凡納濱對蝦內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用

陳詩妍,吉宏武,2,3,*,李承勇,3,蘇偉明,3,郝記明,黃杰恒

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室,廣東湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088)

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凡納濱對蝦內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用

陳詩妍1,吉宏武1,2,3,*,李承勇1,3,蘇偉明1,3,郝記明1,黃杰恒1

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室,廣東湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088)

為確定引起凡納濱對蝦自溶的主要酶類及分布部位,本文測定了凡納濱對蝦各內(nèi)源蛋白酶的活性,分析主要內(nèi)源蛋白酶貯藏期間的變化,并比較主要內(nèi)源蛋白酶對蝦肌原纖維蛋白的降解作用。結(jié)果顯示,蝦頭蛋白酶活達90.17U/mg,是蝦肉的300倍。蝦頭中的胰蛋白酶活性最高,達13.59U/mg。全蝦貯藏4d后蝦肉總酶活和胰蛋白酶活增加,于第8d蝦肉第一腹節(jié)總酶活增至1.66U/mg,胰蛋白酰胺酶和酯酶活分別達到0.97U/mg和1.84U/mg。SDS-PAGE結(jié)果顯示,隨貯藏溫度和時間的增大,內(nèi)源酶對肌原纖維蛋白的肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)降解程度越大,其中蝦頭中胰蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用最強。因此凡納濱對蝦胰蛋白酶很可能是肌肉軟化的主要作用酶。

凡納濱對蝦,內(nèi)源蛋白酶,肌原纖維蛋白,肌肉軟化,胰蛋白酶

水產(chǎn)品死后由于內(nèi)源蛋白酶的自溶作用,肌肉極易軟化,嚴重影響到水產(chǎn)品的質(zhì)量和商業(yè)價值。如何防止肌肉自溶,抑制組織軟化,是目前水產(chǎn)品保鮮技術上亟待解決的問題。目前研究發(fā)現(xiàn),水產(chǎn)品的內(nèi)源蛋白酶主要有肌鈣蛋白酶、溶酶體組織蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、蛋白酶體、耐熱型堿性蛋白酶和消化道蛋白酶等[1]。內(nèi)源蛋白酶的作用是個復雜的過程,不同蛋白酶作用不同[2-3]。魚類的自溶現(xiàn)象主要由肌肉中的蛋白酶引起,其中組織蛋白酶和肌鈣蛋白酶是主要作用酶[4-6]。對于無脊椎動物的蝦類,自溶還可能與頭部的消化酶有關。如在羅氏沼蝦等淡水蝦中,自溶現(xiàn)象最先出現(xiàn)在接近蝦頭的第一腹節(jié)[7]。來源于蝦頭的蛋白酶對肌肉組織有顯著的降解效果,并與蝦肉的質(zhì)構(gòu)變化存有一定相關性[[8-10]。貯藏期間蝦頭的胰蛋白酶出現(xiàn)在肌肉中[11]。胰蛋白酶屬絲氨酸蛋白酶家族,是蝦頭中最主要的堿性蛋白酶,具有較強的蛋白水解性[12]。

凡納濱對蝦是我國主要對蝦品種,頭部富含各種消化酶,具有很強的自溶能力[13],其中胃蛋白酶和胰蛋白酶是蝦頭最主要的消化酶[14]。在凡納濱對蝦的貯藏期間,消化酶也出現(xiàn)在蝦肉中[15],但這方面缺乏進一步的研究證實。為確定引起凡納濱對蝦自溶的主要蛋白酶,探索凡納濱對蝦頭部的蛋白酶能否向肌肉遷移,是否對肌肉產(chǎn)生降解,本研究對凡納濱對蝦頭部與肌肉中內(nèi)源蛋白酶的活性進行檢測,分析主要內(nèi)源蛋白酶貯藏期間的變化,并比較主要內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用,為開發(fā)新型保鮮技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei) 2013年7月于湛江恒興南方海洋科技有限公司養(yǎng)殖基地(國家(863)海水養(yǎng)殖種子工程南方基地)采樣,活運至水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室,清洗后選取完整個體冰藏待用;BApNA,TAME,Suc-Leu-Tyr-AMC,Z-Arg-Arg-AMC,Z-Phe-Arg-AMC,L-Arg-AMC 購于Sigma公司;DMSO 購于Amresco公司;牛血清白蛋白 購于Genview公司;酪蛋白 購于國藥集團化學試劑有限公司;SDS-PAGE預制膠 購于上海迪申生物技術有限公司;蛋白質(zhì)Markers 購于寶生物工程(大連)有限公司;其他試劑均為分析純。

KK22F57TI型電冰箱 西門子有限公司;T25型勻漿機 德國IKA公司;CR22GⅡ型高速冷凍離心機 日本日立公司;DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽 北京六一儀器廠;Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;UV-210PC分光光度計 上海森超貿(mào)易有限公司;全波長多功能酶標儀 美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)源蛋白酶活性測定

1.2.1.1 蝦頭和蝦肉蛋白酶活性 取新鮮蝦頭與蝦肉分別加入3倍體積pH8.0、20mmol/L的磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS)和pH7.0、20mmol/L的PBS,勻漿,4℃ 10000r/min離心30min,得蝦頭和蝦肉粗酶液,并測定該酶活。

1.2.1.2 蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶活性 取新鮮蝦頭分別加入3倍體積pH3.0、20mmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液和pH8.0、20mmol/L PBS,勻漿,4℃ 10000r/min離心30min,收集上清液。經(jīng)硫酸銨分級沉淀后透析,得蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶粗酶液,并測定該酶活。

1.2.1.3 蝦肉肌鈣蛋白酶和組織蛋白酶活性 取蝦肉粗酶液,分別以Suc-Leu-Tyr-AMC、Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC、L-Arg-AMC為特異性底物測定肌肉中肌鈣蛋白酶、組織蛋白酶B、L、H的活性。

1.2.1.4 可溶性蛋白的測定方法 采用Lowry法,以牛血清白蛋白為標準樣品。

1.2.2 內(nèi)源蛋白酶貯藏過程的變化

1.2.2.1 預處理 取鮮活凡納濱對蝦用冰猝死,一組用刀切去蝦頭及腸線,另一組為全蝦。將兩組蝦浸泡到1∶5(m∶v)0.1%NaN3抑菌溶液10min,低溫晾干3min,0℃貯藏0～8d,取蝦頭及蝦肌肉第一、二腹節(jié)進行酶活檢測。

1.2.2.2 總蛋白酶活測定 參照1.2.1.1的方法測定。

1.2.2.3 胰蛋白酶特異性酶活測定 酰胺酶活測定:以BApNA為底物,反應體系為200μL樣品+1mL緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L CaCl2,pH為8)+200μL 4mg/mL BApNA,于25℃反應15min,以400μL 30%的乙酸終止反應。生成的ρ-硝基苯胺含量在分光光度計上(410nm)測定各吸光值。在波長410nm的吸光度下每分鐘生成1μmol ρ-硝基苯胺相當?shù)拿噶繛?個酶活力單位。

酶活力(U/mL)=(A-A0)×反應體積(mL)×106/8800×15(min)×0.2

其中:A和A0分別為樣品和空白的A410;8800cm-1M-1為ρ-硝基苯胺消光系數(shù);106為單位轉(zhuǎn)換倍數(shù)1mol=106μmol;15min為反應時間。

酯酶活測定:以TAME為底物,反應體系為20μL樣品+3mL 1mmol/L TAME的pH8.0 10mmol/L Tris-HCl緩沖液,于25℃反應15min。生成的ρ-甲苯磺?；彼岷吭诜止夤舛扔嬌?247nm)測定各吸光值。在波長247nm下每分鐘增加的吸光值相當?shù)拿噶繛?個酶活力單位。

其中：A和A0分別為樣品和空白的A247。

1.2.3 內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用

1.2.3.1 內(nèi)源蛋白酶制備 蝦頭和蝦肉蛋白酶提取同1.2.1.1;蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶提取同1.2.1.2。

1.2.3.2 肌原纖維蛋白的提取 取蝦肉加入10倍體積的預冷緩沖液(15.6mmol/L Na2HPO4,3.5mmol/L KH2PO4,pH7.5)均質(zhì),4℃ 5000r/min離心20min,取沉淀中加入10倍體積預冷緩沖液(0.45mol/L KCl,15.6mmol/L Na2HPO4,3.5mmol/L KH2PO4,pH7.5),均質(zhì),4℃ 5000r/min離心20min,得肌原纖維蛋白液。

表1 凡納濱對蝦內(nèi)源蛋白酶活性測定Table 1 Different endogenous proteases activities from Litopenaeus vannamei shrimp

注:數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示(n=3),下同。

1.2.3.3 內(nèi)源蛋白酶與肌原纖維蛋白反應 粗酶液與肌原纖維蛋白液混合,0、10、25℃下分別反應8、4d和8h,并分別每2、1d和2h取樣。反應體系為反應液100μL+50μL終止液(2% SDS,8mol/L尿素,2%β-巰基乙醇,85℃),85℃反應60min,待用。

1.2.3.4 SDS-PAGE分析 取20μL蛋白液加上樣緩沖液后,不同蛋白酶與肌原纖維蛋白的反應結(jié)果加熱3～5min,進行SDS-PAGE分析。電泳條件:分離膠濃度10%,濃縮膠濃度5%,恒壓200V。以考馬斯亮藍R-250染色,于凝膠成像系統(tǒng)分析肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)的帶強變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)分別應用JMP軟件和Origin軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖,數(shù)據(jù)分析中,組間比較采用t-檢驗,顯著性界值為p=0.05,p<0.05為差異顯著,p≥0.05說明沒有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)源蛋白酶活性測定

無脊椎動物是一類缺乏完整消化系統(tǒng)的低等生物,消化器官無明顯分界。凡納濱對蝦屬無脊椎水生生物,主要消化器官為集中在頭部的肝胰臟消化腺,僅由一層被膜包裹,內(nèi)含多種消化酶[16]。從表1可見,凡納濱對蝦頭部的蛋白酶活高達90.17U/mg,是蝦肉的300倍;在蝦頭中,胰蛋白酶活性最高,達13.59U/mg;在蝦肉中,組織蛋白酶L最高,達0.072U/mg。對比6種主要內(nèi)源蛋白酶,頭部胰蛋白酶活性最高,是肌肉組織蛋白酶的100余倍。吳燕燕[17]和Hernandez[18]等都證實了凡納濱對蝦頭部蛋白酶聚集的部位,具有較高的蛋白酶活。據(jù)文獻[19-20]報道,蝦頭中胰蛋白酶是最主要的蛋白酶。Sriket[10]在羅氏沼蝦肌肉中也檢測到肌鈣蛋白酶和組織蛋白酶L的活性,證實組織蛋白酶L活性較高。Chen[21]和Wang[22]分別在克氏螯蝦和斑節(jié)對蝦肌肉中也發(fā)現(xiàn)了肌鈣蛋白酶類。組織蛋白酶在魚類肌肉中報道得比較多,主要有組織蛋白酶B、D、L、H等[1,23]。

2.2 內(nèi)源蛋白酶貯藏過程的變化

2.2.1 總蛋白酶活變化 從圖1-a可見,貯藏期間凡納濱對蝦頭部的總蛋白酶活基本沒有變化,而蝦肌肉的總蛋白酶活隨貯藏時間延長不斷增大(p<0.05)。蝦頭總蛋白酶在貯藏8d內(nèi)仍保持較高的活性,酶活僅下降19.42%。蝦肉中,貯藏4d的全蝦第一腹節(jié)總蛋白酶活從0.23U/mg增至0.92U/mg,并在8d升至1.66U/mg;全蝦第二腹節(jié)總蛋白酶活也在第8d有出現(xiàn)上升趨勢,達0.37U/mg;去頭蝦各腹節(jié)總蛋白酶活無明顯變化。Sriket等[11]在羅氏沼蝦的貯藏期間也觀察到這種現(xiàn)象。由于蝦經(jīng)NaN3處理,可排除微生物的影響,所以這種現(xiàn)象的出現(xiàn)很可能是因為貯藏期間蝦頭部的內(nèi)源蛋白酶向蝦肌肉擴散并產(chǎn)生遷移引起的。

圖1 蝦不同部位總蛋白酶(a) 與胰蛋白酶酰胺酶(b)和酯酶(c)的活性Fig.1 Total proteolytic activity(a)and trypsin activity assayed as amidase activity(b)and esterase activity(c) of different segments of shrimp

注:標注不同字母表示有顯著差異(p<0.05)。

2.2.2 胰蛋白酶活變化 凡納濱對蝦胰蛋白酶在貯藏期間的變化情況由胰蛋白酶的酰胺酶活(圖1-b)和酯酶活(圖1-c)表示。圖中顯示,蝦頭的胰蛋白酶保持較高的活性,變化不大。蝦肉中,貯藏4d的全蝦第一腹節(jié)開始出現(xiàn)胰蛋白酶酰胺酶,酶活達0.82U/mg,8d后該酶在全蝦第二腹節(jié)出現(xiàn),達到0.34U/mg(圖1-b);胰蛋白酶的酯酶也在貯藏4d的全蝦第一腹節(jié)出現(xiàn),酶活達0.053U/mg,8d增至1.84U/mg,但未在第二腹節(jié)檢測酯酶活(圖1-c);去頭蝦各腹節(jié)未檢測到酯酶活性。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)很可能是因為蝦頭中部分胰蛋白酶在貯藏期間逐漸向蝦肉遷移。相似的情況也出現(xiàn)在羅氏沼蝦的研究中[11]。Ezquerra[15]在貯藏期間也檢測到有消化酶出現(xiàn)在凡納濱對蝦肌肉中。

2.3 內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用

2.3.1 蝦頭與蝦肉蛋白酶作用 來源于凡納濱對蝦不同部位的內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用如圖2所示,對肌原纖維蛋白中的肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)的降解程度如圖3所示。蝦頭中的內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用最強(圖2a、圖2c、圖2e),蝦肉中的內(nèi)源蛋白酶對肌原纖維蛋白幾乎無降解作用(圖2b、圖2d、圖2f)。這是因為凡納濱對蝦頭部是消化器官集中的部位,富含多種消化酶,而肌肉的蛋白酶種類和含量較少[16]。Oh[24]也闡明了蝦的頭部具有很高的蛋白水解能力。

圖2 不同溫度下蝦頭和蝦肉粗酶對肌原纖維蛋白降解的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of myofibrillar protein incubated with crude extract from head and muscle of shrimp at different temperature

注:a,b分別為25℃蝦頭和蝦肉粗酶液;c,d分別為10℃蝦頭和蝦肉粗酶液;e,f分別為0℃蝦頭 和蝦肉粗酶液;圖中M為分子量Marker;C0、C4、C8為反應不同時間的空白組。

在三個貯藏溫度下,蝦頭的蛋白酶對分子量約200ku的MHC降解很明顯,在200ku條帶不斷減弱的同時66.4～116ku區(qū)間的強度先是不斷增加,至200ku條帶消失后該區(qū)間強度開始減弱;分子量約40ku的Actin也出現(xiàn)明顯的降解,在40ku條帶不斷減弱的同時30～40ku區(qū)間的強度先是不斷增加,至40ku條帶消失后該區(qū)間強度開始減弱。這結(jié)果說明蝦頭的蛋白酶可能將MHC和Actin降解為小分子蛋白或肽,小分子蛋白或肽再進一步分解分子量更小的物質(zhì)。Sriket[10]在羅氏沼蝦的研究中也說明了蝦頭的蛋白酶對肌原纖維蛋白和膠原蛋白有很強的降解作用。

蝦頭的蛋白酶對肌纖維蛋白的降解速度與貯藏的溫度密切相關。如圖3所示,25℃,8h蝦頭蛋白酶作用下的MHC和Actin分別下降了96.36%和77.52%;10℃,4d MHC和Actin分別下降96.80%和97.59%;0℃,8d MHC和Actin分別下降97.97%和94.82%。貯藏溫度越高,蝦頭蛋白酶對肌原纖維蛋白降解速度越快。蛋白酶活受溫度影響較大,在一定溫度范圍內(nèi),貯藏溫度越高,酶活性越高,因此蝦頭蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解越快[25]。

圖3 不同溫度下蝦頭和蝦肉酶對肌球蛋白和肌動蛋白降解情況Fig.3 MHC and actin incubated with crude extract from head and muscle of shrimp at different temperature

注:a,b:25℃;c,d:10℃;e,f:0℃。

圖4 不同溫度下蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶對肌原纖維蛋白降解的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of myofibrillar protein incubated with acid and alkaline proteinase from head of shrimp at different temperature

注:a,b分別為25℃胃蛋白酶和胰蛋白酶;c,d分別為10℃胃蛋白酶和胰蛋白酶;e,f分別為0℃胃蛋白酶 和胰蛋白酶;圖中M為分子量Marker;C0、C4、C8為反應不同時間的空白組。

圖5 不同溫度下蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶對肌原纖維蛋白的肌球蛋白和肌動蛋白降解情況Fig.5 MHC and Actin of myofibrillar protein incubated with acid and alkaline proteinase from head of shrimp at different temperature

注:a,b:25℃;c,d:10℃;e,f:0℃。

2.3.2 蝦頭胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用 凡納濱對蝦頭部的胃蛋白酶和胰蛋白酶對肌原纖維蛋白的作用如圖4所示,對肌原纖維蛋白中的肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)的降解程度如圖5所示。蝦頭胰蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用最強(圖4b、圖4d、圖4f),胃蛋白酶對肌原纖維蛋白降解作用較弱(圖4a、圖4c、圖4e)。胃蛋白酶屬酸性蛋白酶,胰蛋白酶屬堿性蛋白酶[14],在pH接近7的蝦肉中,胰蛋白酶具有較高活性而胃蛋白酶受到抑制,所以胰蛋白酶對肌原纖維蛋白有較強的降解作用。

在三個貯藏溫度下,胰蛋白酶對分子量約200ku的MHC降解作用明顯,在200ku條帶不斷減弱的同時66.4～116ku區(qū)間的強度先是不斷增加,至200ku條帶消失后該區(qū)間強度開始減弱;分子量約40ku的Actin降解較緩慢,在40ku條帶不斷減弱的同時30～40ku區(qū)間的強度不斷增強。這是MHC和Actin被胰蛋白酶降解成小分子蛋白或肽的結(jié)果。根據(jù)文獻[26-27]報道,胰蛋白酶對蝦肌肉蛋白尤其是肌纖維蛋白和膠原蛋白具有很強的水解性。

不同溫度下,胰蛋白酶對肌纖維蛋白的降解速度不同。如圖5所示,25℃,8h胰蛋白酶作用下MHC和Actin分別下降了96.84%和56.22%;10℃,4d MHC和Actin分別下降97.70%和75.68%;0℃,8d MHC和Actin分別下降93.16%和66.75%。這說明貯藏溫度越高,胰蛋白酶對肌原纖維蛋白降解速度越快。胰蛋白酶的活性對貯藏溫度敏感,在適宜的貯藏溫度下,酶活隨溫度的升高而增大[14]。

因此,可推斷在凡納濱對蝦的內(nèi)源蛋白酶中,胰蛋白酶是肌原纖維蛋白的主要降解酶。

3 結(jié)論

凡納濱對蝦內(nèi)源蛋白酶種類豐富。頭部的蛋白酶,尤其是胰蛋白酶活性最高,對肌原纖維蛋白降解作用最強。蝦頭胰蛋白酶在貯藏期間能向肌肉擴散和遷移,并參與肌原纖維蛋白的降解,導致組織軟化。因此推測蝦頭胰蛋白酶是凡納濱對蝦肌肉軟化的主要原因,但胰蛋白酶的對肌原纖維蛋白的降解機制及肌肉中的遷移規(guī)律等方面還有待進一步研究。

[1]Delbarre-Ladrat C,Cheret R,Tsylor R,et al.Trends in postmortem aging in fish:Understanding of proteolysis and disorganisation of the myofibrillar structure[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2006,46(5):409-421.

[2]葉麗芳,勵建榮.海洋魚蝦中內(nèi)源蛋白酶的研究狀況[C].浙江:食品安全監(jiān)督與法制建設國際研討會暨第二屆中國食品研究生論壇,2005-11-12.

[3]Pacheco-Aguilar R,Lugo-Sanchez M E,Robles-Burgueno M R.Postmortem biochemical and functional characteristic of monterey sardine muscle stored at 0℃[J].Journal of Food Science,2000,65(1):40-47.

[4]Gaarder M,Bahuaud D,Veiseth-Kent E,et al.Relevance of calpain and calpastatin activity for texture in super-chilled and ice-stored Atlantic salmon(Salmo salar L.)fillets[J].Food Chemistry,2012,132(1):9-17.

[5]Cheret R,Delbarre-Ladrat C,Lamballerie-Anton M,et al.Calpain and cathepsin activities in post mortem fish and meat muscles[J].Food Chemistry,2007,101(4):1474-1479.

[6]Godiksen H,Morzel M,Hyldig G,et al.Contribution of cathepsins B,L and D to muscle protein profiles correlated with texture in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Food Chemistry,2009,113(4):889-896.

[7]Nip W K,Moy J H. Microstructural changes of ice-chilled and cooked freshwater prawn,Macrobrachium rosenbergii[J].Journal of Food Science,1988,53(2):319-322.

[8]Lindner P,Angel S,Zvi G,et al. Study of the Proteolytic Activity of the Hepatopancreas of the Freshwater Prawn,Macrobrachium rosenbergii,and its Role in Inducing Mushiness in Muscle Tissue During Post-Mortem Storage[J].Food Chemistry,1989,32(1):19-29.

[9]Brauer J M E,Leyva J A S,Alvardo L B,et al. Effect of dietary protein on muscle collagen,collagenase and shear force of farmed white shrimp(Litopenaeus vannamei)[J].European Food Research and Technology,2003,217(4):277-280.

[10]Sriket C,Benjakul S,Visessanguan W,et al. Characterisation of proteolytic enzymes from muscle and hepatopancreas of fresh water prawn(Macrobrachium rosenbergii)[J].Society of Chemical Industry,2010,91(1):52-59.

[11]Sriket C,Benjakul S,Visessanguan W,et al. Collagenolytic serine protease in fresh water prawn(Macrobrachium rosenbergii):Characteristics and its impact on muscle during iced storage[J].Food Chemistry,2011,124(1):29-35.

[12]王萍,吳燕燕,李好來,等.蝦類胰蛋白酶的研究進展[J].生物技術通報,2011(2):42-97.

[13]曹文紅,章超樺,洪鵬志,等.響應面法優(yōu)化南美白對蝦蝦頭自溶工藝的研究[J].中國食品學報,2009,9(1):158-164.

[14]莊志凱.凡納濱對蝦蝦頭內(nèi)源性蛋白酶的分離純化與酶學特性研究[D].湛江:廣東海洋大學,2011.

[15]Ezquerra J M,Garcia-Carreno F L,Haard N F,et al. Effects of feed diets on digestive proteases from the hepatopancreas of white shrimp(Penaeus vannamei)[J].Journal of Food Biochemistry,1997,21(5):401-419.

[16]王克行.蝦類健康養(yǎng)殖原理與技術[M].北京:科學出版社,2008,8:56-58.

[17]吳燕燕,王萍,李好來,等.3種不同蝦類蝦頭中酶的篩選[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2011(14):116-119.

[18]Hernandez A B,Farias S I.Invitrostudies of the effects of aflatoxin B1and fumonisin B1on trypsin-like and collagenase-like activity from the hepatopancreas of white shrimp(Litopenaeus vannamei)[J].Agriculture,2005,250(1):399-410.

[19]銀鳳,周愛梅,張祥剛,等.南美白對蝦蝦頭主要自溶酶的分離純化及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(3):23-26.

[20]翁凌,李騰,陰利華,等.南美白對蝦絲氨酸蛋白酶的分離純化及性質(zhì)研究[J].2009,15(4):32-38.

[21]Chen G,Guttmann R P,Xiong Y L,et al.Protease activity in post-mortem red swamp crayfish(Procambarus clarkii)muscle stored in modified atmosphere packaging[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,2008,56(18):8658-8663.

[22]Wang J H,Ma W C,Su J C,et al.Comparison of the properties of m-calpain from tilapia and grass shrimp muscles[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,1993,41(1):1379-1384.

[23]陳琳,唐瑋,徐幸連,等.溶酶體中的組織蛋白酶及其在肌肉成熟中的作用[J].江西農(nóng)業(yè)學報,2008,20(2):72-75.

[24]Oh E S,Kim D S,Kim J H,et al. Enzymatic properties of a protease from the hepatopancreas of shrimp,Penaeus orientalis[J].Journal of Food Biochemistry,2000,24(3):251-264.

[25]朱國萍,曹文紅,章超樺,等.凡納濱對蝦蝦頭自溶動力學[J].水產(chǎn)學報,2010,34(3):395-403.

[26]Wang P A,Vang B,Pedersen A M,et al. Post-mortem degradation of myosin heavy chain in intact fish muscle:Effects of pH and enzyme inhibitors[J].Food Chemistry,2011,124(3):1090-1095.

[27]Aoki H,Ahsan M N,Matsuo K,et al. Purification and characterization of collagenolytic proteases from the hepatopancreas of northern shrimp(Pandalus eous)[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,2003,51(3):777-783.

Degradation of myofibrillar protein by endogenous proteasesfromLitopenaeusvannamei

CHEN Shi-yan1,JI Hong-wu1,2,3,*,LI Cheng-yong1,3,SU Wei-ming1,3,HAO Ji-ming1,HUANG Jie-heng1

(1. College of Food Science and Technology,Zhanjiang 524088,China;2.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China;3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processingand Safety,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

In order to determine the endogenous protease that results in muscle softening and its distribution inLitopenaeusvannamei,different endogenous proteases activities from the shrimp were examined,as well as the changes of main proteases during ice storage and the proteolytic degradation of myofibrillar protein by endogenous proteases were monitored in this study. Results showed that proteolytic activity in the shrimp head was up to 90.17U/mg,300 times higher than that in muscle. In shrimp head,the trypsin was the most important proteinase,with 13.59U/mg activities. In addition,the increase of total proteolytic and trypsin activities in shrimp muscle were detected after 4 days of storage,and the total proteolytic activity in first segments increased to 1.66U/mg after 8 days of storage,while trypsin activities were 0.97U/mg and 1.84U/mg when BApNA and TAME were used as substrate,respectively. In the results of SDS-PAGE,the degradation of MHC and Actin in myofibrillar protein by endogenous proteases was enhanced with increasing storage temperature and time. Among them,the trypsin had the most remarkable effect on the degradation of myofibrillar protein. Therefore,these results indicated that the release of trypsin fromLitopenaeusvannameishrimp head was most likely responsible for the undesirable softening of the shrimp muscle during post-mortem storage.

Litopenaeusvannamei;endogenous proteases;myofibrillar protein;muscle softening;trypsin

2014-05-19

陳詩妍(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用。

*通訊作者:吉宏武(1962-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用。

國家蝦產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-47);廣東省海洋漁業(yè)科技攻關重大項目(A201008102)；廣東省科技團隊項目(2011A020102005)；廣東海洋漁業(yè)科技推廣專項科技攻關與研發(fā)項目(A201209C02)。

TS251.1

A

1002-0306(2015)05-0149-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.023