拉米夫定與原兒茶酸藥物組合體內(nèi)抗鴨乙肝病毒研究

張建武，馬恒，魏一，王玲，孟沫然，韓鳳梅，陳勇

（湖北省中藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北大學(xué)），湖北省生物資源綠色轉(zhuǎn)化協(xié)同創(chuàng)新中心（湖北大學(xué)），湖北武漢430062）

0 引言

拉米夫定（lamivudine，簡稱3TC）作為一種口服抗病毒藥物是第一個(gè)獲FDA批準(zhǔn)的，它對(duì)患者血清HBV(乙型肝炎病毒)-DNA呈現(xiàn)快速顯著的抑制作用，但是對(duì)抗原的抑制作用較低，而且停藥后癥狀易復(fù)發(fā)，長期用藥會(huì)引起DNA聚合酶區(qū)YMDD基序變異，可增大病毒對(duì)該藥的耐受性，因此限制了其臨床應(yīng)用［1-2］.原兒茶酸（protocatechuic acid，PA）具有一定的抗HBV的作用，且葉下珠、丹參、五味子等有效抗HBV的中藥提取物中均含有PA，前期有研究表明，PA體外對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制率高達(dá)46.54%，而且對(duì)HBsAg和HbeAg均具有一定的抑制作用［3-5］.

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，3TC聯(lián)合PA可抑制HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA和抗原［6］，同時(shí)對(duì)HBV X蛋白入核［7］及感染鴨乙型肝炎病毒（DHBV）吸附、進(jìn)入和感染鴨原代肝細(xì)胞［8］均有一定的協(xié)同抑制作用，同時(shí)還可降低血清AST和ALT［8］.在藥動(dòng)學(xué)方面：二者聯(lián)用后3TC和PA的吸收速度均降低，同時(shí)3TC的吸收總量增大，PA消除減慢，即可延長二者其在體內(nèi)作用的時(shí)間［9］.本實(shí)驗(yàn)主要是以櫻桃谷鴨雛鴨為研究對(duì)象，通過感染DHBV進(jìn)行造模，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期的研究，進(jìn)一步考察3TC和PA藥物組合體內(nèi)抗DHBV的作用及其保肝護(hù)肝的作用.

1 材料與方法

1.1 主要試劑 拉米夫定（純度≥98%）、原兒茶酸（純度≥98%）購于武漢施瑞科技有限公司；門冬氨酸鳥氨酸顆粒劑（簡稱門鳥）受贈(zèng)于武漢啟瑞藥業(yè)有限公司；阿昔洛韋受贈(zèng)于邦倫來福藥業(yè)；重組質(zhì)粒PCR211-DHBV115（DQ276978片段，含3 024 bp［10］）及DHBV強(qiáng)陽性血清(病毒拷貝數(shù)＞5×109/mL)受贈(zèng)于同濟(jì)醫(yī)院臨床免疫研究室(質(zhì)?？截悢?shù)為7.06×1010/mL)；PCR引物是由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；SYBR Green qPCR mix購自于TOYOBO（上海）生物科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP/AKP）測定試劑盒、白蛋白測定試劑盒（ALB）及總膽紅素（TBil）測定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所；乙肝表面抗原（HBsAg）測定試劑盒購自于上海自科華生物工程股份有限公司；病毒DNAout購自于北京天恩澤基因科技有限公司.

1.2 主要儀器 TriStar LB941多功能酶標(biāo)儀（德國Berthold公司）；MJ-Mini Option Real-Time PCR system（美國Bio-Rad公司）；超低溫冰箱（法國Jouan公司）.

1.3 動(dòng)物模型 櫻桃谷鴨，1～3日齡(簡稱雛鴨，雌雄不限），頸靜脈采血后分離血清，以滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照、DHBV強(qiáng)陽性血清作為陽性對(duì)照，采用熒光定量PCR擴(kuò)增血清中DHBV DNA特異序列，從而篩選出血清中DHBV DNA拷貝數(shù)＜104/mL的雛鴨.篩選后的雛鴨以0.2 mL/只的劑量經(jīng)腿靜脈注射DHBV強(qiáng)陽性血清（DHBV DNA拷貝數(shù)＞5×109/mL）進(jìn)行感染，7 d后，采血分離血清，用RT-PCR篩選拷貝數(shù)在108/mL左右的雛鴨，即造模成功的模型動(dòng)物.

1.4 RT-PCR標(biāo)曲的制備［11］首先，找出重組質(zhì)粒PCR211-DHBV115 DNA的保守序列（primer-BLAST軟件），根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)出熒光定量PCR檢測DHBV引物序列（primer3.0軟件）：Ps1 5′-GCCTTAGCCAATGTGTATGATC-3′，Ps2 5′-CGTGCTGAATAAGATAACCTGTG-3′；然后配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)粒拷貝數(shù)依次為103、104、105依次至1010/mL)，再加入DHBV引物，最后進(jìn)行RT-PCR.PCR擴(kuò)增條件為：首先94℃預(yù)熱5 min，再按照94℃50 s，51℃45 s，72℃20 s的條件進(jìn)行40次PCR擴(kuò)增循環(huán).以縱坐標(biāo)為質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)數(shù)（log拷貝數(shù)），橫坐標(biāo)為樣品到達(dá)對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)(Ct值)，分別建立給藥周期的RT-PCR標(biāo)曲：log拷貝數(shù)=－0.285 7Ct+13.650，r=0.997 8和不同給藥劑量的RT-PCR標(biāo)曲：log拷貝數(shù)=－0.375 7 Ct+13.076，r=0.997 3.

1.5 血清中DHBV DNA定量分析［12］用乙醚將雛鴨麻醉之后，經(jīng)腿經(jīng)脈采血0.5 mL，12 000 r/min離心10 min，分離血清，再用一管式病毒DNAout試劑盒提取血清中的病毒DNA進(jìn)行RT-PCR.根據(jù)前期已建立的RT-PCR標(biāo)曲，可測定待測樣品中的DHBV DNA拷貝數(shù).

1.6 體內(nèi)量-效實(shí)驗(yàn)方法［13］實(shí)驗(yàn)分組：感染DHBV模型雛鴨對(duì)照組（灌胃等量0.85%氯化鈉），阿昔洛韋100.0 mg/kg組，門冬氨酸鳥氨酸（簡稱門鳥）5.0 g/kg組，以及3TC/PA(1∶1)分別為12.5、25.0、50.0、100.0、150.0 mg/kg的合用組，將感染后的雛鴨進(jìn)行隨機(jī)分組、每組10只.各組一日灌胃一次，連續(xù)灌胃給藥14 d.分別在給藥之前（T0）、給藥后第7天（T7）、給藥后第14天（T14）以及停藥后的第3天（P3），每只雛鴨經(jīng)腿經(jīng)脈采血0.5 mL，然后分離血清進(jìn)行肝功能相關(guān)的生化指標(biāo)和DHBV DNA拷貝數(shù)的檢測.

1.7 體內(nèi)時(shí)-效實(shí)驗(yàn)方法［14］實(shí)驗(yàn)分為感染DHBV模型雛鴨對(duì)照組，正常雛鴨對(duì)照組，阿昔洛韋100.0 mg/kg組，門鳥5.0 g/kg組，以及3TC/PA(1∶1)50.0 mg/kg合用組，隨機(jī)分組、每組10只.每日灌胃給藥一次，連續(xù)給藥28 d.對(duì)照組灌胃等量0.85%氯化鈉.分別于給藥前（T0）、給藥7 d（T7）、給藥14 d（T14）、給藥21 d（T21）、給藥28 d（T28）和停藥5 d（P5），經(jīng)腿靜脈采血，每只0.8 mL，然后分離血清進(jìn)行DHBV DNA拷貝數(shù)和ALT、AST以及DHBsAg檢測.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果

2.1 不同的給藥劑量對(duì)病毒抑制作用及肝功能的影響 研究不同的給藥劑量情況下，血清中DHBV DNA含量的變化，結(jié)果見表1.

表1 每組用藥前后血清中DHBV DNA的含量（Xˉ±s）

模型對(duì)照組和門鳥5.0 g/kg組在用藥T0～T14及P3時(shí)，血清DHBV DNA含量沒有出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05）.阿昔洛韋100.0 mg/kg組給藥T7、T14時(shí)血清DHBV DNA含量顯著下降（P＜0.05），P3后DHBV DNA含量與用藥T14相比顯著升高（P＜0.05），出現(xiàn)明顯“反跳”.3TC/PA的各個(gè)劑量組于用藥第T7、T14時(shí)對(duì)血清DHBV DNA含量均有顯著的抑制作用，并且抑制作用隨著給藥劑量的加大而增強(qiáng)；P3時(shí)對(duì)DHBV DNA的抑制率分別為15.8%、17.0%、21.7%、20.7%、21.5%，其中25.0、50.0、100.0 mg/kg組P3時(shí)DHBV DNA含量無明顯反跳，12.5、150.0 mg/kg組有較明顯反跳.另外，3TC/PA50.0 mg/kg給藥T14及P3時(shí)血清DHBV DNA含量均顯著低于阿昔洛韋100.0 mg/kg組（P＜0.05或P＜0.01）.

研究了給藥劑量對(duì)雛鴨肝功能的影響，各組用藥前后血清中各項(xiàng)肝功能生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2.

表2 各組用藥前后血清中肝功能生化指標(biāo)（Xˉ±s）

結(jié)果顯示，在T14后，門鳥5.0 g/kg、3TC/PA(1:1)50.0及100.0 mg/kg組血清中的ALT、AST、ALB及TBil與同組給藥前水平相比，均顯著低于給藥前水平（P＜0.05），3TC/PA 25.0 mg/kg組ALB、Tbil亦顯著低于同組給藥前水平（P＜0.05）；各組AKP活性較用藥前均大幅下降，即使模型對(duì)照組也不例外（原因尚不明確）；阿昔洛韋100.0 mg/kg組給藥前后各項(xiàng)指標(biāo)（除AKP外）無顯著變化（P＞0.05）.另外，T14時(shí)50.0 mg/ kg 3TC/PA組AST、ALT和Tbil值亦顯著低于5.0 g/kg門鳥組（P＜0.01或P＜0.05）.

2.2 給藥周期對(duì)病毒抑制作用及肝功能的影響 研究給藥期間對(duì)血清DHBV DNA、DHBsAg含量的影響，其結(jié)果分別見于表3和表4.結(jié)果顯示，100.0 mg/kg劑量組的阿昔洛韋給藥T7～T28及和P5后的血清DHBV DNA含量與同組用藥前相比較具有顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后DHBV DNA含量與同組給藥T28時(shí)的水平相比，出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，顯著高于給藥前水平（P＜0.05）.50.0 mg/kg劑量組的3TC/PA在給藥T28內(nèi)，血清中DHBV DNA的水平均顯著低于同組給藥前水平（P＜0.01），雖然在P5后DHBV DNA含量出現(xiàn)一定的反跳現(xiàn)象，但與T28時(shí)的DHBV DNA水平相比并沒有顯著差異（P＞0.05）.而且50.0 mg/kg劑量組的3TC/PA在給藥T21、T28以及P5的血清DHBV DNA水平均顯著低于100.0 mg/kg劑量的阿昔洛韋組（P＜0.05或P＜0.01）.

表3 各組給藥前后血清中DHBV DNA的含量（Xˉ±s）

表4 各組給藥前后血清中DHBsAg水平（Xˉ±s）

結(jié)果顯示，100.0 mg/kg劑量組的阿昔洛韋給藥T7～T28以及P5后血清DHBsAg含量與同組用藥前相比較具有顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后DHBsAg含量與同組T28時(shí)的水平相比出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，顯著高于T28時(shí)水平（P＜0.05）.50.0 mg/kg劑量的3TC/PA組給藥T7～T28以及P5后血清DHBsAg含量與同組用藥前相比較具有顯著性降低（P＜0.01），且P5后與同組T28時(shí)水平無顯著差異，并無明顯的反跳.另外，50.0 mg/kg劑量的3TC/PA組在給藥的T21、T28及P5的血清DHBsAg水平均顯著低于100.0 mg/kg劑量的阿昔洛韋組（P＜0.05或P＜0.01）.

研究給藥周期對(duì)雛鴨肝功能的影響，各組給藥前后血清AST、ALT測定結(jié)果見表5和表6.

表5 各組用藥前后血清中ALT(U/L)水平（Xˉ±s）

結(jié)果顯示，100.0 mg/kg劑量組的阿昔洛韋對(duì)血清中的ALT含量沒有明顯的影響（P＞0.05）.5.0 g/kg劑量組的門鳥在給藥的T14、T21及T28血清中的ALT值同給藥前水平比較均顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后ALT值同組T28時(shí)水平相比較，具有明顯反跳.50.0 mg/kg劑量組的3TC/PA在給藥T7～T28期間的ALT值同給藥前水平相比較，均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），并且P5后血清ALT值無明顯反跳.另外，P5后50.0 mg/kg劑量3TC/PA組的血清ALT水平亦顯著低于5.0 g/kg劑量門鳥組（P＜0.05）.

表6 各組用藥前后血清中AST(U/L)水平（Xˉ±s）

結(jié)果顯示，100.0 mg/kg劑量的阿昔洛韋在給藥期間對(duì)血清AST值水平?jīng)]有顯著性影響（P＞0.05）.5.0 g/kg劑量的門鳥在給藥T14、T21和T28時(shí)AST值與給藥前水平相比較，均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），同時(shí)在P5時(shí)AST水平值與T28時(shí)水平相比并無顯著差異.50.0 mg/kg劑量的3TC/PA在給藥T7、T14、T21和T28時(shí)AST水平值與同組給藥前水平相比較均有顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），在P5后AST值水平具有一定程度的反跳.另外，在給藥的T14、T28及P5時(shí)，50.0 mg/kg劑量的3TC/PA組血清AST值均顯著低于5.0 g/ kg劑量的門鳥組（P＜0.01）.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作表明，3TC與PA的聯(lián)合給藥，當(dāng)二者的劑量比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為1∶1時(shí)，對(duì)DHBV DNA的抑制作用最好，同時(shí)具有較好的保肝護(hù)肝作用［12］.本實(shí)驗(yàn)選用門鳥［15］為保肝護(hù)肝的陽性對(duì)照藥，阿昔洛韋為抗DHBV的陽性對(duì)照藥［13］、結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期的研究，進(jìn)一步考察3TC和PA藥物組合體內(nèi)抗DHBV及其保肝護(hù)肝的作用.

量-效關(guān)系研究表明，3TC/PA對(duì)血清中DHBV DNA的抑制作用隨著給藥劑量（12.5～150 mg/kg）的加大而增強(qiáng)，其中100.0 mg/kg和150.0 mg/kg劑量組在P5后DHBV DNA量出現(xiàn)明顯的反跳現(xiàn)象.50.0 mg/ kg劑量組在給藥的T7～T14期間及P5時(shí)DHBV DNA的含量顯著低于對(duì)照組阿昔洛韋，ALT、AST及Tbil值水平均顯著低于門鳥對(duì)照組，該結(jié)果說明3TC/PA體內(nèi)抗DHBV的最佳給藥劑量為50.0 mg/kg.時(shí)-效關(guān)系研究表明，在給藥的T0～T28期間，3TC/PA在50.0 mg/kg時(shí)，對(duì)血清中DHBV DNA、DHBsAg、AST和ALT的抑制作用隨著給藥周期的延長而增強(qiáng)，并且在給藥周期中以及P5后血清中DHBV DNA和DHBsAg的水平均顯著低于阿昔洛韋對(duì)照組，同時(shí)血清AST和ALT的水平也顯著低于門鳥對(duì)照組.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明，3TC/PA體內(nèi)抗DHBV的最佳給藥劑量為50.0 mg/kg，一方面其抗病毒效果優(yōu)于阿昔洛韋，另一方面保肝護(hù)肝效果優(yōu)于門鳥.結(jié)合早期大量的研究工作，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了3TC聯(lián)合PA用于抗HBV的科學(xué)性與合理性.

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