測定分析兒茶酚胺類物質(zhì)方法的研究進(jìn)展

李博李川松(.四川省成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都 6004; 2.四川省人民醫(yī)院,四川成都 6003)

測定分析兒茶酚胺類物質(zhì)方法的研究進(jìn)展

李博1李川松2△
(1.四川省成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都 610041; 2.四川省人民醫(yī)院,四川成都 610031)

摘要兒茶酚胺類物質(zhì)是一種被廣泛研究的神經(jīng)介質(zhì),具體種類包括去甲腎上腺素、腎上腺素、異丙腎上腺素、多巴胺、丁羥色胺、5羥色胺及其衍生物。兒茶酚胺類物質(zhì)在體內(nèi)調(diào)節(jié)基本生理功能,傳遞生理信號,是正常生理過程中重要的信號介質(zhì),同時(shí)在病理過程中也出現(xiàn)其含量的相應(yīng)變化。兒茶酚胺類物質(zhì)在血漿及組織間液中含量非常微少,同時(shí)各類生物樣品中存在化學(xué)結(jié)構(gòu)與兒茶酚胺相似的代謝物和/或內(nèi)源性帶有相關(guān)基團(tuán)的干擾物,導(dǎo)致精確測定兒茶酚胺含量困難,而臨床實(shí)踐中選擇高選擇性、高靈敏度測定兒茶酚胺類濃度的方法,不但有著重要的臨床意義,也是當(dāng)前的研究難點(diǎn)。本文在此介紹幾種目前應(yīng)用的檢測兒茶酚胺的方法,對高效液相色譜法聯(lián)合質(zhì)譜分析做一重點(diǎn)介紹。

關(guān)鍵詞:兒茶酚胺;分析檢測;高效液相色譜法;毛細(xì)管電泳法;質(zhì)譜

Research progress in the determination of the methods of catecholamine

Li Bo1,Li Chuan-song2△
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 610031; 2.Sichuan People's Hospital,Sichuan Chengdu 610031)

兒茶酚胺類物質(zhì)具體種類包括去甲腎上腺素、腎上腺素、異丙腎上腺素、多巴胺、丁羥色胺、5羥色胺及其衍生物,兒茶酚胺類物質(zhì)在體內(nèi)調(diào)節(jié)基本生理功能,傳遞生理信號,是正常生理過程中重要的信號介質(zhì),同時(shí)在病理過程中也出現(xiàn)其含量的相應(yīng)變化。臨床上可以用于輔助診斷高血壓、甲亢、嗜鉻細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等內(nèi)分泌相關(guān)疾病。兒茶酚胺物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:帶有一個(gè)雙羥基苯核和一個(gè)帶氨基的側(cè)鏈,在生物樣品中兒茶酚胺類物質(zhì)含量極低,多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)際生物樣品中兒茶酚胺含量極微,兒茶酚胺物質(zhì)活性的穩(wěn)定性極差,極易氧化,此外加上生物樣品中同時(shí)存在的各種結(jié)構(gòu)相似和/或帶有相同化學(xué)集團(tuán)的代謝產(chǎn)物的內(nèi)源性化學(xué)干擾物,導(dǎo)致了生物樣本中兒茶酚胺濃度精確測定的困難,高選擇性且高靈敏度地測定生物樣本中某一種特定的兒茶酚胺類物質(zhì),例如精確測定血清中去甲腎上腺素和/或腎上腺素,是目前臨床尚難以達(dá)到的目標(biāo)[1]。目前國內(nèi)外關(guān)于兒茶酚胺類物質(zhì)的含量檢測分析的相關(guān)研究在不斷深入,更加關(guān)注簡單易行,經(jīng)濟(jì)適用,精確定量相關(guān)物質(zhì)并且可以廣泛適用的方法。生物樣本中中兒茶酚胺類物質(zhì)的相關(guān)檢測分析方法被廣泛報(bào)導(dǎo),這些方法以高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)為主,毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)、熒光光度(Fluorophotometric,FL)、電化學(xué)檢測(Electrochemical Detection, ECD),特別是質(zhì)譜(Mass Spectrometric,MS)用得很少[2]。本文總結(jié)了國內(nèi)外學(xué)者對兒茶酚胺類物質(zhì)精確分析檢測方法的研究進(jìn)展,希望能從中篩選測定精確,方便在臨床推廣的方法。

1 高效液相色譜法聯(lián)合檢測兒茶酚胺

高效液相色譜法是六十年代末七十年代初發(fā)展起來的一種分析分離技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了經(jīng)典液相色譜法與氣相色譜法的工作原理,由于方便快速精確的特點(diǎn),快速成長為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析檢測技術(shù)之一。高效液相色譜法在各類微量樣本物質(zhì)的檢測中被廣泛使用,同時(shí)因其高分離效率而在臨床以及實(shí)驗(yàn)室中受到重視。在臨床實(shí)踐過程中,HPLC是分析檢測血漿中或者其他生物樣本所含激素的常用方法,常用的檢測器包括紫外可見、熒光檢測器和質(zhì)譜檢測器等。HPLC同ECD和FL相結(jié)合十分普遍,最近HPLC同MS和CL的聯(lián)用也慢慢開始發(fā)展。

1.1 HPLC-ECD

陸春苓等使用萃取法提取生物樣本中的相關(guān)兒茶酚胺類物質(zhì),使用高效液相色譜聯(lián)合電化學(xué)檢測法(HPLC-ECD)進(jìn)行精確定量,測得流動相為0.1mmol·L-1Na H2PO4水溶液含0.85mmol·L-1OSA,0.5 mmol·L-1EDTANa2和11%甲醇,用濃磷酸調(diào)定p H至3.25,測定兒茶酚胺類物質(zhì)回收率、線性范圍、精密度及最低檢測限,同時(shí)精確測定并比較了大鼠和小鼠血漿中兒茶酚胺類物質(zhì)的濃度。作者認(rèn)為HPLC-ECD法用于檢測大鼠和小鼠血漿中兒茶酚胺類物質(zhì)的水平具有簡單快捷、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn),該方法適用于精確測定血漿中兒茶酚胺類物質(zhì)濃度[3]。李靜娜等建立起高效液相色譜聯(lián)合電化學(xué)法來測定人血清中的兒茶酚胺類物質(zhì),該方法運(yùn)用高效液相色譜分離出目標(biāo)物質(zhì),聯(lián)合電化學(xué)檢測器檢測兒茶酚胺,氧化鋁固相萃取法測定相關(guān)物質(zhì),測定方法最低檢出限。作者認(rèn)為高效液相色譜電化學(xué)法能精確測定人血清中的相關(guān)兒茶酚胺物質(zhì),該方法使用生物樣本較少,同時(shí)檢出靈敏度高,回收率和重現(xiàn)性良好,流程方法操作方便快捷,結(jié)果準(zhǔn)確可靠[4]。

1.2 HPLC-FL

趙燕燕等建立了一種將同步熒光法和雙波長法結(jié)合起來測定相關(guān)兒茶酚胺的方法,對腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺這3種兒茶酚胺的衍生物分別進(jìn)行同步熒光檢測掃描,檢測分析了影響熒光強(qiáng)度的因素種類,腎上腺素和去甲腎上腺素的相互干擾可通過雙波長法消除,血漿樣品可以經(jīng)酸性正丁醇和正庚烷進(jìn)行處理,作者認(rèn)為該法能進(jìn)行血漿中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定[5]。HPLC-FL也適用于對細(xì)胞外和大腦樣品中兒茶酚胺類物質(zhì)的分析。兒茶酚胺類物質(zhì)本身有自然發(fā)散熒光,樣品處理后能夠直接進(jìn)行熒光檢測。兒茶酚胺自然熒光較弱,需將樣品衍生化后再檢測以提高檢測靈敏度,采用的衍生化方法主要有兩種,分別為柱后衍生化和柱前衍生化[1]。作者認(rèn)為HPLC-FL能夠高靈敏度的檢出生物樣本中的兒茶酚胺類物質(zhì),可以適用于臨床。

1.3 HPLC-MS/MS

由于樣本血漿的基質(zhì)較為復(fù)雜,而且其中的待測物含量較低,因此用質(zhì)譜檢測器來檢測其中成分的含量是最合適的,質(zhì)譜檢測器用的紫外可見光比熒光具有更強(qiáng)的定性能力和更高的靈敏度,采用質(zhì)譜檢測可以減少基質(zhì)干擾的影響、提高方法定性和定量的準(zhǔn)確性。MS檢測可提供有用的結(jié)構(gòu)信息,比普通的紫外檢測選擇性更好。串聯(lián)質(zhì)譜法可以分為兩類:空間串聯(lián)和時(shí)間串聯(lián)。質(zhì)譜空間串聯(lián)是聯(lián)合使用兩個(gè)以上的質(zhì)量分析器,兩個(gè)分析器間建立起一個(gè)碰撞活化室,用來打碎前級質(zhì)譜儀分離選定的離子,并傳遞用于后一級質(zhì)譜儀分析。而時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀只有一個(gè)分析器,分兩個(gè)時(shí)間段來進(jìn)行的,前一時(shí)刻選定一離子,在分析器內(nèi)打碎后,后一時(shí)刻再進(jìn)行分析。HPLC分離樣品中的相關(guān)目標(biāo)物,一級MS是對HPLC譜圖中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜分析,隨后二級MS對一級MS中不確定的峰再一次進(jìn)行解離分析以確定一級MS的結(jié)構(gòu)。

李博等將HPLC-MS/MS測量血漿兒茶酚胺類物質(zhì)應(yīng)用于臨床,收集并確診的惡性口腔腫瘤患者病例40例,良性腫瘤患者病例35例,惡性腫瘤配偶18例,應(yīng)用癥狀自評量表按照評分標(biāo)準(zhǔn),測評每位受試者精神心理狀況,同時(shí)入院次日上午9點(diǎn)抽取受試者全血并分離提取血清,用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析血清中相關(guān)兒茶酚胺以及糖皮質(zhì)激素含量,結(jié)果表明HPLC-MS/MS方法能精確測量患者血漿中兒茶酚胺的含量,適用于人血漿兒茶酚胺的快速分析[6-8]。

質(zhì)譜分析先將物質(zhì)離子化,按照離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離,然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。質(zhì)譜的樣品一般先要汽化,再經(jīng)過離子化,含雜質(zhì)較多的的樣品要用色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀,是通過色譜進(jìn)樣,即色譜分離,質(zhì)譜是色譜的檢測器。分子進(jìn)入質(zhì)譜后,經(jīng)過處理成為不同質(zhì)荷比的離子,這些離子按照不同質(zhì)荷比先后進(jìn)入檢測器得到響應(yīng)信號,并在電場和磁場的綜合作用下,按照其質(zhì)量數(shù)m和電荷數(shù)Z的比值(m/z,質(zhì)荷比)大小依次排列成譜被記錄下來,以檢測到的離子信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo),離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖就是質(zhì)譜圖。基于色譜和質(zhì)譜的儀器靈敏度大致相同,加之使用分離效果較好的色譜來作為質(zhì)譜的進(jìn)樣器,而讓快速、高效率、應(yīng)用廣泛的質(zhì)譜儀作為色譜的鑒定器,使它們成為到目前為止實(shí)際效果最好的用于分析微量有機(jī)混合物的儀器。質(zhì)譜-質(zhì)譜法的迅速發(fā)展是在70年代后才開始的。它用質(zhì)譜作質(zhì)量分離的質(zhì)譜技術(shù)?？梢匝芯磕鸽x子和子離子之間的關(guān)系,讓大的離子進(jìn)一步裂解為更小的離子,以便獲得裂解過程及離子組成的信息。MS/MS型質(zhì)譜檢測器對于一般質(zhì)量只有幾百的離子,其測量誤差<0.003質(zhì)量單位。HPLC-MS/MS模式干擾也最低,一般用于定量分析。

2 毛細(xì)管電泳聯(lián)合檢測法

毛細(xì)管電泳原理簡單,方便易行,是一種高效靈敏的分離分析方法。目前,毛細(xì)管電泳技術(shù)用于兒茶酚胺類物質(zhì)的分析主要聯(lián)合采用紫外-可見光譜、MS和ECD等檢測方式。然而生物樣品成分往往復(fù)雜,包含內(nèi)源性或者外源性的干擾物,實(shí)際樣品的獲取常常需要經(jīng)過滲析、離心及固相微萃取等預(yù)處理后才能用于毛細(xì)管電泳分析。Tornkvist研究小組采用毛細(xì)管多孔石墨碳(Porous graphitized carbon)柱并以60%甲醇-40%甲酸胺緩沖液(p H=2.19)作為流動相,對腦組織中的相關(guān)兒茶酚胺類物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定,并采用質(zhì)譜檢測。由于溶液的p H對樣本分離和結(jié)果檢測有很大的影響,因此選擇合適的p H是本實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵[9]。王賢親等采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm,150 mm,5 Lm)柱子,柱溫25℃,流動相為V(乙腈)BV(0.1%甲酸溶液)= 10:90,流速0.6 m L· min-1,進(jìn)樣量20μL;電噴霧離子源(ESI),正離子檢測,采用多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring,MRM)方式對樣本進(jìn)行定量分析。腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺的最小檢測限在4.3、2.4和6.6 ng·m L-1之間,濃度在0-500 ng·m L-1范圍內(nèi)線性良好,平均回收率在85.8%-93.4%之間,表明該方法專屬性強(qiáng)、靈敏及準(zhǔn)確,適用于人血漿兒茶酚胺類物質(zhì)的快速分析[10]。

3 結(jié)語

兒茶酚胺類物質(zhì)作為類神經(jīng)遞質(zhì)與人們的健康和疾病聯(lián)系緊密,越來越多的證據(jù)顯示了其在生理過程、疾病發(fā)生以及疾病進(jìn)展扮演了不同的角色。已經(jīng)有許多臨床工作者以及科研人員重視對兒茶酚胺類物質(zhì)的研究,而現(xiàn)階段最要的研究目標(biāo)正是如何快速精確定量檢出目標(biāo)物質(zhì)。要得到準(zhǔn)確結(jié)果的前提是選擇簡單可靠的分析方法,目前在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的檢測兒茶酚胺類物質(zhì)方法各種各樣,目前學(xué)者們集中報(bào)道高效液相色譜同電化學(xué)檢測、熒光光度檢測相結(jié)合是分析兒茶酚胺類物質(zhì)的方法。目前這幾種方法各有優(yōu)劣,高效液相色譜-電化學(xué)方法的分析特點(diǎn)在于能減少但不能徹底消除藥物干擾。由于許多分析方法在靈敏度、選擇性及分析速度等方面達(dá)不到樣品分析的要求,從而不能在臨床上推廣應(yīng)用。近幾年發(fā)展起來的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)大大提高了靈敏度與特異性,能快速檢測尿樣與血樣中的兒茶酚胺類物質(zhì),其靈敏度與特異性已經(jīng)足夠用于探測大多數(shù)與兒茶酚胺類物質(zhì)相關(guān)的腫瘤。發(fā)展在線樣品預(yù)處理、高通量、高靈敏的分析方法是未來幾年該領(lǐng)域的發(fā)展方向。

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教學(xué)研究

(收稿日期：2015-8-23)

通訊作者:△李川松,男,副主任藥師,主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究,Email:409399326@qq.com。

作者簡介:李博,男,大學(xué)在讀,主要從事微量物質(zhì)的精確檢驗(yàn),Email:lb2033@126.com。