CdTe QDs/G14-3-14的制備及其在蛋白質(zhì)熒光探針中的應(yīng)用

鄧淳，鐘亞平，何瑜，葛伊利，宋功武

（有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北大學(xué)），有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（湖北大學(xué)），湖北 武漢 430062）

0 引言

蛋白質(zhì)的檢測(cè)在生物化學(xué)和免疫診斷等許多研究中都有著重要作用［1-2］，因而高靈敏性和高選擇性檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法需要迫切.最常用測(cè)定蛋白質(zhì)的方法有，凱氏定氮法、縮二脲的方法（Biuret），紫外吸收和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）等.和上述傳統(tǒng)方法相比，熒光光度法由于操作簡(jiǎn)單，靈敏度高而有著很好的發(fā)展前景.納米材料由于其顯著的尺寸效應(yīng)，因而有著和其相對(duì)應(yīng)的單個(gè)分子或體相材料明顯不同的理化性質(zhì)，這使他們被廣泛應(yīng)用于納米生物學(xué)研究［3-4］，并且在各學(xué)科中表現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值［5-7］. CdTe納米粒子是最常見(jiàn)的II-VI型的半導(dǎo)體材料，由于其在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)因而被廣泛研究［8］.Gemini表面活性劑［9-11］是一個(gè)相對(duì)較新型的表面活性劑，由于具有較低的臨界膠束濃度（CMCC）和較高的降低油/水界面張力等特點(diǎn)而優(yōu)于同類(lèi)傳統(tǒng)表面活性劑，被廣泛應(yīng)用［12-14］.由于量子點(diǎn)表面帶有帶負(fù)電的-COO-基團(tuán)，可以和帶正電的表面活性劑結(jié)合，從而發(fā)生相互作用.CdTe QDs/G14-3-14納米材料作為有著高熒光效率和優(yōu)良理化性質(zhì)的熒光探針，成為檢測(cè)蛋白質(zhì)的新方法.

本實(shí)驗(yàn)將CdSe QDs用Gemini表面活性劑G14-3-14修飾，形成CdTe QDs/G14-3-14納米材料.水相合成的納米顆粒不僅解決了半導(dǎo)體納米材料的水溶性問(wèn)題，而且由于納米粒子的表面包覆了一層巰基丙酸（HSCH2CH2COOH），借助于其外端的羧基可以和生物分子的胺基結(jié)合，形成酰胺鍵，從而達(dá)到標(biāo)記生物分子的目的，因此可以高效地檢測(cè)蛋白質(zhì).血清白蛋白是循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的蛋白質(zhì)，它具有多種生理和藥理作用.牛血清白蛋白含有大量的氨基酸殘基，并且結(jié)構(gòu)與人血清白蛋白有著同源性，是研究最廣泛的蛋白質(zhì)之一，因此在這里我們以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)這一類(lèi)生物分子的代表，表明我們的納米材料能用于檢測(cè)蛋白質(zhì).由于表面活性劑G14-3-14能與BSA發(fā)生疏水作用而結(jié)合，因而表面活性劑可以起到橋梁作用，使三者都產(chǎn)生相互作用，從而導(dǎo)致熒光的猝滅［15］，高效地檢測(cè)蛋白質(zhì).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 LS55型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin-Elmer公司），TecnaiG20型透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司），Spectrum one型傅里葉變換紅外分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin-Elmer公司），Lambda 35型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin-Elmer公司），D/MAX－IIIC型X線(xiàn)衍射儀（日本理學(xué)）.Gemini表面活性劑G14-3-14；牛血清白蛋白（BSA華美生物工程公司），原溶液濃度為5.0×10-6mol L-1；水溶性量子點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)室制備.試劑均為分析純，水為二次水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CdTe QDs的合成 合成方法采用改進(jìn)后的方法［16-17］.

1）將50.8 mg（0.4 mmol）銻粉和37.8 mg（1 mmol）NaBH4加入三頸燒瓶?jī)?nèi)，通入N2，注入10.0 mL超純水，在氮?dú)猸h(huán)境中室溫下混合，直到得到透明的NaHTe溶液.

2）將0.8 mmol CdCl2溶液和1.02 mmol MPA溶液加入160 mL超純水中混合均勻，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)pH到11.9后將溶液轉(zhuǎn)移到三頸燒瓶中，通入N2，得到Cd-MPA前驅(qū)體.

3）將所配制的Cd-MPA前驅(qū)體置于三頸瓶中，通入N2，注入新制的NaHSe溶液（0.08 mmol），在一個(gè)大氣壓下加熱混合物到沸騰（100℃）并且冷凝回流，制備CdTe QDs溶液.將制備好的CdTe QDs用無(wú)水乙醇離心洗滌3次，干燥后備用.

1.2.2 納米材料CdTe QDs/G14-3-14的合成 將CdTe QDs溶解后與一定量的Gemini表面活性劑G14-3-14混合攪拌，即得CdTe QDs/G14-3-14納米材料.

1.2.3 納米材料CdTe QDs/G14-3-14對(duì)BSA的檢測(cè) 配置一系列不同比例的CdTe QDs和G14-3-14的混合溶液，加入適量的牛血清白蛋白溶液，固定激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，檢測(cè)3次其發(fā)射光譜，以此得到的平均光譜的95%～105%為參照.配制比例不同的樣品試樣，檢測(cè)其發(fā)射光譜，直至其發(fā)射光譜在上述參照范圍內(nèi)，記下該樣品濃度，計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe QDs的TEM圖，XRD圖和FT-拉曼光譜 我們通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）和X線(xiàn)粉末衍射（XRD）對(duì)產(chǎn)品的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.從TEM圖可以看出CdTe QDs是球形晶體，并且尺寸均一，分散性好.X線(xiàn)衍射圖譜中的（111），（220）和（311）顯示CdTe QDs是典型的面心立方結(jié)構(gòu).由于MPA的巰基與Cd2+的共價(jià)結(jié)合，MPA分子中S—H振動(dòng)峰（2 554 cm-1）消失了，而—CH2—特征峰（2 948 cm-1）仍然存在，確認(rèn)了MPA和碲化鎘核心之間的相互作用.

圖1 CdTe QDs的TEM圖

圖2 CdTe QDs的XRD圖

圖3 MPA和MPA-CdTe的拉曼光譜

2.2 CdTe QDs的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜 室溫下加入NaHTe溶液后混合物變成金黃色，這表明晶核已經(jīng)形成.從圖4可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，CdTe QDs的尺寸和相應(yīng)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)可以由加熱時(shí)間控制.隨著納米顆粒的長(zhǎng)大，熒光發(fā)射波長(zhǎng)和紫外吸收波長(zhǎng)均紅移.分別加熱1、5、10、20、30、45、60、90 min后，熒光發(fā)射峰分別在533、543、552、572、582、593、599、608 nm.CdTe QDs熒光發(fā)射峰位置從可見(jiàn)光區(qū)逐漸向近紅外移動(dòng)，所有樣品在可見(jiàn)光區(qū)展示出尖銳的吸收峰并且隨著顆粒尺寸的增大而變得平緩，這是由于量子禁斷作用減弱的結(jié)果［16］.

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間合成的CdTe QDs(Cd、MPA、Te的摩爾比為1∶1.7∶0.05,pH=11.9)的熒光發(fā)射圖譜(λex=350 nm)（a），紫外吸收?qǐng)D譜(b)，在自然光照下(c)和紫外等光照下的顏色變化圖(d)

2.3 納米材料CdTe QDs/G14-3-14形成的機(jī)理與光譜表征 CdTe QDs的外面包覆了一層巰基丙酸（HSCH2CH2COOH），由于外端的羧基電離而使CdTe QDs帶負(fù)電荷，所以CdTe QDs與G14-3-14分子之間存在著很強(qiáng)的靜電吸引力（圖5）.由圖6可知，隨著體系中G14-3-14的增加，納米材料CdTe QDs/G14-3-14的熒光強(qiáng)度明顯降低，并伴隨一定程度的紅移，這表明二者產(chǎn)生了相互作用.當(dāng)CdTe QDs和G14-3-14的摩爾比不斷增大時(shí)，納米材料的熒光強(qiáng)度是不斷降低的，但是在1∶10到1∶100時(shí)，出現(xiàn)了一個(gè)平臺(tái)，由此平臺(tái)所示比例區(qū)間量子點(diǎn)對(duì)表面活性劑的摩爾比與納米熒光材料的影響不大.所以，我們選擇CdTe QDs和G14-3-14的摩爾比為1∶50為最佳比例，后面的實(shí)驗(yàn)均選用此比例的納米熒光材料進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè).

圖6 CdTe QDs與G14-3-14反應(yīng)的熒光圖譜（a）CdTe QDs/G14-3-14體系的熒光發(fā)射圖譜；（b）CdTe QDs與G14-3-14的比例對(duì)熒光強(qiáng)度的影響CCdTeQDs=1.2×10-8mol·L?1；λex=350 nm.CG14-3-14=1.0×10-4mol·L?1

2.4 納米材料CdTe QDs/G14-3-14與BSA的相互作用 從圖7可以看出，隨著B(niǎo)SA濃度的增加，體系熒光猝滅并伴隨紅移，說(shuō)明BSA與納米材料發(fā)生了相互作用，并且猝滅十分明顯，而且在實(shí)驗(yàn)所固定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)BSA與CdTe QDs之間也沒(méi)有相互作用，證明只有修飾過(guò)的CdTe QDs才能和BSA作用，因此用這種納米材料可以很好地進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè).

圖7 （a）CdTe QDs-G14-3-14體系（CCdTeQDs=1.2×10-8mol·L?1；CG14-3-14=6.0×10-7mol·L?1；CBSA=4×10-8mol·L?1，a～f:0.0；0.2；0.4；0.6；1.0；1.2 mL）和（b）CdTe QDs與不同濃度的BSA相互作用的熒光圖

由圖8可以得知，無(wú)論是熒光材料本身（圖8a），還是熒光材料對(duì)BSA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)（圖8b），時(shí)間對(duì)二者都沒(méi)有影響.因此，我們可以認(rèn)為，CdTe QDs/G14-3-14這種納米熒光材料有著很好的抗光漂白性.

圖8 (a)CdTe QDs/G14-3-14和(b)CdTe QDs/G14-3-14-BSA體系的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖

由圖9與表1可知，CdTe QDs/G14-3-14的摩爾比不同（1∶10～1∶100），BSA對(duì)它的熒光猝滅效果略有不同，圖中所得的KSV值也比較接近，說(shuō)明在該平臺(tái)上選取任一比例合成的材料都可以很好地檢測(cè)蛋白質(zhì)，不因摩爾比不同而效果不同.由圖10可以看出，G14-3-14沒(méi)有紫外吸收，BSA的吸收峰在280 nm左右.CdTe QDs用表面活性劑修飾后紫外吸收峰強(qiáng)度增加，這可能是由于少數(shù)表面活性劑沒(méi)有包裹量子點(diǎn)，而是形成了一些大的囊泡，從而引起光的散射所導(dǎo)致［18-19］.加入BSA后CdTe QDs/G14-3-14的紫外吸收降低了，這表明蛋白質(zhì)與納米材料發(fā)生了相互作用.

圖9 不同的CdTe QDs與G14-3-14比例合成的CdTe QDs/G14-3-14與蛋白質(zhì)相互作用的Stern-Volmer圖

圖10 不同體系的紫外吸收?qǐng)D譜（a～e:G14-3-14,BSA, CdTe QDs,CdTe QDs/G14-3-14-BSA，CdTe QDs/G14-3-14）

2.5 共存物質(zhì)的干擾 在最佳檢測(cè)條件下，對(duì)典型的共存物質(zhì)進(jìn)行了干擾測(cè)定.從表2可以看出，金屬陽(yáng)離子和生物分子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響均在允許的干擾范圍之內(nèi)，說(shuō)明納米粒子選擇性好，抗干擾能力強(qiáng).

2.6 工作曲線(xiàn) 在最優(yōu)條件下，由ΔF對(duì)BSA的濃度作圖，得到了工作曲線(xiàn)（RQDs/G14-3-14=1∶50）.線(xiàn)性方程為ΔF=0.77+0.75C（μg·L-1），相關(guān)系數(shù)為R2= 0.99.如圖11所示，BSA濃度的線(xiàn)性范圍為0～42.24 μg·L-1.檢出限LOD=0.18 μg·L-1.

圖11 CdTe QDs/G14-3-14對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)的工作曲線(xiàn)BSA的濃度范圍為0～42.24 μg·L-1

表1 CdTe QDs/G14-3-14（不同RQDs/G14-3-14）與BSA相互作用的猝滅常數(shù)

表2 不同的離子以及生物分子對(duì)體系的干擾（BSA:2.6 μg·L-1）

2.7 對(duì)實(shí)際樣品中BSA含量的測(cè)定 為了研究這種熒光納米材料的實(shí)用性，我們對(duì)新鮮尿液中BSA的含量進(jìn)行了檢測(cè).表3顯示了3組平行尿液稀釋200倍的實(shí)際樣品的檢測(cè)分析結(jié)果.由此可以知，3組樣品都達(dá)到了期望值，并且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，這證明實(shí)驗(yàn)有很好的精密度；同時(shí)回收率在108%～110%之間，說(shuō)明適合微量分析.這說(shuō)明此種材料在蛋白質(zhì)檢測(cè)中具有較好的實(shí)用價(jià)值.

表3 實(shí)際樣品測(cè)量結(jié)果

3 結(jié)論

本文中成功合成了CdTe QDs/G14-3-14納米材料，這種納米材料選擇性好，可以作為蛋白質(zhì)熒光探針.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，此種材料在蛋白質(zhì)檢測(cè)中具有較好的實(shí)用價(jià)值.本論文為Gemini表面活性劑修飾量子點(diǎn)作為熒光探針研究生物分子提供了參考.

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