p-ERK1/2在抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)患者移植腎組織中的表達(dá)及意義

晏 強(qiáng),姜 華,王?，?陳懷周,董 力,鄒和群,眭維國

腎臟替代治療專欄

·論著·

p-ERK1/2在抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)患者移植腎組織中的表達(dá)及意義

晏 強(qiáng),姜 華,王?，?陳懷周,董 力,鄒和群,眭維國

目的 探討移植腎組織中磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)1/2的表達(dá)，并分析其與腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)的關(guān)系。方法 檢測解放軍181醫(yī)院全軍器官移植與透析治療中心收治的120例病理診斷符合抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)(chronic antibody-mediated rejection， ABMR)患者移植腎組織中p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)情況，并進(jìn)行半定量分析，分析p-ERK1/2表達(dá)與TGF-β1、Ⅳ型膠原表達(dá)的相關(guān)性，以及p-ERK1/2與IF/TA病理分級的相關(guān)性；以10例正常腎組織作為對照組。結(jié)果 ABMR患者移植腎組織中p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原表達(dá)量均比正常腎組織明顯增加(P<0.05)，并隨著IF/TA病理分級增加呈遞增趨勢(r=0.938、0.926、0.937，P<0.05)。移植腎組織中p-ERK1/2表達(dá)與TGF-β1、Ⅳ型膠原表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.864、0.878，P<0.01)。結(jié)論 p-ERK1/2和TGF-β1可能促進(jìn)了腎移植患者移植腎細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積，而導(dǎo)致移植腎纖維化，p-ERK1/2在ABMR所致移植腎纖維化過程中起重要作用。

腎移植；磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2;抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；Ⅳ型膠原；腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮

腎移植是目前治療腎功能不全尿毒癥期腎病(ESRD)最有效的方法，可極大提高患者的生存率和生活質(zhì)量，隨著移植技術(shù)的不斷完善和新型免疫抑制劑的出現(xiàn)，使得移植后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯下降，患者短期存活率明顯升高，但移植腎半壽期及長期存活率提高不明顯?？贵w介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)(chronic antibody-mediated rejection， ABMR)已經(jīng)成為阻礙移植腎長期存活的主要原因之一，其病理變化主要表現(xiàn)為：移植腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)，包括免疫和非免疫因素，免疫因素指急、慢性排斥反應(yīng)，非免疫因素指高血壓、糖尿病、高血脂等，均可導(dǎo)致慢性移植腎功能不全(chronic renal allograft dysfunction， CRAD)。ABMR是CRAD的免疫性因素[1-2]，影響移植腎的長期成活。腎間質(zhì)纖維化是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等諸多因子相互作用導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡，在腎間質(zhì)異常沉積所致，是一個非常復(fù)雜的過程，至今移植腎纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟和確切發(fā)病機(jī)制尚未得到完全闡明。本研究采用免疫組化方法對移植腎中幾種與纖維化密切相關(guān)的生物活性因子包括磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)1/2、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)1及Ⅳ型膠原進(jìn)行半定量分析，探討p-ERK1/2與纖維化的金指標(biāo)TGF-β1及Ⅳ型膠原之間的相關(guān)性及p-ERK1/2與IF/TA的關(guān)系,研究p-ERK1/2在ABMR發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對象與分組 收集2006年1月—2013年7月解放軍181醫(yī)院全軍器官移植與透析治療中心收治的ESRD腎移植患者，術(shù)后出現(xiàn)肌酐進(jìn)行性升高和頑固性蛋白尿，行移植腎穿刺活檢術(shù)，病理結(jié)果排除急性排斥反應(yīng)、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑[環(huán)孢素(CsA)或他克莫司(FK506)]中毒、腎小球腎炎復(fù)發(fā)等特征性病理改變，提示以IF/TA為特點(diǎn)的非特異性病理改變，并按照Banff 2009移植腎病理分級診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，病理診斷為ABMR的移植腎組織標(biāo)本120例，男68例，年齡(47±6)歲；女52例，年齡(44±8)歲。腎穿刺時間為腎移植術(shù)后1.0～10.5年，通過移植腎彩超、FK506或CsA血藥濃度及T淋巴細(xì)胞亞群等實(shí)驗(yàn)檢測，排除急性排斥反應(yīng)、CsA中毒、移植腎血管狹窄、感染等導(dǎo)致移植腎功能慢性損傷的可能性疾病。所有供、受者血型相同，淋巴細(xì)胞毒交叉配型試驗(yàn)(CDC)<10%，群體反應(yīng)性抗體(PRA)<10%，HLA-A、B、Dr位點(diǎn)至少有2個位點(diǎn)相配。以10例正常腎組織標(biāo)本作為對照組，病理檢查未見異常，男6例，年齡(37±5)歲；女4例，年齡(39±6)歲。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病理診斷分級 按照Banff 2009移植腎病理分級診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]將移植腎IF/TA的嚴(yán)重程度分為Ⅰ級：輕度IF/TA(<25%的皮質(zhì)受累)，Ⅱ級：中度IF/TA(26%～50%的皮質(zhì)受累)，Ⅲ級：重度IF/TA(>50%的皮質(zhì)受累)。ABMR的病理組織學(xué)特征為[1]：①C4d(+)，循環(huán)中存在抗供者抗體(DSA)；②IF/TA和(或)腎小球基底膜增厚，呈雙軌征改變；③腎小管周圍毛細(xì)血管基底膜多層改變和(或)動脈纖維性內(nèi)膜增厚。

1.3 材料與試劑 p-ERK1/2鼠抗人單克隆抗體，1∶200稀釋(Santa Cruz公司產(chǎn)品，編號：SC-7383)；兔抗人TGF-β1多克隆抗體、工作液(福建福州邁新試劑公司產(chǎn)品，編號：RAB-0238)；鼠抗人Ⅳ型膠原單抗、工作液(福建福州邁新試劑公司產(chǎn)品，編號：MAB-0025)；兔抗人C4d多克隆抗體、工作液(Santa Cruz公司產(chǎn)品，編號：ZA-0415)

1.4 方法 免疫組化染色采用EnVision法，常規(guī)石蠟切片3 μm，常規(guī)烤片，脫水，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復(fù)15 min，滴加一抗(p-ERK1/2鼠抗人單克隆抗體，1∶200稀釋；兔抗人TGF-β1多克隆抗體；鼠抗人Ⅳ型膠原單抗；兔抗人C4d多克隆抗體)，4℃過夜，PBS液沖洗后滴加兔抗鼠二抗，37℃溫箱孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，觀察。對照組以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.5 半定量分析 采用德國Leica(DMR+Q550型)真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。隨機(jī)選取10個不連續(xù)(避開腎小球和大血管)的腎小管間質(zhì)視野(×400，HPF)，每例腎小管總數(shù)>60個。使用ImagePro-Plus 6.0軟件計算陽性表達(dá)面積，以腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺黃、棕黃、黃褐色顆粒為陽性。測定視野中腎小管間質(zhì)陽性表達(dá)面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值，取其均值代表此例患者某種成分在腎小管和間質(zhì)的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)改變 ABMR所致CRAD移植腎組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為:HE染色見近端小管腫脹，管腔狹窄、閉鎖，間質(zhì)灶性小管萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤(以單個核細(xì)胞為主)，可見蛋白管型(圖1A)；PASM染色見小球系膜增殖，包曼囊壁增厚，小球毛細(xì)血管腔狹窄，基底膜增厚，見雙軌征(圖1B)；Masson染色見腎小球硬化，包曼囊壁纖維化，腎間質(zhì)纖維化(圖1C)。

圖1 抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)所致慢性移植腎功能不全移植腎組織病理學(xué)改變(×400)

2.2 p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)

2.2.1 p-ERK1/2的表達(dá)：正常腎組織中無或僅有極少量p-ERK1/2表達(dá)；CRAD患者移植腎組織中p-ERK1/2表達(dá)明顯增加，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中；隨間質(zhì)病變程度的加重，p-ERK1/2表達(dá)顯著增加。見圖2。

圖2 磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2正常腎組織及抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)所致慢性移植腎功能不全移植腎組織中的表達(dá)(EnVision×400)

2.2.2 TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)：在正常腎組織中，TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，多呈弱陽性，而Ⅳ型膠原主要分布在腎小球、腎小管基底膜及包曼囊壁和系膜區(qū)，在腎間質(zhì)中有少量散在分布，腎小管上皮細(xì)胞中未見表達(dá)。在ABMR患者移植腎組織中，TGF-β1在間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞漿中、小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)基質(zhì)區(qū)多呈陽性表達(dá)，部分腎小球包曼囊壁亦有表達(dá)(圖3)；Ⅳ型膠原除在腎小球、腎小管基底膜及包曼囊壁和系膜區(qū)的表達(dá)較正常腎組織有所增加外，在腎間質(zhì)中表達(dá)亦顯著增加，而且在小血管周圍和管壁中也有表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中則無表達(dá)(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)化生長因子-β1在抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)所致慢性移植腎功能不全移植腎組織中的表達(dá)(EnVision×400)

圖4 Ⅳ型膠原在抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)所致慢性移植腎功能不全移植腎組織中的表達(dá)(EnVision×400)

2.3 ABMR病理分級與p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原表達(dá)的關(guān)系 ABMR各級腎移植患者腎小管間質(zhì)中p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)量比正常腎組織明顯增多，且隨著間質(zhì)病變程度的加重，上述指標(biāo)的表達(dá)量呈遞增趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 正常腎組織及ABMR各級移植腎組織腎小管間質(zhì)中p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原表達(dá)比較

注：p-ERK 1/2為磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；IF/TA為腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮；與正常腎組織比較，aP<0.05；與IF/TA Ⅰ級比較，cP<0.05；與IF/TA II級比較，eP<0.05

2.4 相關(guān)性分析 ABMR移植腎組織中p-ERK1/2、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)隨IF/TA病理分級的增加呈遞增趨勢，并與IF/TA病理分級呈顯著正相關(guān)(r=0.938、0.926、0.937，P<0.01)。線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，腎小管間質(zhì)p-ERK1/2表達(dá)分別與TGF-β1、Ⅳ型膠原表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.864、0.878，P<0.01)。

3 討論

TGF-β1是各種腎臟疾病所引起的腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的必需因子[4]，參與了細(xì)胞生長、分化及ECM的代謝。當(dāng)組織受到炎性損傷時可引起TGF-β1合成增多、降解減少，從而導(dǎo)致膠原及蛋白聚糖等ECM的快速聚集。有文獻(xiàn)報道，在慢性移植腎腎病(CAN)患者移植腎組織中，IF/TA的程度隨著TGF-β1表達(dá)的增加而加重，TGF-β1的表達(dá)水平與Ⅳ型膠原的量呈正相關(guān)，證實(shí)了TGF-β1可通過Ⅳ型膠原在移植腎間質(zhì)中的異常沉積導(dǎo)致移植腎間質(zhì)的纖維化，從而導(dǎo)致CRAD的發(fā)生[5]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在ABMR引起的CRAD患者中，TGF-β1可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)活化為p-ERK1/2[6]，介導(dǎo)IF/TA的發(fā)生，參與CRAD的發(fā)生和發(fā)展。

ERK通路屬于絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路系統(tǒng)，是將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)的信號通路之一，主要由3個蛋白激酶級聯(lián)組成，分別為絲裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)、絲裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)和ERK，ERK信號通路的主要激活途徑為Ras/Raf/MEK/ERK[7]。活化后的ERK(p-ERK1/2)將生長因子、化學(xué)因子等胞外信號轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[8]。在腫瘤細(xì)胞浸潤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ERK在介導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程中發(fā)揮著重要的作用[9]，但在CRAD進(jìn)展中的作用機(jī)制尚未得到闡明，亦罕見報道。

本研究觀察到，p-ERK1/2在正常腎組織中表達(dá)微弱或未見表達(dá)，而在ABMR引起的CRAD患者移植腎組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，并隨著IF/TA病理分級的增加而增多，病變越重處p-ERK1/2的染色越深，表達(dá)越多；同時在ABMR所致CRAD的移植腎組織中，TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)亦較正常腎組織明顯增加，且二者表達(dá)均與p-ERK1/2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

腎小管EMT可引起ECM的異常沉積，是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要機(jī)制之一[10]，EMT與移植腎IF/TA的發(fā)生有關(guān)，是移植腎IF/TA發(fā)生的中間階段[11]。EMT在腎纖維化中所起的作用已經(jīng)在體外培養(yǎng)的細(xì)胞動物腎病模型及人體腎臟相關(guān)疾病的研究中得到證實(shí)[12]。目前已知在眾多調(diào)節(jié)EMT發(fā)生的因素中TGF-β1是最主要的。Xie等[13]對小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ERK通路的活化是TGF-β1介導(dǎo)EMT發(fā)生所必需的。在對特發(fā)性肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK/ERK信號通路后，可明顯緩解成纖維細(xì)胞生長因子-1(FGF-1)對TGF-β1誘導(dǎo)EMT發(fā)生的刺激作用[14]。Zhou等[15]對ERBB2/HER2結(jié)合蛋白(Erbin)的研究中發(fā)現(xiàn)，Erbin的高表達(dá)可阻斷TGF-β1/ERK信號通路，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生，而抑制Erbin的表達(dá)、增強(qiáng)ERK的磷酸化水平，并促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生，TGF-β1通過ERK依賴的途徑誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。本研究中TGF-β1在移植腎中的表達(dá)與p-ERK1/2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，筆者推測，在ABMR引起的CRAD的發(fā)病機(jī)制中，ERK可能作為TGF-β1的下游信號分子，活化為P-ERK1/2后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)了TGF-β1調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生，并在導(dǎo)致IF/TA的過程中起著重要作用。Hsyashida等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過活化MAPK/ERK信號通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞I型膠原的表達(dá)，這種作用可被絲裂原細(xì)胞外激酶(MEK)抑制劑PD98059及ERK顯性失活所阻斷，MAPK/ERK信號通路的活化不僅參與了TGF-β1的表達(dá)，同時介導(dǎo)了TGF-β1的病理生理過程，從而形成惡性循環(huán)，加重了腎臟纖維化。p-ERK1/2還對于TGF-β1下游效應(yīng)分子Smad信號通路的傳導(dǎo)有增效作用，能促進(jìn)膠原纖維化的產(chǎn)生[17]。結(jié)合本研究結(jié)果，ERK作為TGF-β1的下游信號分子，不僅可通過非經(jīng)典的TGF-β1/ERK信號通路被TGF-β1活化，促進(jìn)p-ERK1/2表達(dá)的增加，進(jìn)而介導(dǎo)移植腎EMT的發(fā)生，還能參與到經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號通路中，對膠原纖維的產(chǎn)生起到增效作用，加重腎間質(zhì)纖維化。因此，在ABMR引起CRAD的發(fā)病機(jī)制中，TGF-β1的高表達(dá)可能增強(qiáng)了下游信號分子ERK的激活和膠原纖維的產(chǎn)生，p-ERK1/2在介導(dǎo)TGF-β1所致移植腎間質(zhì)纖維化的過程中起重要作用。

ERK作為TGF-β1發(fā)揮致纖維化作用的下游信號分子，在移植腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有中心環(huán)節(jié)作用[15]。雖然TGF-β1對于ERK的活化、EMT的發(fā)生起開關(guān)作用，似乎可通過阻斷TGF-β1來緩解移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，但已有研究表明，TGF-β1還是一個抗炎細(xì)胞因子，因此，在人體長時間阻斷TGF -β1可能會導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，而產(chǎn)生不利的結(jié)果[18]。而ERK在正常生理條件下激活表達(dá)低，且作用相對單一，因此，如果進(jìn)一步研究能確立p-ERK1/2表達(dá)增加參與CRAD IF/TA的發(fā)病機(jī)制，把抑制ERK的磷酸化作為一個新的治療靶點(diǎn)，可在一定程度上緩解ABMR引起的移植腎纖維化，為延緩CRAD的發(fā)生提供新的思路。

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Expression and Significance of p-ERK1/2 in Transplanted Renal Tissues of Patients with Chronic Antibody-mediated Rejection

YAN Qiang1, JIANG Hua2, WANG Bao-yao1, CHEN Huai-zhou1, DONG Li1, ZOU He-qun3, SUI Wei-guo1

(1. Department of Nephrology Center of Organ Transplantation and Dialysis of PLA Key Laboratory of Metabolic Diseases of Guangxi, 181 Hospital of PLA, Guilin, Guangxi 541002, China; 2. Department of Urology， the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zhuhai, Guangdong 519100, China; 3. Department of Nephrology, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, China)

Objective To investigate the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) in transplanted renal tissues, and to analyze its relationships with interstitial fibrosis and tubular atrophy (IF/TA). Methods The expressions of p-ERK1/2, TGF-β1 and collagen Ⅳ in transplanted renal tissues of 120 pathologically diagnosed patients with chronic antibody-mediated rejection (ABMR) were detected, and the semiquantitative analysis was also performed to analyze relationships between p-ERK1/2 and TGF-β1 or collagen Ⅳ, and the relationships between p-ERK1/2 and the IF/TA pathological grading. A total of 10 healthy renal tissues were used as control group.Results Compared with those in control group, the expressions of p-ERK1/2, TGF-β1 and collagen Ⅳ were significantly higher in transplanted renal tissues of patients with ABMR (P<0.05), and the expressions increased with the increasing pathological grade of IF/TA (r=0.938, 0.926, 0.937,P<0.05). The p-ERK1/2 expression was positively correlated with the TGF-β1 and collagen Ⅳ expressions (r=0.864, 0.878,P<0.01). Conclusion The p-ERK1/2 and TGF-β1 expressions may promote the abnormal sedimentation of renal extracellular matrix (ECM) in transplanted renal tissues of patients with chronic ABMR, which can induce renal fibrosis, and the p-ERK1/2 plays an important role in the process of allograft fibrosis.

Kidney transplantation； Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2; Chronic antibody- mediated rejection; Transforming growth factor-β1; Collagen Ⅳ; Interstitial fibrosis and tubular atrophy

國家自然科學(xué)基金(81270840)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金(20124433110020)；廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFB018105)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2014533)

541002 桂林，解放軍181醫(yī)院腎臟科 全軍器官移植與透析治療中心 廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(晏強(qiáng)、王?，?、陳懷周、董力、眭維國)；519100 廣東 珠海，遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院泌尿外科(姜華)；510630 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬三院腎內(nèi)科(鄒和群)

眭維國，suiwg@163.com

R692.5

A

2095-140X(2015)08-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.001

2015-06-11 修回時間：2015-06-30)