納米顆粒對(duì)植物光合作用影響機(jī)制的研究

李 威， 黃 進(jìn)， 李其昌， 蘇寶連， 謝 浩

(1. 武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430070;2. 武漢理工大學(xué) 生命復(fù)合材料實(shí)驗(yàn)室， 武漢430070)

納米顆粒對(duì)植物光合作用影響機(jī)制的研究

李 威1, 2， 黃 進(jìn)1， 李其昌1， 蘇寶連2， 謝 浩1

(1. 武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430070;2. 武漢理工大學(xué) 生命復(fù)合材料實(shí)驗(yàn)室， 武漢430070)

為探討納米顆粒對(duì)植物光合作用的影響，采取一種簡(jiǎn)單、高效的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)行研究。選取具有代表性的5種金屬氧化物納米顆粒與植物光合作用的主要場(chǎng)所葉綠體相互作用，測(cè)定葉綠體光合活性、熒光效應(yīng)的變化，并通過(guò)掃描電鏡、熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。研究表明納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的影響是通過(guò)相互接觸完成的；ZnO及CdS對(duì)其活性有明顯的抑制效應(yīng)，并隨著濃度的增加其抑制效應(yīng)越顯著；γ-Fe2O3納米顆粒作為電子受體，在低濃度條件下提高其活性，但隨著濃度的增加逐漸顯現(xiàn)為抑制效應(yīng)。故而推測(cè)納米顆粒的影響機(jī)制是影響電子傳遞過(guò)程。這為納米材料在植物領(lǐng)域，包括納米化肥，納米仿生，可再生性高效生化探測(cè)器的發(fā)展提供了參考，同時(shí)也為評(píng)估納米材料對(duì)環(huán)境的潛在影響提供了理論基礎(chǔ)。

納米顆粒；葉綠體；光合活性；光合作用

納米顆粒由于尺寸小(1～100 nm)和比表面積大等特點(diǎn)，而使其具有優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，并且在生物醫(yī)學(xué)、光學(xué)及電子領(lǐng)域[1-2]具有廣泛應(yīng)用潛力。

在目前，人工模擬光合作用將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為電化學(xué)能也是一熱門(mén)話題。同時(shí)，利用太陽(yáng)能是化學(xué)和材料科學(xué)發(fā)展及研究人工光合系統(tǒng)一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[3]。這同樣也是納米材料——半導(dǎo)體納米晶體量子點(diǎn)[2,4]的主要研究領(lǐng)域。但目前的這些研究，如將納米量子點(diǎn)與氧化還原酶相結(jié)合在可見(jiàn)光的照射下完成光酶轉(zhuǎn)換[5]；核-殼納米顆粒量子點(diǎn)與生物光捕獲蛋白LHCⅡ雜化提高光能利用率[6]等，都是與生物材料結(jié)合后來(lái)提高納米材料的光電轉(zhuǎn)化率。反之，納米材料的光電轉(zhuǎn)化能力能否促進(jìn)生物材料，如葉綠體的光合作用效率的研究則較少。

另外，在過(guò)去的幾十年里，在使用微?？刂浦参锊±韺W(xué)——納米農(nóng)藥領(lǐng)域引起了廣泛的研究興趣。微粒系統(tǒng)采用納米顆粒代替或提高一些化學(xué)合成農(nóng)藥的效果或直接產(chǎn)生生物防治的效果[7]，例如納米農(nóng)藥碳納米管封裝的殺蟲(chóng)劑[8]，硫納米顆粒作為殺真菌劑的綠色農(nóng)藥[9]等研究取得了一定成果。但納米材料對(duì)植物的生理影響則很少涉及。

麻省理工學(xué)院近期研究[10]表明：植物細(xì)胞器與非生物納米結(jié)構(gòu)之間的對(duì)接能提高細(xì)胞器的光能利用率并賦予其新的功能。單壁碳納米管(SWNTs)在離體的葉綠體內(nèi)被動(dòng)運(yùn)輸不可逆的集中在脂膜上，將光合活性提高了3倍以上，并且提高了電子傳遞的閾值。此外，近紅外熒光監(jiān)測(cè)顯示，這一對(duì)接同樣可以用作光化學(xué)傳感器。這一發(fā)現(xiàn)可能發(fā)展成為一個(gè)新的領(lǐng)域——植物納米仿生。植物納米仿生工程可能會(huì)促進(jìn)仿生材料在光捕獲及再生性高效生化檢測(cè)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。

為進(jìn)一步研究納米顆粒對(duì)植物生理的影響，本文選取綠色植物光合作用的主要細(xì)胞器——葉綠體為研究對(duì)象，選定5種金屬氧化物納米顆粒與之結(jié)合，建立實(shí)驗(yàn)體系。然后測(cè)定納米顆粒對(duì)其葉綠體的生理生化指標(biāo)及形態(tài)影響進(jìn)行分析。為植物納米仿生工程納米材料的選擇提供一定的基礎(chǔ)，進(jìn)一步加強(qiáng)納米顆粒對(duì)植物的影響的了解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

nano-γ-Fe2O3、nano-ZnO和nano-TiO2這3種納米顆粒對(duì)植物種子萌發(fā)及根生長(zhǎng)的影響早有研究[11-13]。CdS、ZnO和TiO2這3種納米顆粒是研究光催化的主要材料。LiFePO4為鋰電池正極材料。這5種納米顆粒與植物生長(zhǎng)及光催化的研究有一定的聯(lián)系。

nano-γ-Fe2O3由武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院提供，其濃度為5.4 mg/mL，CdS、ZnO、LiFePO4、銳鈦礦TiO2則由武漢理工大學(xué)生命復(fù)合材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。其尺寸均保證在十幾個(gè)納米級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠體懸浮液的制備

菠菜(spinach,Spinaciaoleracea)采自于市售菠菜，洗凈后剪碎放入研缽，加適量預(yù)冷的提取液(山梨醇330 mmol/L、MES 50 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、MgCl22 mmol/L、抗壞血酸2 mmol/L，pH值6.1)快速研磨，8層紗布過(guò)濾，濾液于1 000 r/min、4 ℃離心2 min，上清液2 500 r/min，4 ℃離心2 min。并用少許蒸餾水洗去表面附著的破碎葉綠體。沉淀加入緩沖溶液(0.05 mol/L Tris-HCl pH值7.4、5 mmol/L MgCl2、0.4 mol/L蔗糖)，即得到葉綠體懸浮液[14]。

得到的葉綠體懸浮液分別加入γ-Fe2O3、CdS、ZnO和LiFePO4、銳鈦礦TiO2納米顆粒，各包含100 μg、200 μg和400 μg 3個(gè)濃度梯度。4℃混合過(guò)夜。

1.2.2 葉綠體光還原活性的測(cè)定

葉綠體的Hill反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)葉綠體的光合活性[15]。Hill試劑即染料2,6-二氯酚靛酚，處于氧化態(tài)時(shí)為藍(lán)色，還原態(tài)時(shí)為無(wú)色。葉綠體懸浮液0.1 mL，緩沖液(0.05 mol/L Tris-HCl pH值7.4、5 mmol/L MgCl2、0.4 mol/L蔗糖)1.8 mL，加入0.02% DCIP 0.1 mL后立即攪拌，25℃條件下，500 W燈泡光照5 min。每隔1 min用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm處的光吸收值。

1.2.3 葉綠體熒光光譜的測(cè)定

葉綠體中的Chla受光激發(fā)后，吸收的能量很快地以熒光和熱的形式被釋放。將待測(cè)溶液在熒光分光光譜儀上測(cè)定，測(cè)定溫度為25 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)436 nm[15]，發(fā)射波長(zhǎng)范圍600～800 nm。而納米顆粒CdS、ZnO和TiO2均具有熒光效應(yīng)，激發(fā)波長(zhǎng)分別為370 nm，300 nm和274 nm[16-18]。但葉綠體的激發(fā)光能量不足以使金屬納米顆粒產(chǎn)生熒光效應(yīng)。

1.2.4 葉綠體形貌及熒光觀察

葉綠體懸浮液離心洗滌，用PBS緩沖液懸浮，用終濃度為1.5%的多聚甲醛和戊二醛在4 ℃條件下固定2 h。PBS洗滌后，用乙醇梯度脫水，乙醇濃度從30%遞增至100%。將處理好的樣品滴到醋酸纖維薄膜上，37 ℃烘干，噴金后用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡FESEM(Hitachi S4800)觀察[19]。

由于葉綠素受光激發(fā)后自發(fā)熒光，可直接將葉綠體懸浮液滴到載玻片上，用熒光顯微鏡(Olympus IX73)觀察。激發(fā)光為綠光，葉綠體自發(fā)熒光為紅光。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體光合活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

在光照條件下，葉綠體進(jìn)行光合作用產(chǎn)生還原H+還原Hill染料，其在600 nm處的吸收值在5 min內(nèi)的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 葉綠體光吸收值

圖1A的6條曲線從高到低依次為0～5 min的光譜曲線；圖1B中反映了葉綠體的ΔD(600 nm)隨時(shí)間呈線性變化的趨勢(shì)。ΔD(600 nm)的大小間接反映了葉綠體光合活性的變化趨勢(shì)。ΔD(600 nm)越大，光合效率越高。在此基礎(chǔ)上，納米顆粒與葉綠體的結(jié)合對(duì)葉綠體活性的影響同樣可以通過(guò)這一方法來(lái)檢測(cè)。

2.2 納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的影響

表1中為這5種不同濃度的納米顆粒在600 nm處光吸收值數(shù)據(jù)，其相對(duì)變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。經(jīng)分析對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，不同種類的納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的影響程度不一樣。ZnO及CdS對(duì)其有明顯的抑制效應(yīng)，并且隨著納米顆粒濃度的增加影響抑制效應(yīng)越明顯，ZnO濃度為400 μg/mL時(shí)其相對(duì)光合活性約為0.5；CdS在濃度為400 μg/mL時(shí)其相對(duì)活性降低為0.6。這說(shuō)明較高濃度的ZnO和CdS對(duì)葉綠體光合效率的抑制效應(yīng)較為顯著。而LiFePO4、TiO2則無(wú)明顯影響。但從圖2中發(fā)現(xiàn)γ-Fe2O3的曲線是先增加再降低，故而推測(cè)，在低濃度條件下，γ-Fe2O3對(duì)葉綠體活性有一定的促進(jìn)作用，但隨著濃度的增加，其抑制效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)。

表1 納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的影響

2.3 葉綠體熒光參數(shù)的變化

在葉綠體中，內(nèi)源性自發(fā)熒光產(chǎn)生于多種生物分子，其中包括葉綠素，胡蘿卜素和葉黃素等。但葉綠素是葉綠體自發(fā)熒光的主要貢獻(xiàn)者，在可見(jiàn)光光譜中，能被波長(zhǎng)在420～460 nm范圍內(nèi)的光激發(fā)產(chǎn)生波長(zhǎng)大于600 nm藍(lán)色區(qū)域的熒光[20]。

圖2 葉綠體相對(duì)光合活性變化趨勢(shì)

圖3 葉綠體熒光效應(yīng)

圖3為葉綠體與納米顆?；旌虾蟮臒晒夤庾V圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，納米顆粒的存在對(duì)其熒光效應(yīng)產(chǎn)生影響。圖中直觀顯示ZnO、γ-Fe2O3和LiFePO4依次削弱了葉綠體的熒光效應(yīng)，而TiO2和CdS則依次增強(qiáng)了熒光效應(yīng)。深入分析了解到，CdS、ZnO及TiO2都是光催化的常見(jiàn)材料，在光激發(fā)下很容易發(fā)生電子躍遷產(chǎn)生熒光淬滅效應(yīng)。其激發(fā)波長(zhǎng)依次為370 nm、300 nm和274 nm，熒光淬滅效應(yīng)逐漸減弱，但實(shí)際測(cè)得的葉綠體熒光效應(yīng)并不是這一規(guī)律。同時(shí)了解到CdS和ZnO對(duì)植物有一定的毒副作用，而TiO2則沒(méi)有。此外，由于Fe3+也可以作為Hill反應(yīng)的電子受體[15]，LiFePO4也是電子的良導(dǎo)體。因此可以推測(cè)，這5種金屬氧化物納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的效應(yīng)并不是影響葉綠素分子經(jīng)光照后產(chǎn)生電子的過(guò)程，而是影響電子傳遞過(guò)程，從而得出了γ-Fe2O3增強(qiáng)了葉綠體的光合活性這一結(jié)果。

2.4 葉綠體FESEM及熒光顯微鏡的觀察

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅說(shuō)明樣品中存在納米顆粒，其對(duì)葉綠體的活性的影響是由于納米顆粒與葉綠體結(jié)合還是僅在溶液中產(chǎn)生影響，并不是很清楚。

葉綠體被綠光激發(fā)后，發(fā)出紅光，而未被熒光標(biāo)記的納米顆粒不存在熒光效應(yīng)。采用FESEM、熒光顯微鏡觀察其結(jié)合結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。圖4A、圖5A和5A′分別為對(duì)照組，比較后發(fā)現(xiàn)：葉綠體FESEM圖中明顯有視野較亮、顆粒狀的物質(zhì)吸附在膜表面。每種納米顆粒都可以觀察到這種現(xiàn)象；同樣的，葉綠體熒光顯微鏡圖中也很明顯的有吸附在葉綠體膜表面且不能發(fā)出熒光的顆粒狀物質(zhì)存在。這些顯微鏡下可見(jiàn)的顆粒狀物質(zhì)是金屬氧化物納米顆粒在葉綠體的影響下，不可逆地聚集在膜表面[13]形成的。這說(shuō)明，葉綠體膜表面的確有金屬納米顆粒吸附，并可通過(guò)對(duì)照，找出對(duì)應(yīng)的納米顆粒聚集的位點(diǎn)。這樣就可推斷，納米顆粒吸附并聚集在葉綠體表面并對(duì)葉綠體光合活性產(chǎn)生影響。

圖4 葉綠體SEM圖

A—葉綠體的掃描電鏡圖；B、C、D、E和F分別是葉綠體與γ-Fe2O3、CdS、ZnO、LiFePO4、TiO2納米顆粒結(jié)合之后的掃描電鏡圖。圖中白色箭頭顯示葉綠體上吸附的納米顆粒。

圖5 葉綠體熒光顯微鏡圖

A和A′分別是葉綠體顯微鏡圖及所對(duì)應(yīng)熒光顯微鏡圖；B、C、D、E和F分別是葉綠體與γ-Fe2O3、CdS、ZnO、LiFePO4、TiO2納米顆粒結(jié)合之后的顯微鏡圖，而B(niǎo)′、C′、D′、E′和F′則是與之相對(duì)應(yīng)的熒光顯微鏡圖。圖中箭頭所指的是納米顆粒所在的位置。

3 結(jié)論與展望

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米農(nóng)藥、植物納米仿生等領(lǐng)域是研究的熱點(diǎn)。這也是納米技術(shù)在植物上的主要研究方向。但納米顆粒對(duì)植物生理的影響方式及主要作用部位并不是了解得很清楚。本研究選取具有代表性的5種金屬氧化物納米顆粒與植物光合作用的主要場(chǎng)所——葉綠體相互作用，簡(jiǎn)單、直觀研究納米顆粒對(duì)細(xì)胞器的影響。

葉綠體SEM圖及葉綠體熒光顯微鏡圖表明納米顆粒是吸附并聚集在葉綠體表面的，說(shuō)明了納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的影響是通過(guò)相互接觸完成的。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)葉綠體光合活性及熒光效應(yīng)的變化來(lái)評(píng)估其影響。葉綠體光合活性的變化趨勢(shì)顯示，LiFePO4、TiO2無(wú)明顯影響，ZnO及CdS對(duì)其有明顯的抑制效應(yīng)，并且隨著納米顆粒濃度的增加影響結(jié)果越顯著。而γ-Fe2O3在低濃度條件下稍有促進(jìn)作用，但隨著濃度的增加逐漸顯現(xiàn)為抑制效應(yīng)。葉綠體熒光效應(yīng)說(shuō)明這5種納米顆粒均在不同程度上影響了葉綠體的熒光效應(yīng)，并解釋了金屬氧化物納米顆粒對(duì)葉綠體光合活性的效應(yīng)并不是影響葉綠素分子經(jīng)光照后產(chǎn)生電子的過(guò)程，而是影響電子傳遞過(guò)程。

由此可得出結(jié)論，金屬氧化物納米顆粒會(huì)對(duì)植物光合作用產(chǎn)生影響，如ZnO及CdS對(duì)葉綠體具有明顯的毒副作用，一定濃度的γ-Fe2O3納米顆?？梢蕴岣吖夂献饔眯?。這為納米材料在植物領(lǐng)域，包括納米化肥，納米仿生、可再生性高效生化探測(cè)器的發(fā)展提供了參考，同時(shí)也為評(píng)估納米材料對(duì)環(huán)境的潛在影響提供了理論基礎(chǔ)。

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Effect of nanoparticles on plant photosynthesis mechanism

LI Wei1, 2, HUANG Jin1, LI Qi-chang1, SU Bao-lian2, XIE Hao1

(1. School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences; 2. Laboratory of Living Materials at State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing,Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China)

To investigate the effect of nanoparticles (NPs) on plant photosynthesis, a simple and efficient approach was adopted. Five typical representative mental oxide NPs were chosen to interacted with the chloroplast, the reaction center of photosynthesis of plant. The variation of photosynthetic activity and fluorescence effect were measured. Scanning electron microscopy (SEM) and fluorescent microscopy showed that the impact of NPs on the photosynthetic activity of chloroplast was achieved by contacting with each other. The results indicated that ZnO and CdS NPs had obvious inhibiting effect, and with the increase of concentration the inhibition was more significantly; γ-Fe2O3NPs can be used as electron acceptor, had some promoting effect at low concentration, but with the increase of the concentration the inhibition effect appeared gradually. Suggesting the impact mechanism of NPs was affecting the process of the electron transfer. This work provides a promising approach for the development of the field of NPs in plants, including nano-fertilizer, nanobionics and a renewable, high-efficiency biochemical detectors. Meanwhile, it provides a theoretical basis for evaluating the potential effects of NPs on environment.

nanoparticles； chloroplast； photosynthetic activity； photosynthesis

2015-01-13；

2015-02-13

李 威，碩士研究生，主要從事人工光合作用系統(tǒng)方面的研究，E-mail：whutlxylw@126.com；

謝 浩，博士，教授，主要從事蛋白質(zhì)與生物礦化方面的研究，Email：h.xie@whut.edu.cn。

Q945.11

A

2095-1736(2015)05-0063-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.063