芹菜素對肺癌細(xì)胞氨肽酶N抑制作用機(jī)制的研究

周云峰,羅 飛,付歡歡,肖江衛(wèi),廖 娟

腫瘤基礎(chǔ)與臨床

·論著·

芹菜素對肺癌細(xì)胞氨肽酶N抑制作用機(jī)制的研究

周云峰,羅 飛,付歡歡,肖江衛(wèi),廖 娟

目的 探討芹菜素對肺癌細(xì)胞氨肽酶N活性的影響及其對肺癌細(xì)胞A549生長抑制作用的機(jī)制。方法 采用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法，觀察芹菜素對氨肽酶N的抑制作用和延滯時(shí)間；進(jìn)行肺癌細(xì)胞A549和肺正常細(xì)胞MRC-5生長的抑制試驗(yàn)；通過鋅離子螯合實(shí)驗(yàn)和分子對接研究芹菜素與氨肽酶N的相互作用機(jī)制。結(jié)果 芹菜素能夠?qū)Ψ伟┘?xì)胞A549的生長產(chǎn)生抑制作用，對正常細(xì)胞MRC-5具有較低的毒性，且是一種可逆的競爭型氨肽酶N抑制劑[半數(shù)抑制濃度(IC50)為(71.22±2.43)μmol/L]；鋅離子螯合實(shí)驗(yàn)和分子模擬結(jié)果表明，芹菜素能夠優(yōu)先結(jié)合到氨肽酶N的活性中心鋅離子附近，并與催化基團(tuán)His383和Glu350形成氫鍵。結(jié)論 芹菜素是一種競爭性的氨肽酶N抑制劑，能夠特異性地對肺癌細(xì)胞A549的生長起到抑制作用。

芹菜素；肺癌細(xì)胞A549；氨肽酶N；抑制作用；分子模擬

腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，包括腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤細(xì)胞穿過基底膜進(jìn)入血管系統(tǒng)、隨循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散、在繼發(fā)組織器官定位生長、轉(zhuǎn)移癌繼續(xù)擴(kuò)散等過程[1]。氨肽酶N在機(jī)體組織細(xì)胞之間的生理調(diào)節(jié)和信號(hào)傳遞過程中起著至關(guān)重要的作用，其功能和作用因其存在的位置不同而有差異，尤其氨肽酶N在肺癌細(xì)胞演進(jìn)過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都起到了作用[2-5]，為肺癌細(xì)胞的生長提供了便利條件，這意味著氨肽酶N抑制劑可以有效地抑制肺癌細(xì)胞的生長，進(jìn)而預(yù)防腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和傳播。芹菜素是一種低毒、非誘變性的黃酮類物質(zhì)[6]，存在于許多蔬菜和水果中[7]。研究報(bào)道，芹菜素具有預(yù)防腫瘤的作用，在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中，其可以促進(jìn)金屬螯合，清除自由基以及激活Ⅱ相解毒酶[8],可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9]，尤其是可顯著抑制前列腺癌CA-HPV-10細(xì)胞和人類鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的生長，而對人類正常前列腺上皮細(xì)胞和人類正常表皮角質(zhì)化細(xì)胞抑制作用很弱，表現(xiàn)出特異性抗腫瘤作用。芹菜素已被發(fā)現(xiàn)可以抑制非小細(xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞的增殖以及在裸鼠中抑制其腫瘤生長和血管生成。為了探明芹菜素的抗癌作用是否與其對氨肽酶N的抑制作用有關(guān)，本研究將對芹菜素對氨肽酶N的抑制作用機(jī)制進(jìn)行研究，并分析芹菜素螯合金屬鋅離子的作用，利用分子對接技術(shù)探討芹菜素與氨肽酶N的相互作用機(jī)制，最后對芹菜素特異性抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長的作用進(jìn)行探討，為芹菜素在功能性醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；酶標(biāo)儀SpectraMax Plus384(美谷分子公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；AUTODOCK4.2分子對接軟件。四甲基偶氮唑鹽( MTT，5×103mg/L，PBS配制)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。生物安全柜型號(hào): HR40-ⅡA2 Haier；芹菜素(色譜純，阿拉丁試劑，高效液相色譜圖見圖1)、氨肽酶N(Sigma公司) (分析純，阿拉丁試劑)；L-亮氨酞-P-硝基苯胺(分析純，Sigma公司)；貝他定(分析純，Sigma公司)。人正常肺細(xì)胞MRC-5和人肺癌細(xì)胞A549(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，所有溶液均用去離子水配制。

圖1 芹菜素高效液相色譜圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芹菜素對氨肽酶N的抑制作用：芹菜素和氨肽酶N在37℃下、pH 6.8的磷酸鹽(50 mmol/L)緩沖體系中下孵化3 h后，加入L-亮氨酞-P-硝基苯胺，利用UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件測定405 nm處吸光度(OD)值的變化[10]，計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率(%)=(1-R/R0)×100%，其中R0為無抑制劑時(shí)的OD值變化的斜率，R為在含有不同濃度芹菜素的體系中的OD變化的斜率，以貝他定為陽性對照。

1.2.2 鋅離子螯合率的測定：取不同濃度的芹菜素溶液，向其中加入一定量的硫酸鋅溶液，充分振搖使其反應(yīng)完全，在離心機(jī)上以4000 r/min速度離心20 min后，將上清液倒入一錐形瓶中，用EDTA標(biāo)定上清液中剩余的鋅離子，從而得出鋅離子螯合率。標(biāo)定方法參考文獻(xiàn)[11]。鋅離子螯合率(%)=(反應(yīng)體系中鋅離子總量-EDTA標(biāo)定出的鋅離子總量反應(yīng)體系中鋅離子總量)/反應(yīng)體系中鋅離子的總量×100%。

1.2.3 芹菜素對MRC-5和A549細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)：將對數(shù)生長期的MRC-5和A549細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化單細(xì)胞，重懸于新鮮生長培養(yǎng)液中；細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板；置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，處理96孔板中的細(xì)胞，繼續(xù)置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不同濃度的芹菜素和貝他定處理24 h后，直接于每孔中加入溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溶液[12]，37℃孵育2～4 h；室溫靜置至沉淀完全溶解(約10 min)，用酶標(biāo)儀(檢測波長570 nm)檢測各孔OD值。取復(fù)孔平均值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率及IC50。抑制率(%)=空白OD值-抑制劑OD值/空白OD值×100%。

1.2.4 分子對接：利用AUTODOCK 4.2分子模擬軟件對芹菜素和氨肽酶N進(jìn)行分子對接；氨肽酶N(PDB:4FKE)從RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)獲取，芹菜素三維分子晶體由Sybyl×1.1(Tripos Inc., St. Louis, USA)軟件畫出[13-14]。分子對接前對配體芹菜素素和受體氨肽酶N進(jìn)行結(jié)構(gòu)和能量優(yōu)化(去水，加氫和加電)，設(shè)定autogrid box參數(shù)78 ?×78 ?×78 ?，grid spacing 設(shè)置為0.78 ?；選擇autodock 計(jì)算方法為LGA，其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，對接100次，輸出結(jié)果應(yīng)用PyMoL軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 對氨肽酶N活性的抑制作用 隨著芹菜素和貝他定濃度的增加，氨肽酶N的活性呈現(xiàn)不斷降低的趨勢，直到貝他定的濃度達(dá)到150 μmol/L、芹菜素的濃度達(dá)到200 μmol/L后，氨肽酶N的相對活性趨于平緩，解析芹菜素和貝他定的IC50分別為(71.22±2.43)μmol/L和(52.32±2.31)μmol/L(圖2)；結(jié)合圖3可以看出，隨著芹菜素濃度的增加，氨肽酶N活性的遲滯時(shí)間穩(wěn)步上升，當(dāng)其濃度達(dá)到50 μmol/L，延滯時(shí)間趨于穩(wěn)定，而貝他定對氨肽酶N活性的延滯時(shí)間低于芹菜素。

圖2 芹菜素對氨肽酶N的抑制作用

圖3 芹菜素對氨肽酶N延滯時(shí)間的作用

2.2 對鋅離子的螯合能力 芹菜素對鋅離子的螯合能力遠(yuǎn)強(qiáng)于陽性對照貝他定，當(dāng)濃度大于50 μmol/L時(shí)，芹菜素的鋅離子螯合率趨于穩(wěn)定(圖4)，與其對氨肽酶N延滯時(shí)間的作用相似。

圖4 芹菜素對鋅離子螯合能力測定

2.3 與氨肽酶N的分子對接 從100次運(yùn)行結(jié)果中選取了對接區(qū)域最多的和能量最低的位點(diǎn)作為研究對象，如圖5所示，芹菜素結(jié)合到了氨肽酶N鋅離子活性中心附近，嵌插到了催化中心的氨基酸殘基(Ala3 48, Glu350, His383, Glu384和Tyr472)[12]周圍，并與His383和Glu350形成氫鍵。

圖5 芹菜素與氨肽酶N的分子對接

2.4 對MRC-5和A549細(xì)胞生長的抑制作用 隨著濃度的增加，芹菜素和貝他定都表現(xiàn)了良好的抑制肺癌A549細(xì)胞生長的能力，計(jì)算芹菜素和貝他定對A549細(xì)胞生長IC50為(65.43±2.32)μmol/L和(53.32±3.43)μmol/L；芹菜素對正常肺MRC-5細(xì)胞生長的抑制能力低于貝他定。見圖6、7。

圖6 芹菜素對人肺癌A549細(xì)胞生長的作用

圖7 芹菜素對人正常肺MRC-5細(xì)胞生長的作用

3 討論

氨肽酶N是貝他定主要的作用靶點(diǎn)，貝他定可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，本研究以人肺癌細(xì)胞A549為靶細(xì)胞，研究芹菜素對人肺癌細(xì)胞A549生長的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芹菜素能夠?qū)Π彪拿窷產(chǎn)生抑制作用，與陽性對照貝他定相比差別不大，且A549細(xì)胞生長的抑制活性與體外抑酶實(shí)驗(yàn)的趨勢相一致，芹菜素對氨肽酶N和A549細(xì)胞生長的抑制作用都存在濃度依賴性，但兩種抑制劑對正常肺MRC-5細(xì)胞的抑制作用相比存在差異，為進(jìn)一步探討這種差異是否與對氨肽酶N的抑制機(jī)制有關(guān)，引用了分子對接技術(shù)和鋅離子螯合實(shí)驗(yàn)。

近年來分子模擬技術(shù)發(fā)展迅速并在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域得到了廣泛的的應(yīng)用，在藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域根據(jù)形狀、空間和性質(zhì)互補(bǔ)理論，用于病毒、藥物作用機(jī)制的研究。通過分子對接能形象地表現(xiàn)出抑制劑與酶蛋白的作用位置和作用力類型，還能得到結(jié)合能等其他信息。本文采用模擬退火和遺傳算法來尋找受體和配體的最佳結(jié)合位置，用半經(jīng)驗(yàn)自由能計(jì)算方法來評價(jià)受體和配體之間的匹配情況；鋅離子螯合實(shí)驗(yàn)表明，芹菜素能夠結(jié)合到氨肽酶N的活性中心鋅離子周圍，與底物競爭氨肽酶N的活性區(qū)域和改變酶的結(jié)構(gòu)，并與活性中心殘基形成氫鍵，屬于典型的競爭型酶抑制劑[15]。

酶抑制劑是一類可以與酶結(jié)合并降低酶活性的分子、作用于或影響酶的活性中心或必需基團(tuán)導(dǎo)致酶活性下降或喪失而降低酶促反應(yīng)速率的物質(zhì)，抑制劑對酶的抑制類型分為不可逆性抑制和可逆性抑制，而可逆性抑制主要有競爭性和非競爭性兩種，競爭性抑制是抑制劑與底物競爭酶的活性位點(diǎn)，而非競爭性抑制是通過干擾酶活性區(qū)域的形成，阻礙底物進(jìn)入活性位點(diǎn)，降低酶的活性。此外抑制劑與酶的結(jié)合強(qiáng)弱、結(jié)合方式等直接關(guān)系到其對酶的抑制作用、藥物的治療效應(yīng)及藥物的不良反應(yīng)[15]。與貝他定不同，芹菜素對酶的抑制作用呈現(xiàn)可逆的競爭性作用時(shí)，可根據(jù)酶活性的高低有效控制其劑量，選擇性、可逆性地降低酶的活性；當(dāng)正常細(xì)胞中的氨肽酶N含量正常時(shí)，芹菜素不會(huì)對其活性有太大影響，而貝他定會(huì)以不可逆的抑制方式使酶失活，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡。

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Inhibitory Mechanisms of Apigenin on Aminopeptidase N of Lung Cancer Cells

ZHOU Yun-fenga, LUO Feib, FU Huan-huana, XIAO Jiang-weic, LIAO Juand

(a. Department of Cardio-Thoracic Surgery， b. Department of Pharmacy, c. the First Department of General Surgery, d. Department of Internal Medicine, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical University, Nanchong, Sichuan 637000, China)

Objective To investigate the effect of Apigenin on the Aminopeptidase N (APN) activity of lung cancer cells and inhibitory mechanisms for mouse hepatitis virus A549 (A549) growth. Methods The inhibition effect and lag time of Apigenin on APN were analyzed using enzyme inhibition and kinetic method. The inhibitory tests of the growth of lung cancer cell A549 and lung normal cell MRC-5 were performed, and the interaction mechanisms of Apigenin on APN was performed by zinc chelation experiment and molecular docking. Results Apigenin had the inhibitory effect on the growth of lung cancer cell A549 and little toxicity to normal lung cell MRC-5, and it was a reversible and competitive inhibitor [inhibitory concentration 50 (IC50): (71.22±2.43)μmol/L]; zinc chelation experiment and molecular docking showed that Apigenin combined with Zn ions in APN active center preferentially, and formed hydrogen bonds with catalytic groups of His383 and Glu350. Conclusion Apigenin is a competitive APN inhibitor, and it has a special inhibitory effect on the growth of lung cancer cells A549.

Apigenin; Lung cancer cells A549; Aminopeptidase N; Inhibitory effect; Molecular mimicry

囯家自然科學(xué)基金(81270561)

637000 四川 南充,川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科(周云峰、付歡歡),藥劑科(羅飛)，普外一科(肖江衛(wèi))，消化內(nèi)科(廖娟)

R285.5；R-332

A

2095-140X(2015)08-0021-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.006

2015-06-16 修回時(shí)間：2015-07-03)