環(huán)境下抑制小單層囊泡的融合，并且能改變其凝膠晶體的相變溫度［19］。Tolleter等［48］認(rèn)為L(zhǎng)EAM可以在干燥環(huán)境下保護(hù)線粒體內(nèi)膜并且占據(jù)大部分膜與蛋白結(jié)合的區(qū)域，這可能對(duì)氧化磷酸化過(guò)程有所影響，而這種機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3.4 作為水和緩沖劑

具有高親水性的LEA蛋白還可以作為水合緩沖劑在干燥的環(huán)境下降低細(xì)胞水分流失的速率。在干旱、高鹽條件下細(xì)胞失水是不可避免的，水合緩沖劑可以保留足夠的水分使蛋白質(zhì)保持活性。例如，在第2族LEA蛋白的存在下，α淀粉酶在20%聚乙二醇的水溶液中還可以具有活性［49］。Mouillon等［50］闡述了這樣一個(gè)模型，在通常情況下LEA蛋白以無(wú)規(guī)卷曲形態(tài)存在，這種形態(tài)是高度水合狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞失水時(shí)，這種無(wú)規(guī)卷曲會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪挺抡郫B結(jié)構(gòu)，從而釋放結(jié)合的水分到細(xì)胞質(zhì)中。LEA蛋白就是這樣通過(guò)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?cè)诩?xì)胞嚴(yán)重脫水的情況下增加細(xì)胞內(nèi)的水分。

4 LEA蛋白在植物抗逆改良中的應(yīng)用

眾所周知，各種非生物脅迫嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。LEA蛋白作為植物在防御非生物脅迫過(guò)程中的重要一員，在減少環(huán)境脅迫對(duì)自身傷害中起到重要的作用。基于LEA蛋白的這種特性，利用基因工程技術(shù)使植物過(guò)表達(dá)內(nèi)源或外源的LEA蛋白，已經(jīng)使多種轉(zhuǎn)基因植物提高了自身的抗逆性，這在植物抗逆改良研究與應(yīng)用中具有極高的價(jià)值和意義。

Xu等［51］運(yùn)用基因槍轉(zhuǎn)化方法，將actin1基因啟動(dòng)子連接大麥HVA1基因構(gòu)成的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻發(fā)現(xiàn)，水稻的葉片與根中都有HVA1蛋白積累，植株的耐旱性和抗鹽性都有顯著提高。使用玉米u(yù)bi1啟動(dòng)子在小麥中過(guò)表達(dá)HVA1基因獲得的轉(zhuǎn)化株系具有更高的水分利用效率，在干旱環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株的干重相比野生型有了顯著提高［52］。HVA1基因也被應(yīng)用于桑樹(shù)的改良，運(yùn)用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，組成型表達(dá)HVA1基因，可以明顯的提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗鹽性。進(jìn)而應(yīng)用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A連接HVA1基因轉(zhuǎn)化桑樹(shù)獲得的植株，解除了組成型表達(dá)基因在正常條件下的發(fā)育遲緩現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)游離脯氨酸、膜穩(wěn)定系數(shù)和PSⅡ活性的測(cè)定，轉(zhuǎn)基因株系提高了對(duì)干旱、高鹽和寒冷的耐受性［53］。同樣，在匍匐翦股穎中轉(zhuǎn)化HVA1基因賦予了轉(zhuǎn)基因植株在極度缺水的條件下的生存能力［54］。

Cheng等［55］分別用小麥的第1組LEA蛋白PMA1959基因和第2組LEA蛋白PMA80基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因株系具有較強(qiáng)的抗旱和抗鹽性，通過(guò)分子水平的檢測(cè)證明轉(zhuǎn)基因植株抗逆性的獲得與LEA蛋白的積累是密切相關(guān)的。玉米的第5組LEA蛋白R(shí)ab28基因是在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的，并且在組織中可以被干旱和ABA所誘導(dǎo)。使用玉米的組成型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)Rab28，后代轉(zhuǎn)基因植株可以穩(wěn)定積累Rab28蛋白。相比于野生型，轉(zhuǎn)基因種子在干旱條件下具有較高的發(fā)芽率，轉(zhuǎn)基因植株可以在15%的PEG溶液中生長(zhǎng)，并且植株具有更高的含水量、較少的葉綠素降解和較低的丙二醛含量，這一切可以證明Rab28能顯著提高玉米的抗逆性［56］。OsLEA3-1是可以由干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)的LEA蛋白基因，使用從旱稻分離出的OsLEA3-1的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、CaMV 35S和水稻actin1啟動(dòng)子分別在干旱敏感型粳稻中花11中過(guò)表達(dá)OsLEA3-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除轉(zhuǎn)化actin1啟動(dòng)子外的轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下，相比野生型都有產(chǎn)量上的提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)擁有較少拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因株系在正常條件下具有較少的產(chǎn)量損失［57］。同樣是在水稻中，Moumita等［58］從耐鹽水稻品種Pokkali中分離得到一種第2組LEA蛋白R(shí)ab16A，并用自身誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在鹽敏感秈稻品種Khitish中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用高鹽處理轉(zhuǎn)基因植株時(shí)Rab16A蛋白會(huì)隨著種子的成熟不斷在葉片中積累，并且降低植株葉綠素的破壞，減少鈉離子的積累和鉀離子的流失，這都揭示了Rab16A對(duì)植物的保護(hù)作用。

Wu等［59］在丹參中分離出一種LEA14組LEA蛋白，命名為SmLEA，將SmLEA基因轉(zhuǎn)化丹參獲得的轉(zhuǎn)基因植株在模擬干旱和高鹽條件下具有較快的根伸長(zhǎng)率和較低的丙二醛含量，并具有很高的超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽濃度，這對(duì)名貴藥材丹參的分子育種具有重要的意義。在甘薯愈傷組織中過(guò)表達(dá)甘薯的LEA14組LEA蛋白基因IbLEA14，使愈傷組織具有更強(qiáng)的干旱和鹽離子的耐受性，而轉(zhuǎn)化RNAi載體的愈傷組織表現(xiàn)出對(duì)脅迫的敏感性［60］。早在1994年Godoy等［61］就發(fā)現(xiàn)了番茄的第2組LEA蛋白TAS14，但直到2012年其抗旱、耐鹽的功能才被驗(yàn)證。Mu?oz-Mayora等［62］使用CaMV 35S啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)tas14基因獲得的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)干旱和高鹽都具有耐受性，其可以使細(xì)胞內(nèi)積累糖類和鉀離子，并且其作用還與ABA的積累相關(guān)。

對(duì)于干旱的應(yīng)答，小立碗蘚往往比被子植物快很多，其抗逆性也常常強(qiáng)于其他被子植物，小立碗蘚的原生質(zhì)體在失水90%的條件下依舊可以存活。Wang等［63］經(jīng)過(guò)干旱處理小立碗蘚，運(yùn)用蛋白雙向電泳確定了71個(gè)干旱應(yīng)答蛋白，其中便包括了一些LEA蛋白，這就給植物抗逆改良提供了新的思路。

5 結(jié)語(yǔ)

盡管從Dure發(fā)現(xiàn)LEA蛋白至今已經(jīng)過(guò)去了30多年，大量LEA蛋白已在不同物種中被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)也已被較為完整的闡釋，但LEA蛋白作用的分子機(jī)理仍然是個(gè)未解的難題。缺少與其他已知功能蛋白的相似性，高度無(wú)定型的結(jié)構(gòu)都制約著人們對(duì)其功能的探索。LEA蛋白在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)模式都是人們所關(guān)注的。雖然大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從不同角度對(duì)特定LEA蛋白作用機(jī)理進(jìn)行了闡釋，但由于LEA蛋白家族的特殊性，這些結(jié)果并不具有普適性。不過(guò)對(duì)越來(lái)越多表達(dá)模型的提出，對(duì)模式植物中LEA蛋白突變體的研究，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用都為L(zhǎng)EA蛋白功能的研究打開(kāi)了突破口。LEA蛋白在逆境脅迫中的功能使得其在分子育種上可以發(fā)揮極大作用。通過(guò)基因工程技術(shù)將外源LEA蛋白導(dǎo)入植株表達(dá)，可以培育出抗旱、抗寒、耐鹽的作物品種，這對(duì)提高糧食產(chǎn)量具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

LEA Protein and Its Application in Improvement of Stress Tolerance in Plants

Wang Yanrong1Zhang Zhiguo2Wu Jinxia2
（1. College of Pastoral Agriculture Science and Technology， Lanzhou University，Lanzhou 730000；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Adverse conditions， including drought， salinity and extreme temperatures， often restrict the growth and development of plants. In plants， there exist a group of highly hydrophilic proteins， known as LEA（late embryogenesis abundant）proteins， which generally accumulate at the last stage of embryogenesis under natural conditions. It has a strong resistance to various abiotic stresses， and can respond to drought， cold，high salt and ABA signals. LEA proteins can maintain normal metabolic reactions of plants by maintaining cellular osmotic pressure， protecting the cell membrane structure and functioning as a molecular chaperone to protect other proteins. In this paper， the classification， structure， stress tolerance mechanisms of LEA protein and its application in improvement of stress tolerance in plant were reviewed.

LEA protein；abiotic stresses；stress tolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.001

2014-11-12

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB138700）

王艷蓉，女，碩士研究生，研究方向：草業(yè)生物技術(shù)；E-mail：wangyanrong915@163.com

吳金霞，女，副研究員，研究方向：植物基因功能組學(xué)；E-mail：wujinxia@caas.cn